Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Израильского научного фонда (персональный грант MSC) и совместной программой между Израильским научным фондом и Национальным фондом естественных наук Китая.

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Еврейском университете в Иерусалиме.
1. Приготовление реагентов и буферов
<ol><li>Разогрейте водяную баню до 37 °C.</li>
	<li>Приготовьте все растворы, указанные в таблице 1.</li>
</ol>2. Изоляция мезенхимы кишечника
<ol><li>Усыпьте мышь ингаляцией CO2 сразу после вывиха шейки матки.</li>
	<li>Поместите мышь в положение лежа на спине и опрыскайте живот 70% EtOH. Поднимите кожу живота и разрежьте продольно вдоль средней линии, чтобы обнажить брюшную полость (см. рис. 1 , I, II).</li>
	<li>Найдите желудок, отрезанный от пищевода, и медленно вытащите кишечник из брюшной полости. Очистите лишний жир и соединительную ткань с помощью щипцов. Иссекают тонкую кишку от двенадцатиперстной кишки примерно на 0,5 см от слепой кишки (рис. 1 , III, IV).</li>
	<li>Промыть кишечник в чашке Петри, содержащей холодный стерильный PBS. С помощью ножниц с шариковым наконечником откройте кишечную трубку в продольном направлении и промойте кал (рис. 1 V). Переложите кишечник в новую посуду, содержащую свежий холодный PBS, и снова промойте.</li>
	<li>Разрежьте тонкую кишку на сегменты длиной 1 см и переложите в коническую трубку объемом 15 мл, заполненную 8 мл PBS. Встряхивайте тюбик вручную со скоростью один или два цикла/с в течение 1 мин.</li>
	<li>Перенесите сегменты с помощью щипцов в коническую пробирку объемом 50 мл, заполненную 20 мл свежеприготовленного раствора А (см. Таблицу 1). Поместите пробирки в инкубатор орбитального шейкера при температуре 37 °C на 20 минут. После инкубации энергично встряхните трубку вручную в течение четырех или пяти циклов / с в течение 1 минуты, чтобы диссоциировать эпителий.</li>
	<li>Повторите шаг 2.6 один раз.</li>
	<li>Перенесите сегменты в новую пробирку объемом 50 мл, заполненную 10 мл стерильного PBS, и инвертируйте пробирку со скоростью один или два цикла/с в течение 1 мин.</li>
	<li>Перенесите сегменты в новую пробирку объемом 15 мл, заполненную 10 мл стерильного PBS, и осторожно наклоняйте вверх и вниз с помощью одного или двух циклов / с в течение 2 минут.</li>
	<li>Под шкафом биобезопасности используйте щипцы, чтобы поместить сегменты на стерильную лабораторную салфетку, чтобы высушить их. После высыхания разрежьте сегменты на кусочки по 0,5 см.</li>
	<li>Перенесите небольшие сегменты с помощью щипцов в 6-луночную пластину, заполненную 4 мл предварительно подогретого раствора для разложения на лунку. Выдерживать при 37 °C в течение 50 мин. Аккуратно встряхивайте тарелку вручную каждые 20 минут.</li>
	<li>Перенесите сегменты с помощью пипетки Пастера в коническую пробирку объемом 15 мл, заполненную 4 мл ДМЭМ. Встряхните пробирку вручную со скоростью четыре или пять циклов / с в течение 1 минуты, чтобы получить одноклеточную суспензию.</li>
	<li>Отфильтруйте суспензию через сетчатый фильтр 100 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Центрифугируют фильтрат при 700 × г в течение 5 мин при 4 °C.</li>
	<li>Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью аспирации и ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл 2% FBS / PBS. Центрифугу суспензию при 700 × г в течение 5 мин при 4 °С.</li>
	<li>Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью аспирации, ресуспендируйте клеточную гранулу с 12 мл питательной среды и засейте по 1 мл в лунку на две 6-луночные пластины. На следующий день промойте и аспирируйте все отмирающие клетки и замените отработанную среду свежей средой. ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального содержания культуры рекомендуется менять среду каждые 2 дня. В зависимости от штамма мыши, генетического фона и возраста, требуется от 4 дней до 2 недель, чтобы мезенхима была готова к экспериментам по совместному культивированию. Для дальнейших экспериментов по совместному культурированию мезенхима должна достичь слияния, демонстрируя плоскую и полностью растянутую клеточную морфологию, как показано на рисунке 2. Как правило, клетки с круглой морфологией нежизнеспособны или функциональны.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> Рисунок 1: Вскрытие мыши . (I) Поместите мышь в положение лежа на спине и опрыскайте на живот 70% EtOH. Поднимите кожу живота. (II) Открыть брюшную полость продольно по средней линии. (III) Осторожно вытягивая желудок, перережьте пищевод. (IV) Зажмите желудок и медленно вытащите кишечник. (V) Вставьте кончик ножниц с шариковым наконечником в просвет и откройте кишечную трубку в продольном направлении. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
3. Ресуспендирование мезенхимы для пассажа или совместной культуры
<ol><li>Ресуспендировать мезенхиму 2 мл 0,25% трипсина-0,5 мМ ЭДТА / лунка в 6-луночной пластине. Выдерживать 5 мин при 37 °C. После инкубации, если несколько клеток еще не начали отделяться от чашки, инкубируйте еще 2 минуты.</li>
	<li>С помощью клеточного скребка аккуратно соскребите поверхность лунки. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл DMEM-F12/well и аккуратно пипеткой нанесите суспензию вверх и вниз. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не переполнять трубку более чем на 50% объема трубки. Поэтому рекомендуется использовать коническую трубку объемом 15 мл, заполненную 8 мл суспензии на каждые две лунки.</li>
	<li>Посчитайте ячейки. ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью сливающаяся скважина дает от 2 × 10 6 ячеек до 2,5 × 106 ячеек.</li>
	<li>Разбавьте клеточную суспензию до достижения плотности посева 3-5 ×10,5 клеток/мл. Центрифугу в течение 5 мин при 500 × г при 4 °C и удалить надосадочную жидкость путем тщательной аспирации. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить как можно больше жидкости.</li>
	<li>Ресуспендируйте клеточную гранулу в предварительно разогретой питательной среде и пластине.</li>
</ol>4. Проточный цитометрический анализ для очистки телоцитов
<ol><li>Получают гранулу мезенхимальных клеток (шаг 2.14). Ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл буфера FACS и фильтруют через сетчатый фильтр 40 мкм.</li>
	<li>Инкубируют клеточную суспензию с аллофикоцианиновыми (APC)-конъюгированными антителами CD326 (1:100), CD45 (1:400) и CD31 (1:250) в 400 мкл буфера FACS в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы исключить эпителиальные, иммунные и эндотелиальные клетки соответственно из сорта.</li>
	<li>Промойте клетки, добавив 1 мл буфера FACS, и отжимайте при 700 × г в течение 5 мин при 4 ° C. Ресуспендировать в 400 мкл буфера FACS и добавить 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 5 мг/мл, 1:1,000) для анализа проточной цитометрии. Затворите одиночные ячейки в соответствии с высотой SSC по площади SSC. Затворите живые клетки DAPI- и выключите CD45+/CD31+/CD326+, чтобы отсортировать телоциты GFP+, как показано на рисунке 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity:+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+(ICC),+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+(ICLC)+to+TELOCYTES.">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li><li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+endocardium:+electron+microscope+evidence.">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li><li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+skin&#8212;are+they+involved+in+skin+regeneration.">Telocytes in human skin&#8212;are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li><li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+pleura:+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy.">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li><li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Здесь мы разработали протокол для выделения мезенхимы из тонкой кишки мыши с использованием мышиной модели FOXL1-Cre: Rosa26-mMG, которая позволяет исследователям отличать телоциты от других мезенхимальных клеток. В этом протоколе необходимо выполнить несколько важных шагов. Во-первых, важно энергично встряхивать трубку в течение четырех или пяти циклов / с, чтобы выбросить большинство эпителиальных клеток во время выделения мезенхимы. Время инкубации ферментативного пищеварения должно быть оптимизировано в зависимости от эффективности пищеварения. Во время инкубации пластины следует осторожно встряхивать горизонтально в течение нескольких секунд каждые 20 минут. Как только ткань становится нитевидной, инкубацию необходимо остановить, перейдя к этапу протокола 2.12. Воздействие на ткань в течение длительного времени переваривания может привести к низкой жизнеспособности и выходу клеток. После ферментативного сбраживания трубку необходимо механически встряхнуть, чтобы выпустить больше отдельных клеток в суспензию; В идеале раствор должен выглядеть мутным, и не должно быть видно фрагментов тканей. Если это не так, продлите ферментативное переваривание до 60 минут.
Поддержание стерильных условий и предотвращение потенциального бактериального загрязнения является одним из важнейших шагов при работе с первичной культурой тканей. Необходимо использовать стерильные инструменты для рассечения, реагенты и буферы; Перчатки необходимо менять, а рабочую зону чистить, когда делается работа с животными. После того, как клеточная суспензия получена, работа должна проводиться под ламинарным биологическим колпаком. После нанесения покрытия клетки следует инкубировать в течение ночи без каких-либо нарушений, так как это может повлиять на адгезию. Кроме того, важно заменить питательную среду через день после посева, так как неадгезивные клетки могут повлиять на жизнеспособность культуры.
Поверхностные маркеры, используемые в этом протоколе, сильно реагировали со своими эпитопами; однако возможно, что ферментативное расщепление может повлиять на реакционную способность связывания и, следовательно, на результаты анализа FACS. Еще одним ограничением этого протокола является недопредставленность мышечного слоя. Для повышения эффективности изоляции клеток мышечного слоя мы рекомендуем механическое отделение мышцы от слоев слизистой оболочки и раздельное ферментативное переваривание для каждого из слоев. Для диссоциации эпителия от стромы можно использовать либо механическое разделение, либо хелатирующие агенты (ЭДТА или ДТТ); Однако ферментативное переваривание для получения отдельных клеток было оптимизировано в этом протоколе.
Выделение мезенхимы кишечника было описано ранее8; соскабливание ворсинок покровным стеклом приведет к потере некоторых мезенхим рядом с ворсинками, особенно мезенхимальных клеток кончика ворсинок, таких как телоциты13 кончика ворсинок Lgr5+. В этом протоколе мы используем коллагеназу VIII типа вместо диспазы II и трипсина в сочетании с ДНКазой I, поскольку коллагеназа более эффективно высвобождает мезенхимальные клетки из матрикса. Несмотря на то, что это увеличивает время обработки (>90 мин против 35 мин), эти два протокола дали одинаковые показатели жизнеспособности клеток; Текущий протокол улучшил выход мезенхимальных клеток в целом и, в частности, фракции телоцитов. Текущий протокол дал приблизительно 10% телоцитов GFP+, что подтверждается как визуализацией, так и анализом FACS, в то время как более ранний протокол дал 2% телоцитов GFP+. Основные различия между нынешним протоколом и двумя эталонными протоколами перечислены в дополнительной таблице S1.
Идентификация клеток FOXL1+GFP+ как субэпителиальных телоцитов основана на исследованиях in vivo . Необходимость разработки и модификации доступных протоколов выделения мезенхим для получения более высоких выходов телоцитов, а также знания о том, как этого достичь, были основаны на нашем понимании структуры и функции телоцитов FOXL1+ in vivo, как больших клеток с длинными клеточными выступами, тесно прикрепленными к эпителиальным клеткам.
Интересно, что телоциты ex vivo GFP+ демонстрируют клеточные характеристики, сходные с их особенностями in vivo в кишечнике, и поэтому предполагается, что они служат идеальной поддержкой для роста органоидов. Хотя в этом протоколе в основном обсуждается выделение телоцитов из тонкой кишки, аналогичный протокол с незначительной модификацией может быть использован и легко применен для мезенхимальных клеток толстой кишки, таких как недавно описанные MAP3K2-регулируемые кишечные стромальные клетки (MRISC)12.
После того, как мезенхимальные клетки растянутся и достигнут слияния, их можно использовать для нескольких дополнительных применений, таких как 3D-совместное культивирование с органоидами мышиного или человеческого происхождения с использованием матригеля без фактора роста. Мезенхима обычно образует сеть, полностью поддерживающую образование и рост органоидов без добавления экзогенного фактора роста. Строма кишечника имеет внутренние 3D-функции, которые могут обеспечить эпителию механическую поддержку14. Таким образом, этот протокол также может быть использован для выделения мезенхимы, которая будет интегрирована в 3D-биопечатный каркас и использована для дальнейших экспериментов с ксенотрансплантатом.

Как тонкая кишка, так и толстая кишка являются высокорегенеративными тканями из-за присутствия стволовых клеток, которые размножаются и способствуют регенерации1. Мезенхима, окружающая эпителий, обеспечивает структурную и функциональную поддержку, секретируя белки внеклеточного матрикса и сигнальные молекулы2, которые модулируют реакцию эпителиальных клеток. Телоциты представляют собой крупные мезенхимальные клетки, в основном описанные до сих пор электронной микроскопией как клетки с длинными цитоплазматическими процессами, называемые телоподами, которые перекрываются, создавая лабиринтную сеть 3,4,5,6,7. В последнее время кишечные телоциты, экспрессирующие фактор транскрипции FOXL1, стали важным компонентом ниши стволовых клеток, обеспечивающим белки Wnt, которые имеют решающее значение для функции стволовых клеток и клеток-предшественников. Кишечные телоциты экспрессируют высокие уровни ключевых белков сигнального пути, таких как Wnt, Bmp, Tgfb и Shh, а также многих факторов роста8.
Учитывая, что телоциты являются важнейшим нишевым компонентом стволовых клеток in vivo, разработка протоколов для их выделения и культивирования ex vivo позволит использовать их в качестве источника сигнальных молекул и факторов роста для поддержки роста и дифференцировки ex vivo. Используя хорошо зарекомендовавшие себя протоколы, эпителиальные крипты толстой кишки или кишечника могут быть выделены и сформировать 3D-структуры, известные как органоиды 9,10,11. Трехмерные органоиды представляют собой мощный инструмент для исследования как физиологии, так и патологии кишечного эпителия ex vivo. В системе ex vivo органоиды полагаются на экзогенное добавление факторов для выживания и роста10. Изолированная мезенхима может быть культивирована как с органоидами мыши, так и с человеком и использована в качестве источника факторов роста вместо экзогенных добавок, чтобы лучше отразить ситуацию в исходной ткани. Изучение телоцитов ex vivo имеет множество преимуществ при более подробном исследовании нормального или патологического клеточного поведения, механизмов тканевого гомеостаза и межклеточных взаимодействий.
Хотя протоколы, описывающие, как выделить мезенхиму из кишечника мыши, доступны, неясно, приводят ли эти процедуры к эффективному выделению телоцитов. Успешное выделение телоцитов требует специальных корректировок протокола, которые позволили бы диссоциировать сильный межклеточный контакт между телоцитами и соседними клетками, не влияя на их жизнеспособность. Чтобы преодолеть эти ограничения, в этой статье представлен модифицированный протокол, который последовательно дает высокожизнеспособную одноклеточную суспензию, содержащую относительно большое количество телоцитов с достаточно консервативными антигенными и функциональными свойствами. Эти телоциты могут быть использованы для нескольких применений, включая совместное культивирование с органоидами мышиного или человеческого происхождения, для поддержки роста без добавок фактора роста. Это, в свою очередь, лучше отражает ситуацию в исходной ткани.
Мы использовали мышь модели8 FOXL1-Cre: Rosa-mTmG, в которой телоциты помечены мембраносвязанной версией зеленого флуоресцентного белка (GFP) зеленого цвета, что позволяет исследователю полностью отслеживать телоциты; все остальные мезенхимальные клетки помечены мембраносвязанным tdTomato красного цвета. Текущий протокол был изменен по сравнению с протоколом, изолирующим кишечную мезенхиму12 , для улучшения выхода и жизнеспособности телоцитов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

Тонкая кишка мыши, или мезенхима толстой кишки, очень гетерогенна, содержит различные типы клеток, включая эндотелий крови и лимфы, нервы, фибробласты, миофибробласты, гладкомышечные клетки, иммунные клетки и недавно идентифицированный тип клеток, телоциты. Телоциты представляют собой уникальные мезенхимальные клетки с длинными цитоплазматическими отростками, достигающие расстояния от десятков до сотен микрон от тела клетки. Телоциты недавно стали важным компонентом ниши кишечных стволовых клеток, обеспечивая белки Wnt, которые необходимы для пролиферации стволовых клеток и клеток-предшественников.
Хотя протоколы о том, как выделить мезенхиму из кишечника мыши, доступны, неясно, позволяют ли эти процедуры эффективно выделять телоциты. Эффективное выделение телоцитов требует специальных корректировок протокола, которые позволили бы диссоциировать сильный межклеточный контакт между телоцитами и соседними клетками, не влияя на их жизнеспособность. Здесь доступные протоколы выделения мезенхимы кишечника были скорректированы для поддержки успешного выделения и культивирования мезенхимы, содержащей относительно высокий выход жизнеспособных одноклеточных телоцитов.
Полученная одноклеточная суспензия может быть проанализирована несколькими методами, такими как иммуноокрашивание, сортировка клеток, визуализация и эксперименты с мРНК. Этот протокол дает мезенхиму с достаточно консервативными антигенными и функциональными свойствами телоцитов и может быть использован для нескольких применений. Например, они могут быть использованы для совместного культивирования с органоидами мышиного или человеческого происхождения для поддержки роста органоидов без добавления фактора роста, чтобы лучше отражать ситуацию в исходной ткани.

Приведенный выше протокол выделения мезенхимы кишечника был изменен по сравнению с протоколами, описанными как в Wu et al.12, так и в Shoshkes-Carmel et al.8. Протокол, описанный в Wu et al., предназначен для толстой кишки, а протокол, разработанный Shoshkes-Carmel et al., предназначен для тонкой кишки, таким образом, условия пищеварения различаются по комбинации ферментов, концентрации работы и времени инкубации между этими двумя протоколами. Здесь описанный протокол был успешно использован для выделения и культивирования мезенхимальных клеток кишечника, включая телоциты. Вкратце, мы рассекли тонкую кишку от двенадцатиперстной кишки до подвздошной кишки с помощью мышиной модели8 FOXL1-Cre: Rosa-mTmG, в которой телоциты были помечены мембраной-GFP (зеленый), в то время как другие мезенхимальные клетки были помечены мембраной-tdTomato (красный). Мы диссоциировали ткань с помощью переваривающих ферментов и засеяли мезенхиму в 6-луночную пластину. После диссоциации телоциты теряют свои клеточные характеристики, демонстрируя круглую клеточную морфологию (рис. 2A), что отражается в недостаточном количественном определении клеток GFP+ на 1-й день по сравнению с последующими днями (рис. 2F). Через несколько дней телоциты демонстрируют небольшую растянутую клеточную морфологию с короткими клеточными отростками (рис. 2B, C). Однако через 7-10 дней после посева телоциты восстанавливают свои клеточные характеристики, демонстрируя большую растянутую клеточную морфологию с длинными цитоплазматическими процессами (рис. 2D, E), и готовы к использованию в совместной культуре с органоидами и поддерживают их рост.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> Рисунок 2: Культивируемая мезенхима, выделенная из кишечника мыши FOXL1Cre: Rosa-mTmG. Телоциты FOXL1+ помечены GFP, в то время как другие мезенхимальные клетки являются tdTomato+. (А-Е) Репрезентативные изображения культивируемой мезенхимы, выделенные с использованием текущего протокола, покрытые 6-луночной пластиной и полученные после 1 (A), 4 (B, C) и 7 (D, E) дней культивирования. Масштабные линейки = 100 мкм. (F) Количественная оценка соотношения клеток GFP/tdТоматов на поле зрения (в процентах) в 1, 4 и 7 дни культивирования. Сокращения: FOXL1 = белок L1 вилочной коробки; GFP = зеленый флуоресцентный белок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Чтобы оценить этот протокол выделения и выявить клеточный состав, мы проанализировали полученную клеточную суспензию методом проточной цитометрии (рис. 3). В целом, 69% выделенных клеток были жизнеспособными на основе окрашивания DAPI (рис. 3 III); из живых клеток 60,9% представляли эпителиальное загрязнение и иммунные и эндотелиальные клетки (CD326+, CD45+ и CD31+; Рисунок 3 IV). Фракция телоцитов (GFP+) рассеивалась выше 100k и 70k FSC и SSC соответственно (рис. 3 VI) и составляла почти 10% от закрытой мезенхимы (живой CD45-, CD326-, CD31-) (рис. 3 V).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> Рисунок 3: Стратегия стробирования проточной цитометрии для сортировки телоцитов из изолированной мезенхимы кишечника взрослой мыши. (I) События бокового рассеяния низкого уровня были исключены. (II) Одиночные ячейки были закрыты в соответствии с высотой SSC по площади SSC. (III) События DAPI+ были закрыты, чтобы исключить мертвые клетки из рода. (IV) События DAPI-CD45+/CD326+/CD31+ были закрыты для исключения иммунных, эпителиальных и эндотелиальных клеток соответственно. (V) Телоциты GFP+ составляли 10,3% DAPI-CD45-/CD326-/CD31-клеток. (VI) Обратный анализ выявил координаты телоцитов GFP+ на графике FSC-A/SSC-A. Сокращения: SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; SSC-H = высота пика бокового рассеяния; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; GFP = зеленый флуоресцентный белок; APC = аллофикоцианин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Параллельно мы также выделили мезенхиму из кишечника мыши C57Bl6 дикого типа (WT), в котором фракция телоцитов оценивалась с использованием комбинации поверхностных маркеров, ранее проанализированных на мезенхиме, выделенной из мышиной модели FOXL1Cre: Rosa-mTmG, в которой фракция телоцитов была мечена GFP. Мы обнаружили, что подмножество телоцитов может быть определено положительным окрашиванием CD201 и подопланина (GP38) (рис. 4). Более того, использование этих маркеров при иммуноокрашивании через 1 день после выделения и культивирования подтвердило, что, хотя клетки еще не проявили своих клеточных характеристик, они получили экспрессию этих молекулярных маркеров, демонстрируя окрашивание в 70%-80% телоцитов GFP+ (рис. 5).
Фракция телоцитов, определяемая поверхностными маркерами, не идентична фракции, полученной с помощью репортерной мыши, управляемой FOXL1; Телоцит очень гетероген и содержит несколько подмножеств. Для определения телоцитов необходимо комбинировать поверхностный маркер с маркировкой FOXL1. В тонком кишечнике мыши FOXL1Cre: Rosa-mTmG 60-70% клеток GFP+ являются положительными на CD201, а 65%-80% - положительными на GP38. При использовании поверхностных маркеров важно отметить, что неправильное хранение и повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания антител снижают эффективность связывания. Кроме того, ферментативное пищеварение может нарушить экспрессию поверхностных маркеров. Мы наблюдали, что экспрессия CD138, трансмембранного протеогликана, экспрессируемого на мезенхимальных клетках, была нарушена и значительно снижена при диссоциации.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> Рисунок 4: FACS-анализ одноклеточной мезенхимной суспензии, выделенной из тонкой кишки мыши FOXL1Cre: Rosa-mTmG, с использованием текущего протокола. Анализ FACS на (I-II) одиночных клетках, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+ клетках, показывающий, что (VII) 65,3% GFP+ и 31,2% Tomato+ положительны на GP38, тогда как (VIII) 60,5% GFP+ и 22,6% Tomato+ положительны на CD201. Сокращения: SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; SSC-H = высота пика бокового рассеяния; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; GFP = зеленый флуоресцентный белок; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> Рисунок 5: Культивируемая мезенхима первого дня, зафиксированная и окрашенная на мезенхимальные маркеры. (A-D) Репрезентативные изображения культивируемой мезенхимы, окрашенной для GP38. (Ф-И) Репрезентативные изображения культивируемой мезенхимы, окрашенной на CD201. Масштабные линейки = 100 мкм. (E) Количественное определение двойного положительного результата Tomato+GP38+ и Tomato+CD201+ от общего количества Tomato+. (J) Количественная оценка двойного положительного результата GFP+ GP38+ и GFP+ CD201+ от общего GFP+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Решение А:</td>
			<td colspan="4">HBSS дополнен 2% FBS, 1 мМ DL-дитиотреитолом (DTT), 2 мМ ЭДТА (pH 8,0).</td>
		</tr><tr><td>Дополненный средний 1640 (CM1640):</td>
			<td colspan="4">Среда RPMI 1640 дополнена 10% FBS, Pen / Strep (100 единиц пенициллина / мл, 100 мкг стрептомицина / мл).</td>
		</tr><tr><td>Раствор для пищеварения:</td>
			<td colspan="4">100 ЕД/мл коллагеназы VIII типа, 75 мг/мл ДНКазы I в 4 мл предварительно подогретого CM1640. Примечание: Добавьте коллагеназу и ДНКазу I непосредственно перед началом процедуры пищеварения.</td>
		</tr><tr><td>Питательные среды:</td>
			<td colspan="4">Среда DMEM-F12 дополнена 10 мкг/мл гентамицина, 10 мМ HEPES, глутамином, ручкой/стрептококком (100 единиц пенициллина/мл, 100 мкг стрептомицина/мл).</td>
		</tr><tr><td>Буфер СУИМ:</td>
			<td colspan="4">PBS дополнен 5% FBS и 1 мМ ЭДТА.</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Состав всех растворов, использованных в протоколе. 
Дополнительная таблица S1: Основные различия между текущим протоколом и двумя эталонными протоколами перечислены здесь. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes at JoVE.com

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Здесь мы представляем протокол выделения мезенхимы кишечника мыши, включая телоциты. Их можно использовать для нескольких применений, таких как совместное культивирование с органоидами мышиного или человеческого происхождения, для поддержки роста и лучшего отражения ситуации в исходной ткани.

Выделение мезенхимы кишечника мыши, приводящее к высокому выходу телоцитов

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Наш протокол выделения мезенхимы кишечника приводит к высокому выходу телоцитов. Этот метод предлагает начальную платформу для изучения межклеточного взаимодействия с участием телоцитов в гомеостазе и заболевании. Телоциты являются уникальными клетками, чувствительными к доступным протоколам диссоциации тканей.Поэтому основным преимуществом данной методики является выделение мезенхимы, включающей обогащенные жизнеспособные телоциты. Мезенхима, включая телоциты, может служить источником сигнальных молекул и факторов роста, необходимых для организованного роста ex vivo. Для начала промойте кишечник, отделенный от усыпленной мыши, в чашке Петри, содержащей холодный стерильный PBS.Поместите кишечник в чашку Петри. И с помощью ножниц с шариковым наконечником откройте кишечную трубку в продольном направлении и промойте кал. Переложите кишечник в новую посуду, содержащую свежий холодный PBS.Промыв кишечник еще раз, разрежьте тонкую кишку на сегменты длиной в один сантиметр и перенесите их в коническую трубку объемом 15 миллилитров, заполненную восемью миллилитрами PBS. Встряхивайте трубку вручную со скоростью один или два цикла в секунду в течение одной минуты. Вылейте раствор в чашку Петри.И с помощью щипцов перенесите сегмент в 50-миллилитровую коническую трубку, заполненную 20 миллилитрами раствора А. Поместите пробирки в орбитальный шейкер-инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут. После инкубации энергично встряхните трубку вручную со скоростью четыре или пять циклов в секунду в течение одной минуты, чтобы диссоциировать эпителий. Повторите этот шаг еще раз.После резки и промывки фрагментов, как показано ранее, переложите их в новую 50-миллилитровую пробирку, заполненную 10 миллилитрами стерильного PBS, и переверните пробирку с одним или двумя циклами в секунду в течение одной минуты. Налейте раствор в чашку Петри. Перенесите сегменты в новую 15-миллилитровую пробирку, заполненную 10 миллилитрами стерильного PBS, и осторожно наклоняйте вверх и вниз со скоростью один или два цикла в секунду в течение двух минут.Под шкафом биобезопасности используйте щипцы, чтобы поместить сегменты на стерильную лабораторную салфетку, чтобы высушить их. После высыхания разрежьте сегменты на кусочки. Переложите нарезанные кусочки с помощью щипцов в шестилуночную пластину, заполненную четырьмя миллилитрами предварительно подогретого раствора для разложения на лунку.Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 50 минут и осторожно встряхивайте тарелку вручную каждые 20 минут. Затем переложите кусочки с помощью пипетки Пастера в 15-миллилитровую коническую трубку, заполненную четырьмя миллилитрами DMEM. Встряхните трубку вручную со скоростью четыре или пять циклов в секунду в течение одной минуты, чтобы получить одноклеточную суспензию.Отфильтруйте суспензию через 100-микрометровый сетчатый фильтр в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте фильтрат при 700 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости путем аспирации и ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах 2% FBS / PBS.После центрифугирования суспензии еще раз в 700 г в течение пяти минут выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу клетки в 12 миллилитрах питательной среды. Наконец, засейте клеточную суспензию в шестилуночные пластины. После диссоциации мезенхимы телоциты теряют свои клеточные характеристики, демонстрируя круглую клеточную морфологию, и отражают меньшее количество GFP-положительных клеток в первый день по сравнению со следующими днями.Через несколько дней телоциты демонстрируют маленькую, растянутую клеточную морфологию с короткими клеточными отростками. После семи-10 дней посева телоциты восстанавливают свои клеточные характеристики, демонстрируя крупную, растянутую морфологию клеток с длительными цитоплазматическими процессами. Проточная цитометрия выявляет клеточный состав.В целом, 69% изолированных клеток были жизнеспособными на основе окрашивания DAPI. И из них 60,9% представляли собой эпителиальное загрязнение и иммунные и эндотелиальные клетки. Фракция телоцитов рассеивалась выше 100k и 70k FSC и SSC соответственно и составляла почти 10% закрытой мезенхимы.Анализ FACS показал, что подмножество телоцитов может быть определено путем положительного окрашивания на CD201 и GP38. Иммуноокрашивание однодневной культивируемой мезенхимы с использованием этих маркеров показало экспрессию этих молекулярных маркеров, несмотря на то, что клетки не проявляли своих клеточных характеристик. Эта процедура приводит к жизнеспособной одноклеточной суспензии стромальных клеток, которая может быть использована не только для 2D-культивирования, но и для любого другого применения, такого как 3D-совместное культивирование с органоидами или биопечать.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Функциональная оценка моторики кишечника и воспаление стенки кишечника у грызунов: Анализы в стандартной модели Кишечные Манипуляции

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для исследований; Получение достаточном количестве отобранных образцов Выход

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Мышиный Эндоскопия для<em&gt; В Vivo</em&gt; Мультимодальные изображений канцерогенеза и оценки кишечной заживления ран и воспаления

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Выделение и Удаление мышиной аорты; Универсальный Техника в исследовании сердечно-сосудистых заболеваний

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Мышиной модели кишечная ишемия-реперфузии

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Флуоресценции опосредованной томография для выявления и количественной оценки мышиных кишечного воспаления Макрофаг связанных

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Электрофизиологические оценки мышиных предсердий с высоким разрешением оптических карт

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Стволовых клеток кишечника изоляции и культуры в свинину модели сегментарный малого кишечника ишемии

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Изоляция и очищение моринских кардиологических перицитов

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...