Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Israel Science Foundation (MSC personligt bidrag) och det gemensamma programmet mellan Israel Science Foundation och National Natural Science Foundation of China.

Alla procedurer som beskrivs nedan godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Hebrew University of Jerusalem.
1. Beredning av reagens och buffertar
<ol><li>Förvärm ett vattenbad till 37 °C.</li>
	<li>Förbered alla lösningar i tabell 1.</li>
</ol>2. Isolering av tarmmesenkym
<ol><li>Avliva musen genom CO2-inandning , omedelbart följt av cervikal dislokation.</li>
	<li>Placera musen i ryggläge och spraya buken med 70% EtOH. Lyft bukhuden och skär längsgående längs mittlinjen för att exponera bukhålan (se figur 1 I, II).</li>
	<li>Leta reda på magen, skär från matstrupen och dra långsamt tarmarna ur bukhålan. Rengör överflödigt fett och bindväv med pincett. Punktbeskatta tunntarmen från tolvfingertarmen till cirka 0,5 cm från blindtarmen (figur 1 III, IV).</li>
	<li>Tvätta tarmarna i en petriskål som innehåller kall steril PBS. Öppna tarmröret i längdriktningen med kulsax och tvätta avföringen (figur 1 V). Överför tarmen till en ny maträtt som innehåller färsk kall PBS och tvätta igen.</li>
	<li>Skär tunntarmen i 1 cm långa segment och överför till ett 15 ml koniskt rör fyllt med 8 ml PBS. Skaka tuben manuellt med ett eller två cykler/s i 1 min.</li>
	<li>Överför segmenten med pincett till ett 50 ml koniskt rör fyllt med 20 ml nygjord lösning A (se tabell 1). Placera rören i en orbital shaker-inkubator vid 37 °C i 20 minuter. Efter inkubation, skaka röret kraftigt för hand vid fyra eller fem cykler/s i 1 min för att dissociera epitelet.</li>
	<li>Upprepa steg 2.6 en gång.</li>
	<li>Överför segmenten till ett nytt 50 ml rör fyllt med 10 ml steril PBS och vänd röret med en eller två cykler / s i 1 min.</li>
	<li>Överför segmenten till ett nytt 15 ml rör fyllt med 10 ml steril PBS och luta försiktigt upp och ner vid en eller två cykler / s i 2 minuter.</li>
	<li>Under ett biosäkerhetsskåp, använd pincett för att placera segmenten på en steril laboratorieduk för att torka ut dem. När de har torkat, skär segmenten ytterligare i 0,5 cm bitar.</li>
	<li>Överför de små segmenten med pincett till en 6-brunnsplatta fylld med 4 ml förvärmd matsmältningslösning per brunn. Inkubera vid 37 °C i 50 minuter. Skaka försiktigt plattan för hand var 20:e minut.</li>
	<li>Överför segmenten med en Pasteur-pipett till ett 15 ml koniskt rör fyllt med 4 ml DMEM. Skaka röret manuellt vid fyra eller fem cykler / s i 1 min för att få en encellssuspension.</li>
	<li>Filtrera suspensionen genom en 100 μm sil till ett 50 ml koniskt rör. Centrifugera filtratet vid 700 × g i 5 min vid 4 °C.</li>
	<li>Kassera supernatanten genom aspiration och suspendera cellpelleten i 5 ml 2% FBS / PBS. Centrifugera suspensionen vid 700 × g i 5 min vid 4 °C.</li>
	<li>Kassera supernatanten genom aspiration, suspendera cellpelleten igen med 12 ml odlingsmedium och frö 1 ml per brunn på två 6-brunnsplattor. Följande dag, tvätta och aspirera eventuella döende celler och ersätt det använda mediet med färskt medium. OBS: För optimalt underhåll av kulturen rekommenderas att byta medium var 2: e dag. Beroende på musstam, genetisk bakgrund och ålder behövs 4 dagar till 2 veckor för att mesenkymet ska vara redo för samodlingsexperiment. För ytterligare samodlingsexperiment bör mesenkym nå sammanflöde och visa platt och helt sträckt cellulär morfologi som visas i figur 2. I allmänhet är celler med rund morfologi inte livskraftiga eller funktionella.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> Figur 1: Musdissektion . (I) Placera musen i ryggläge och spraya buken med 70% EtOH. Lyft bukhuden. (II) Öppna bukhålan i längdriktningen längs mittlinjen. (III) Medan du försiktigt drar i magen, skär av matstrupen. (IV) Nyp magen och dra långsamt ut tarmen. (V) Sätt in spetsen på kulsaxen i lumen och öppna tarmröret i längdriktningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
3. Mesenkym resuspension för passaging eller samkultur
<ol><li>Resuspendera mesenkymet med 2 ml 0,25% trypsin-0,5 mM EDTA / brunn i en 6-brunnsplatta. Inkubera i 5 minuter vid 37 °C. Efter inkubation, om flera celler inte redan har börjat lossna från skålen, inkubera i ytterligare 2 minuter.</li>
	<li>Skrapa försiktigt brunnens yta med en cellskrapa. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 2 ml DMEM-F12/brunn och pipettera försiktigt suspensionen upp och ner. OBS: Det är viktigt att inte överfylla röret med mer än 50% av rörets volym. Det rekommenderas därför att använda ett 15 ml koniskt rör fyllt med 8 ml suspension för varannan brunn.</li>
	<li>Räkna cellerna. OBS: En helt sammanflytande brunn ger mellan 2 × 10 6 celler och 2,5 × 106 celler.</li>
	<li>Späd cellsuspensionen för att uppnå en sådddensitet på 3-5 × 105 celler/ml. Centrifugera i 5 minuter vid 500 × g vid 4 °C och kassera supernatanten genom noggrann aspiration. OBS: Det är viktigt att ta bort så mycket vätska som möjligt.</li>
	<li>Resuspendera cellpelleten i förvärmt odlingsmedium och platta.</li>
</ol>4. Flödescytometrianalys för telocytrening
<ol><li>Hämta mesenkymalcellpelleten (steg 2.14). Återsuspendera cellpelleten i 1 ml FACS-buffert och filtrera genom en 40 μm sil.</li>
	<li>Inkubera cellsuspensionen med allophycocyanin (APC)-konjugerade CD326 (1:100), CD45 (1:400) och CD31 (1:250) antikroppar i 400 μL FACS-buffert i 15 minuter vid rumstemperatur för att utesluta epitelial-, immun- respektive endotelceller från sorten.</li>
	<li>Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml FACS-buffert och snurra ner vid 700 × g i 5 minuter vid 4 °C. Resuspendera i 400 μl FACS-buffert och tillsätt 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 5 mg/ml, 1:1 000) för flödescytometrianalyser. Porta de enskilda cellerna enligt SSC-höjden efter SSC-området. Porta DAPI-levande celler och grinda ut CD45 + / CD31 + / CD326 + för att sortera GFP + telocyterna, som visas i figur 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity:+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+(ICC),+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+(ICLC)+to+TELOCYTES.">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li><li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+endocardium:+electron+microscope+evidence.">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li><li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+skin&#8212;are+they+involved+in+skin+regeneration.">Telocytes in human skin&#8212;are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li><li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+pleura:+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy.">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li><li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Här utvecklade vi ett protokoll för att isolera mesenkym från mustunntarmen med hjälp av FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG-musmodellen, vilket gör det möjligt för forskare att skilja telocyter från andra mesenkymala celler. Det finns några kritiska steg att följa i detta protokoll. För det första är det viktigt att skaka röret kraftigt vid fyra eller fem cykler / s, för att kassera majoriteten av epitelceller under mesenkymisolering. Inkubationstiden för enzymatisk nedbrytning måste optimeras baserat på matsmältningseffektivitet. Under inkubationen ska plattorna skakas försiktigt horisontellt i några sekunder var 20: e minut. När vävnaden blir filamentliknande måste inkubationen stoppas genom att gå vidare till protokollsteg 2.12. Att exponera vävnaden för långa matsmältningstider kan resultera i låg cellviabilitet och utbyte. Efter enzymatisk nedbrytning måste röret skakas mekaniskt för att frigöra fler enskilda celler i suspension; Helst bör lösningen se grumlig ut och inga vävnadsfragment ska vara synliga. Om så inte är fallet, förläng den enzymatiska nedbrytningen till 60 minuter.
Att hålla sterila förhållanden och undvika potentiell bakteriell kontaminering är ett av de kritiska stegen när man arbetar med primär vävnadsodling. Sterila dissekeringsverktyg, reagens och buffertar måste användas. Handskar måste bytas och arbetsområdet måste rengöras när arbetet med djur är klart. När cellsuspensionen har erhållits bör arbetet utföras under en laminär biologisk huva. Efter plätering bör cellerna inkuberas över natten utan störningar, eftersom detta kan påverka vidhäftningen. Dessutom är det viktigt att ersätta odlingsmediet en dag efter sådd, eftersom icke-vidhäftande celler kan påverka kulturens livskraft.
Ytmarkörer som används i detta protokoll reagerade starkt med sina epitoper; Det är dock möjligt att enzymatisk nedbrytning kan påverka bindningsreaktiviteten, och därmed FACS-analysresultat. En annan begränsning av detta protokoll är underrepresentationen av muscularisskiktet. För att förbättra effektiviteten av muskelskiktets cellisolering rekommenderar vi mekanisk separation av muskeln från slemhinnorna och separat enzymatisk nedbrytning för vart och ett av skikten. För att dissociera epitelet från stroma kan antingen mekaniska separations- eller kelatbildare (EDTA eller DTT) användas; Emellertid har enzymatisk matsmältning för att erhålla enskilda celler optimerats i detta protokoll.
Isolering av tarmmesenkym har tidigare beskrivits8; Skrapning av villi med ett täckglas skulle orsaka förlust av lite mesenkym tillsammans med villus, särskilt mesenkymala celler med villusspets som Lgr5+ villusspetstelocyter13. I detta protokoll använder vi kollagenas typ VIII istället för dispase II och trypsin i kombination med DNas I, eftersom kollagenas mer effektivt frigör mesenkymala celler från matrisen. Även om det förlänger bearbetningstiden (>90 min vs. 35 min), gav de två protokollen liknande cellviabilitetshastigheter; Det nuvarande protokollet förbättrade utbytet av mesenkymala celler i allmänhet och mer specifikt av telocytfraktionen. Det nuvarande protokollet gav cirka 10% GFP+ telocyter, bekräftat både genom visualisering och genom FACS-analys, medan det tidigare protokollet gav 2% GFP+ telocyter. De största skillnaderna mellan det nuvarande protokollet och de två referensprotokollen anges i tilläggstabell S1.
Identifieringen av FOXL1+GFP+ -celler som subepitelteltelocyter baseras på in vivo-studier . Behovet av att utveckla och modifiera tillgängliga mesenkymisoleringsprotokoll för att producera högre utbyten av telocyter, och kunskapen om hur man uppnår detta baserades på vår förståelse av strukturen och funktionen hos FOXL1 + telocyter in vivo, som stora celler med långa cellulära projektioner nära fästa vid epitelceller.
Intressant nog uppvisar ex vivo GFP+ telocyter cellulära egenskaper som liknar deras egenskaper in vivo i tarmen och föreslås därför fungera som ett idealiskt stöd för organoidtillväxt. Även om detta protokoll huvudsakligen diskuterar telocytisolering från tunntarmen, kan ett liknande protokoll med mindre modifiering användas och enkelt tillämpas för kolonmesenkymala celler, såsom den nyligen beskrivna MAP3K2-reglerade intestinala stromacellen (MRISC)12.
När mesenkymala celler har sträckt sig och nått sammanflöde kan de användas för flera ytterligare applikationer, såsom 3D-samkultur med mus- eller human-härledda organoider, med användning av tillväxtfaktorfri Matrigel. Mesenkymet bildar vanligtvis ett nätverk som fullt ut stöder organoidbildning och tillväxt utan exogent tillväxtfaktortillskott. Tarmstroma har inneboende 3D-funktioner som kan ge epitelet mekaniskt stöd14. Därför kan detta protokoll också användas för att isolera mesenkym som ska integreras i en 3D-biotryckt ställning och användas för ytterligare xenograftexperiment.

Både tunntarmen och tjocktarmen är mycket regenerativa vävnader på grund av närvaron av stamceller, som prolifererar och bränsleregenerering1. Mesenkymet som omger epitelet ger strukturellt och funktionellt stöd genom att utsöndra extracellulära matrisproteiner och signalmolekyler2, som modulerar epitelcellernas respons. Telocyter är stora mesenkymala celler, som hittills huvudsakligen beskrivits med elektronmikroskopi som celler med långa cytoplasmatiska processer som kallas telopoder, som överlappar varandra för att skapa ett labyrintiskt nätverk 3,4,5,6,7. Nyligen har intestinala telocyter som uttrycker transkriptionsfaktorn FOXL1 dykt upp som en viktig stamcellsnischkomponent som tillhandahåller Wnt-proteiner, som är avgörande för stam- och stamcellsfunktion. Intestinala telocyter uttrycker höga nivåer av viktiga signalvägsproteiner såsom Wnt, Bmp, Tgfb och Shh, liksom många tillväxtfaktorer8.
Med tanke på att telocyter är en kritisk stamcellsnischkomponent in vivo, kommer utveckling av protokoll för att isolera och odla dem ex vivo att tillåta deras användning som en källa för signalmolekyler och tillväxtfaktorer, för att stödja tillväxt och differentiering ex vivo. Med hjälp av väletablerade protokoll kan kolon- eller tarmepitelkrypter isoleras och bilda 3D-strukturer som kallas organoider 9,10,11. Tredimensionella organoider representerar ett kraftfullt verktyg för att undersöka både fysiologin och patologin i tarmepitelet ex vivo. I ett ex vivo-system förlitar sig organoider på exogent tillskott av faktorer för överlevnad och tillväxt10. Isolerat mesenkym kan odlas med både mus och humana organoider och användas som en källa till tillväxtfaktorer, istället för exogent tillskott, för att bättre återspegla situationen i den ursprungliga vävnaden. Att studera telocyter ex vivo har många fördelar med att undersöka normala eller patologiska cellulära beteenden, mekanismer för vävnadshomeostas och cell-cellinteraktioner mer detaljerat.
Även om protokoll som beskriver hur man isolerar mesenkym från musttarmen finns tillgängliga, är det inte klart om dessa procedurer resulterar i effektiv isolering av telocyter. Framgångsrik isolering av telocyter kräver speciella protokolljusteringar som möjliggör dissociation av den starka cellcellkontakten mellan telocyterna och angränsande celler utan att påverka deras livskraft. För att övervinna dessa begränsningar presenterar denna artikel ett modifierat protokoll som konsekvent ger en mycket livskraftig encellssuspension innehållande en relativt hög mängd telocyter med tillräckligt bevarade antigena och funktionella egenskaper. Dessa telocyter kan användas för flera tillämpningar, inklusive samodling med mus- eller human-derived organoider, för att stödja tillväxt utan tillväxtfaktor tillskott. Detta återspeglar i sin tur bättre situationen i den ursprungliga vävnaden.
Vi använde FOXL1-Cre: Rosa-mTmG musmodell8, där telocyter är märkta med en membranbunden version av grönt fluorescerande protein (GFP) i grönt, vilket gör det möjligt för utredaren att följa telocyter i sin helhet; alla andra mesenkymala celler är märkta med en membranbunden tdTomat i rött. Det nuvarande protokollet modifierades från ett protokoll som isolerar tarmmesenkym12 för att förbättra telocytutbytet och livskraften.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

Den murina tunntarmen, eller kolonmesenkym, är mycket heterogen och innehåller distinkta celltyper inklusive blod och lymfatiskt endotel, nerver, fibroblaster, myofibroblaster, glattmuskelceller, immunceller och den nyligen identifierade celltypen, telocyter. Telocyter är unika mesenkymala celler med långa cytoplasmatiska processer och når ett avstånd av tiotals till hundratals mikron från cellkroppen. Telocyter har nyligen dykt upp som en viktig tarmstamcellsnischkomponent, vilket ger Wnt-proteiner som är väsentliga för stam- och stamcellsproliferation.
Även om protokoll om hur man isolerar mesenkym från musttarmen finns tillgängliga, är det inte klart om dessa förfaranden möjliggör effektiv isolering av telocyter. Att isolera telocyter effektivt kräver speciella protokolljusteringar som skulle möjliggöra dissociation av den starka cell-cellkontakten mellan telocyter och angränsande celler utan att påverka deras livskraft. Här justerades tillgängliga intestinala mesenkymisoleringsprotokoll för att stödja framgångsrik isolering och odling av mesenkym innehållande ett relativt högt utbyte av livskraftiga encelliga telocyter.
Den erhållna encellssuspensionen kan analyseras med flera tekniker, såsom immunfärgning, cellsortering, avbildning och mRNA-experiment. Detta protokoll ger mesenkym med tillräckligt bevarade antigena och funktionella egenskaper hos telocyter och kan användas för flera applikationer. Till exempel kan de användas för samodling med mus- eller human-härledda organoider för att stödja organoid tillväxt utan tillväxtfaktortillskott, för att bättre återspegla situationen i den ursprungliga vävnaden.

Ovanstående protokoll för isolering av tarmmesenkym modifierades från protokoll som beskrivs i både Wu et al.12 och Shoshkes-Carmel et al.8. Protokollet som beskrivs i Wu et al. är för tjocktarmen, och det av Shoshkes-Carmel et al. är för tunntarmen, så matsmältningstillståndet är annorlunda i enzymkombination, arbetskoncentration och inkubationstid mellan dessa två protokoll. Här har det beskrivna protokollet framgångsrikt använts för att isolera och odla intestinala mesenkymala celler, inklusive telocyter. Kortfattat dissekerade vi tunntarmen från tolvfingertarmen till ileum med hjälp av en FOXL1-Cre: Rosa-mTmG-musmodell8, där telocyterna märktes med membran-GFP (grön), medan andra mesenkymala celler märktes med membran-tdTomat (röd). Vi dissocierade vävnaden med hjälp av smälta enzymer och sådde mesenkymet i en 6-brunnsplatta. Efter dissociation förlorar telocyter sina cellulära egenskaper, vilket visar rund cellulär morfologi (figur 2A) vilket återspeglas i underkvantifieringen av GFP+-celler dag 1 jämfört med följande dagar (figur 2F). Efter några dagar uppvisar telocyter en liten sträckt cellmorfologi med korta cellulära processer (figur 2B, C). Men 7-10 dagar efter sådd återfår telocyter sina cellulära egenskaper, visar stor sträckt cellmorfologi med långa cytoplasmatiska processer (figur 2D, E) och är redo att användas i samodling med organoider och stödja deras tillväxt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> Figur 2: Odlat mesenkym isolerat från FOXL1Cre: Rosa-mTmG mustarm. FOXL1 + telocyter är märkta med GFP, medan andra mesenkymala celler är tdTomat +. (A–E) Representativa bilder av odlad mesenkym isolerad med det aktuella protokollet, pläterad i en 6-brunnsplatta och avbildad efter 1 (A), 4 (B, C) och 7 (D, E) dagars kultur. Skalstaplar = 100 μm. (F) Kvantifiering av GFP/tdTomatcellkvot per synfält (procent) vid dag 1, 4 och 7 av kulturen. Förkortningar: FOXL1 = Gaffellåda L1-protein; GFP = grönt fluorescerande protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
För att utvärdera detta isoleringsprotokoll och avslöja cellkompositionen analyserade vi den erhållna cellsuspensionen genom flödescytometri (figur 3). Sammantaget var 69% av de isolerade cellerna livskraftiga baserat på DAPI-färgning (figur 3 III); av de levande cellerna representerade 60,9% epitelkontaminering och immun- och endotelceller (CD326 +, CD45 + och CD31 +; Figur 3 IV). Telocytfraktionen (GFP+) spridda över 100k respektive 70k FSC respektive SSC (figur 3 VI) och representerade nästan 10% från det gated mesenkymet (live CD45-, CD326-, CD31-) (figur 3 V).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> Figur 3: Flödescytometri grindstrategi för sortering av telocyter från isolerat vuxen mustarmmesenkym. (I) Sidospridningshändelser på låg nivå uteslöts. (II) Enskilda celler inhägnades enligt SSC-höjd efter SSC-område. (III) DAPI + -händelser gated ut för att utesluta döda celler från sorteringen. (IV) DAPI- CD45+/CD326+/CD31+-händelser uteslöts för att utesluta immun-, epitelial- respektive endotelceller. (V) GFP+-telocyter stod för 10,3 % av DAPI-CD45-/CD326-/CD31-cellerna. (VI) Back-gating analys avslöjade koordinaterna för GFP+ telocyter i ett FSC-A/SSC-A-diagram. Förkortningar: SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-A = spridningstoppområde framåt, SSC-H = sidospridning-topphöjd; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; GFP = grönt fluorescerande protein; APC = allofykocyanin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Parallellt isolerade vi också mesenkym från en vildtyp (WT) C57Bl6-musttarm, där telocytfraktionen utvärderades med hjälp av en kombination av ytmarkörer som tidigare analyserats på mesenkym isolerat från en FOXL1Cre: Rosa-mTmG-musmodell, där telocytfraktionen var GFP-märkt. Vi fann att en delmängd av telocyterna kan definieras genom en positiv färgning till CD201 och podoplanin (GP38) (figur 4). Dessutom bekräftade användningen av dessa markörer vid immunfärgning 1 dag efter isolering och odling att även om cellerna ännu inte uppvisade sina cellulära egenskaper, erhöll de uttrycket av dessa molekylära markörer, vilket visade färgning i 70% -80% av GFP + -telocyterna (figur 5).
Telocytfraktionen definierad av ytmarkörer är inte identisk med den som erhålls med hjälp av den FOXL1-drivna rapportmusen; Telocyten är mycket heterogen och innehåller flera delmängder. Det är nödvändigt att kombinera ytmarkören med FOXL1-märkning för telocytdefinition. I tunntarmen hos theFOXL1Cre: Rosa-mTmG-mus är 60% -70% av GFP + -cellerna CD201-positiva och 65% -80% är positiva för GP38. Vid användning av ytmarkörer är det viktigt att notera att olämplig förvaring och upprepade frys-upptiningscykler av antikroppar minskar bindningseffektiviteten. Dessutom kan enzymatisk matsmältning störa ytmarköruttrycket. Vi observerade att uttrycket av CD138, en transmembranproteoglykan uttryckt på mesenkymala celler, stördes och minskade kraftigt med dissociation.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> Figur 4: FACS-analys av encellsmesenkymsuspension isolerad från FOXL1Cre: Rosa-mTmG mus tunntarm med det aktuella protokollet. FACS-analys på (I-II) enskilda celler, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+-celler, som visar att (VII) 65,3% av GFP+ och 31,2% av Tomato+ är positiva för GP38, medan (VIII) 60,5% av GFP+ och 22,6% av Tomato+ är positiva för CD201. Förkortningar: SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-A = spridningstoppområde framåt, SSC-H = sidospridning-topphöjd; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; GFP = grönt fluorescerande protein; APC = allofykocyanin; PE = fykoerytrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> Figur 5: Dag ett odlat mesenkym, fixerat och färgat för mesenkymala markörer. (A-D) Representativa bilder av odlat mesenkym färgat för GP38. (F-I) Representativa bilder av odlad mesenkym färgad för CD201. Skalstaplar = 100 μm. (E) Kvantifiering av Tomat+, GP38+ och Tomat+, CD201+, dubbelpositiva från totalt Tomat+. (J) Kvantifiering av GFP+ GP38+ och GFP+ CD201+ dubbelpositiv från total GFP+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lösning A:</td>
			<td colspan="4">HBSS kompletterat med 2% FBS, 1 mM DL-ditiotreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0).</td>
		</tr><tr><td>Kompletterat medium 1640 (CM1640):</td>
			<td colspan="4">RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS, Pen/Strep (100 enheter penicillin/ml, 100 μg streptomycin/ml).</td>
		</tr><tr><td>Digestion lösning:</td>
			<td colspan="4">100 E/ml kollagenas typ VIII, 75 mg/ml DNas I i 4 ml förvärmd CM1640. Obs: Tillsätt kollagenas och DNas I precis innan matsmältningsproceduren börjar.</td>
		</tr><tr><td>Kultur media:</td>
			<td colspan="4">DMEM-F12-media kompletterat med 10 μg/ml gentamicin, 10 mM HEPES, glutamin, Pen/Strep (100 enheter penicillin/ml, 100 μg streptomycin/ml).</td>
		</tr><tr><td>FACS-buffert:</td>
			<td colspan="4">PBS kompletterat med 5% FBS och 1 mM EDTA.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Sammansättning av alla lösningar som används i protokollet. 
Kompletterande tabell S1: De viktigaste skillnaderna mellan det nuvarande protokollet och de två referensprotokollen listas här. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes at JoVE.com

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera murin tarmmesenkym, inklusive telocyter. Dessa kan användas för flera tillämpningar, såsom samodling med mus eller organoider som härrör från människa, för att stödja tillväxt och bättre återspegla situationen i den ursprungliga vävnaden.

Isolering av murin tarmmesenkym vilket resulterar i ett högt utbyte av telocyter

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Vårt protokoll för isolering av tarmmesenkym resulterar i ett högt utbyte av telocyter. Denna metod erbjuder en första plattform för att studera cell-cellinteraktion som involverar telocyter vid homeostas och sjukdom. Telocyter är unika celler som är känsliga för tillgängliga vävnadsdissociationsprotokoll.Därför är den största fördelen med denna teknik isoleringen av mesenkym, inklusive berikade livskraftiga telocyter. Mesenkym, inklusive telocyt, kan fungera som en källa för signalmolekyler och tillväxtfaktorer som krävs för organiserad tillväxt ex vivo. För att börja, tvätta tarmarna, separerade från en eutanaiserad mus, i en petriskål som innehåller kall, steril PBS.Placera tarmarna i en petriskål. Och använd kulspetssax, öppna tarmröret i längdriktningen och tvätta avföringen. Överför tarmen till en ny maträtt som innehåller färsk, kall PBS.Efter att ha tvättat tarmarna en gång till, skär tunntarmen i en centimeter långa segment och överför dem till ett 15 ml koniskt rör fyllt med åtta milliliter PBS. Skaka röret manuellt med en eller två cykler per sekund i en minut. Häll lösningen i en petriskål.Och överför segmentet med pincett till ett 50 ml koniskt rör fyllt med 20 ml lösning A.Placera rören i en orbital shaker-inkubator vid 37 grader Celsius i 20 minuter. Efter inkubation, skaka röret kraftigt för hand med fyra eller fem cykler per sekund i en minut för att dissociera epitelet. Upprepa detta steg en gång till.Efter skärning och tvättning av fragmenten som visats tidigare, överför dem till ett nytt 50-milliliter rör fyllt med 10 ml steril PBS och invertera röret med en eller två cykler per sekund i en minut. Häll lösningen i en petriskål. Överför segmenten till ett nytt 15-milliliter rör fyllt med 10 ml steril PBS och luta försiktigt upp och ner med en eller två cykler per sekund i två minuter.Under ett biosäkerhetsskåp, använd pincett för att placera segmenten på en steril laboratorieduk för att torka dem. När de har torkat, skär segmenten ytterligare i bitar. Överför de skurna bitarna med pincett till en sexbrunnsplatta fylld med fyra milliliter förvärmd matsmältningslösning per brunn.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 50 minuter och skaka försiktigt plattan manuellt var 20: e minut. Överför sedan bitarna med en Pasteur-pipett till ett 15-milliliter koniskt rör fyllt med fyra milliliter DMEM. Skaka röret manuellt med fyra eller fem cykler per sekund i en minut för att få en enda cellsuspension.Filtrera suspensionen genom en 100 mikrometer sil i ett 50 ml koniskt rör. Centrifugera filtratet vid 700 g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten genom aspiration och resuspendera cellpelleten i fem milliliter 2% FBS / PBS.Efter centrifugering av suspensionen ytterligare en gång vid 700 g i fem minuter, kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 12 ml odlingsmedium. Slutligen frö cellsuspensionen i sexbrunnsplattor. Efter mesenkymdissociation förlorar telocyter sina cellulära egenskaper, visar rund cellulär morfologi och reflekterar mindre antal GFP-positiva celler på dag ett jämfört med de följande dagarna.Några dagar senare uppvisar telocyter en liten, sträckt cellmorfologi med korta cellulära processer. Efter sju till 10 dagars sådd återfår telocyter sina cellulära egenskaper, vilket visar stor, sträckt cellmorfologi med långa cytoplasmatiska processer. Flödescytometri avslöjar cellkompositionen.Sammantaget var 69% av de isolerade cellerna livskraftiga baserat på DAPI-färgning. Och av dessa representerade 60.9% epitelförorening och immun- och endotelceller. Telocytfraktionen spridda över 100k respektive 70k FSC och SSC och representerade nästan 10% av det gated mesenkymet.FACS-analys visade att delmängden av telocyter kan definieras genom positiv färgning till CD201 och GP38. Immunfärgning av en dags odlat mesenkym med hjälp av dessa markörer visade uttryck av dessa molekylära markörer, trots att celler inte uppvisade sina cellulära egenskaper. Denna procedur resulterar i en livskraftig encellssuspension av stromaceller som inte bara kan användas för 2D-odling utan för alla andra tillämpningar, såsom 3D-samodling med organoider eller bioprinting.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

En metod för Murine Islet Isolering och subkapsulär Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Funktionell bedömning av intestinal motilitet och tarmväggen Inflammation i Gnagare: Analyser i en standardiserad modell av intestinal manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Lungsköljning (BAL) för forskning, erhålla lämpligt stickprov Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murin Endoskopi för<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal avbildning av Carcinogenesis och Bedömning av intestinala sårläkning och inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Isolering och Excision av murina Aorta; En Mångsidig Teknik studien av kardiovaskulär sjukdom

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murina Modell av Intestinal ischemi-reperfusionsskada

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescens-medierad tomografi för påvisande och kvantifiering av makrofag-relaterade murina tarminflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Elektrofysiologiska bedömning av murina Atria med högupplöst optisk kartläggning

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinal Stem Cell isolering och kultur i en svin modell av segmentell små Intestinal ischemi

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolering och rening av murina hjärt pericyter

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...