Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

Vi anerkender taknemmeligt støtte fra NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB og Royal National Institute for the Deaf. Vi vil gerne takke Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Vi er taknemmelige for CIFF og EM facilitet og lab support på NCBS. Vi takker Yoshiko Takahashi og Koichi Kawakami for Tol2-eGFP- og T2TP-konstruktionerne og Guy Richardson for HCA- og G19 Pcdh15-antistoffet. Vi er taknemmelige for Earlab-medlemmer for deres konstante støtte og værdifulde feedback på protokollen.

Protokoller, der involverer indkøb, dyrkning og brug af befrugtede kyllingæg og ikke-udklækkede embryoner, blev godkendt af den institutionelle dyreetiske komité ved National Center for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.
1. I ovo elektroporation af chick auditive prækursorer
<ol><li>sgRNA-design og kloning til CRISPR/Cas9-gen-knockout<ol><li>For at skabe gen-knockouts skal du designe guide RNA'er for at forstyrre exonregionerne i genet, helst tættere p...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+cochlea.">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+links:+genetics+as+the+gateway+to+function.">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).</li><li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined.">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1 (2012).</li><li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like.">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833 (2016).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li><li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research.">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li><li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration.">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li><li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+development+and+regeneration:+similarities+and+differences.">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+fins:+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration.">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future.">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li><li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium.">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear.">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li><li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia,+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate.">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear.">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li><li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+labyrinth:+culture+of+the+chicken+inner+ear.">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li><li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium:+an+explant+culture+model.">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells.">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li><li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear.">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li><li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+avian+embryos.">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+past,+present+and+future.">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li><li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear.">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

Kyllingen er en omkostningseffektiv og bekvem tilføjelse til de modelorganismer, som et laboratorium kan bruge til at undersøge det indre øre. De metoder, der er beskrevet her, anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium og supplerer løbende forskning i pattedyrs indre øre. I ovo elektroporation bruges til at indføre genetiske manipulationer i kyllingens genom. Elektroporation kan også bruges til at introducere konstruktioner, der koder for fluorescerende proteiner målrettet mod bestemte organeller elle...

Det indre øre af alle hvirveldyr er afledt af et simpelt epitel kendt som den otiske placode 1,2. Dette vil give anledning til alle de strukturelle elementer og de celletyper, der er nødvendige for at transducere de mekanosensoriske oplysninger, der er forbundet med hørelse og balanceopfattelse. Hårceller (HC'er), den cilierede sensor i det indre øre, er omgivet af understøttende celler (SC'er). HC'er videresender information til den auditive baghjerne gennem neuronerne i den ottende kraniale nerve. Disse genereres også fra den otiske placode3. Den primære transduktion af lyd opnås ved den apikale overflade af den auditive HC gennem et mekanisk følsomt hårbundt4. Dette formidles gennem modificerede actinbaserede fremspring kaldet stereocilia, som er arrangeret i et gradueret trappemønster5. Derudover organiserer et modificeret primært cilium, kaldet kinocilium, hårbundtdannelse og støder op til den højeste række stereocilia 6,7,8. Stereocilias arkitektur er afgørende for denne rolle i at konvertere mekaniske stimuli afledt af akustisk energi til elektriske neurale signaler9. Skader på den auditive HC gennem aldring, infektion, otoakustisk traume eller ototoksisk shock kan resultere i delvist eller fuldstændigt høretab, der hos pattedyr er irreversibelt10.
Cellulære erstatningsterapier er blevet foreslået, der kan reparere sådanne skader11,12. Tilgangen til denne forskning har været at forstå den normale udvikling af pattedyrs hårcelle og spørge, om udviklingsprogrammer kan genoptages i stamfaderlignende celler, der kan eksistere i det indre øre13. En anden tilgang har været at se uden for pattedyr, til ikke-pattedyrs hvirveldyr, hvor robust regenerering af auditive hårceller finder sted, såsom fugle14,15. Hos fugle forekommer hårcelleregenerering overvejende gennem dedifferentiering af en understøttende celle til en stamfaderlignende tilstand efterfulgt af asymmetrisk mitotisk opdeling for at generere en hårcelle og understøttende celle16. Derudover er direkte differentiering af en understøttende celle til at generere en hårcelle også blevet observeret17.
Mens mekanismerne for fugleauditiv udvikling viser betydelige ligheder med pattedyrs, er der forskelle18. HC- og SC-differentieringen i kyllingen BP er tydelig fra fosterdagen (E) 7 og bliver mere tydelig over tid. Ved E12 kan en velmønstret og velpolariseret basilarpapilla (BP) visualiseres, og ved E17 kan veludviklede hårceller ses19. Disse tidspunkter giver vinduer ind i mekanismerne for differentiering, mønster og polaritet samt hårcellemodning. Det er vigtigt at forstå, om sådanne mekanismer er bevaret eller divergerende, da de giver indsigt i den dybe homologi af oprindelsen af mekanosensoriske hårceller.
Her demonstrerer vi en række teknikker udført på tidlige og sene embryonale stadier for at studere cellulære processer såsom spredning, skæbnespecifikation, differentiering, mønster og vedligeholdelse gennem udviklingen af det indre øreorgan. Dette supplerer andre protokoller til forståelse af indre øreudvikling i explantkultur20,21,22. Vi diskuterer først introduktionen af eksogent DNA eller RNA i BP-prækursorer inden for E3.5 otocyst ved anvendelse i ovo-elektroporation. Selvom genetiske manipulationer kan give værdifuld indsigt, kan de således genererede fænotyper være pleiotropiske og følgelig forvirrende. Dette gælder især under senere udvikling af indre øre, hvor grundlæggende processer såsom cytoskeletal ombygning spiller flere roller i celledeling, vævsmorfogenese og cellulær specialisering. Vi præsenterer protokoller for farmakologisk hæmning i dyrkede explants, som giver fordele ved at kontrollere dosering og behandlingstid og varighed, hvilket giver præcis spatiotemporal manipulation af udviklingsmekanismer.
Forskellige organkulturmetoder kan anvendes afhængigt af behandlingsvarigheden af små hæmmere. Her demonstrerer vi to metoder til organkultur, der giver indsigt i epitelmorfogenese og cellulær specialisering. En metode til 3D-kultur ved hjælp af kollagen som en matrix til dyrkning af cochlear-kanalen muliggør robust dyrkning og levende visualisering af den udviklende BP. For at forstå dannelsen af stereocilia præsenterer vi en membrankulturmetode, således at epitelvæv dyrkes på en stiv matrix, der gør det muligt for actinfremspring at vokse frit. Begge metoder tillader downstream-behandling såsom levende cellebilleddannelse, immunohistokemi, scanningselektronmikroskopi (SEM), celleoptagelse osv. Disse teknikker giver en køreplan for effektiv brug af kyllingen som et modelsystem til at forstå og manipulere udviklingen, modningen og regenereringen af fugleens auditive epitel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

Det indre øre opfatter lyd og opretholder balance ved hjælp af cochlea og vestibule. Det gør det ved hjælp af en dedikeret mekanosensorisk celletype kendt som hårcellen. Grundforskning i det indre øre har ført til en dyb forståelse af, hvordan hårcellen fungerer, og hvordan dysregulering kan føre til høretab og svimmelhed. Til denne forskning har musen været det fremtrædende modelsystem. Mus har dog, som alle pattedyr, mistet evnen til at erstatte hårceller. Når man forsøger at forstå cellulære terapier til genoprettelse af indre ørefunktion, kan komplementære undersøgelser i andre hvirveldyrarter således give yderligere indsigt. Det auditive epitel af fugle, basilar papilla (BP), er et ark epitel sammensat af mekanosensoriske hårceller (HC'er) interkaleret af understøttende celler (SC'er). Selvom den anatomiske arkitektur af basilar papilla og pattedyr cochlea er forskellige, er de molekylære mekanismer for indre øreudvikling og hørelse ens. Dette gør basilar papilla til et nyttigt system til ikke kun sammenlignende undersøgelser, men også til at forstå regenerering. Her beskriver vi dissektions- og manipulationsteknikker til kyllingens indre øre. Teknikken viser genetiske og små molekylehæmningsmetoder, som tilbyder et potent værktøj til at studere de molekylære mekanismer i udviklingen af det indre øre. I dette papir diskuterer vi i ovo elektroporationsteknikker til genetisk at forstyrre basilarpapillen ved hjælp af CRIPSR-Cas9-deletioner efterfulgt af dissektion af basilarpapillen. Vi demonstrerer også BP-organkulturen og optimal brug af kulturmatricer for at observere udviklingen af epitelet og hårcellerne.

I elektroporationsopsætningen kan elektrodepositionering spille en rolle inden for transfektion. Den positive elektrode placeres under æggeblommen og den negative over embryoet (figur 1A). Dette resulterer i højere GFP-ekspression i meget af det indre øre og både vestibulære organer (figur 1B) og auditiv basilar papilla (figur 1C, D), hvilket bekræfter transfektion.
Ved vurderingen...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Kyllingen er en omkostningseffektiv, tilgængelig og bredt tilgængelig modelorganisme til en række undersøgelser. Her er en række protokoller detaljeret for at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for udvikling og regenerering af fugle i det indre øre.

I Ovo og Ex Ovo metoder til undersøgelse af aviær indre øre udvikling

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Alder, infektion og ototoksiske lægemidler kan forårsage degeneration af hårceller i det indre øre, hvilket hos os fører til høretab. I ikke-pattedyr hvirveldyr, såsom kylling, kan hårceller regenereres. De teknikker, der er beskrevet her, gør brug af omkostningseffektiviteten ved at arbejde på kyllingembryoner, letheden ved at få embryoner og god exo-udvikling af vævsplanter.Forståelse af udvikling og regenerering af fugle i det indre ørehår kan give vigtig indsigt i høretab og potentielle terapier, og explantkulturen kan være vigtig for at evaluere de ototoksiske virkninger af forskellige lægemidler. Før du starter eksperimentet, anskaf frisklagte æg og rengør dem med 70% ethanol for at forhindre forurening. Inkuber æggene i 3,5 til 4 dage ved 37 til 38 grader Celsius med 45% fugtighed.Efter inkubation skal du flytte embryoet til toppen af æggeblommen ved at placere et æg på siden i fem minutter. Brug derefter tang til at lave et lille hul øverst og stump ende af ægget, så en 21 gauge nål kan passere igennem. Brug en fem milliliter sprøjte og en 21 gauge nål til at fjerne to milliliter af albuminet fra et hul i den stumpe ende af ægget.Dæk hullet i den stumpe ende ved hjælp af klar tape. For at få ægvinduet til at fastgøre det klare bånd til toppen af æggeskallen. Hold nålene fra mikroinjektion fra standard glaskapillærer ved hjælp af en lodret pipettetrækker.Efter træk skal du afbryde kapillærspidsen ved hjælp af fin tang for at opnå en spidsdiameter på ca. 50 mikrometer med en tilspidset ende. Til gen-knockout-eksperimentet blandes de tre konstruktioner, nemlig guideplasmidet, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP i et en-til-en-forhold med et mikrogram SP Cas9-protein, 30% saccharose og 0,1% hurtigt grønt farvestof og et endeligt volumen på 10 mikroliter. Mens du elektroporerer flere plasmider, skal du sikre dig, at den endelige koncentration af DNA er mindst fire mikrogram pr. Mikroliter.Ved hjælp af springbue saks skæres op omkring et to centimeter langt og 1,5 centimeter bredt vindue og udsætter embryoet. Brug derefter tang til at åbne chorionmembranerne, der ligger over embryoet, hvilket giver adgang til embryoet. Injicer omkring 200 nanoliter volumen DNA-opløsningsblanding for at fylde den otiske vesikel.For at bestemme vejledningen RNA-effektivitet udføres et T7-endonukleaseassay. Tilsæt 0,719% saltvandsdråber til embryoet for at sænke den elektriske modstand og forhindre overophedning. Placer derefter den positive elektrode gennem hullet lavet på den stumpe side af ægget, og manøvrer elektroden, så den er under æggeblommen.Placer den negative elektrode over den fyldte otocyst. For at transficere plasmidet i den otiske vesikel med elektroporation skal du bruge en firkantet pulsgenerator og anvende fem impulser på 25 volt i 100 millisekunder hver, 50 millisekunder fra hinanden. Bestem betingelserne empirisk baseret på en individuel elektroporation oprettet.Efter elektroporation hydreres embryoet ved at tilføje et par dråber 0,719% saltvand. Forsegl ægget igen med klart tape, og vend tilbage til den befugtede inkubator ved 37 til 38 grader Celsius for yderligere inkubation. Desinficer det kirurgiske bord, mikroskopstadiet og det omkringliggende område ved hjælp af 70% ethanol og varme, eller alkohol steriliser mikrodissektionsudstyret, herunder minimalt springbuesaks, mikrocuret og to par fine tang.Forbered dissektionspladerne inklusive en glas petriskål med en sort silikonebase, en 90 millimeter plast petriskål og en 60 millimeter petriskål. Hold kølet PBS eller Hanks's saltopløsning, også kendt som HBSS, klar til dissektioner. Knæk forsigtigt ægget i 90 millimeter petriskålen.Identificer derefter kyllingens ydre øre, og overfør hovedet til en 60 millimeter petriskål fyldt med iskold PBS. Orienter derefter embryoet med toppen af næbbet vendt indvendigt, og hold næbbet ved hjælp af en af nummer fem tang. Scoop ud øjnene ved hjælp af den anden nummer fem tang.Derefter, fra rostral til kaudal, skære langs kraniet langs midterlinjen og øse hjernen ud. Tilføj mere iskold PBS eller HBSS, og find lagenaens to otolitter som skinnende strukturer i slutningen af cochlearkanalen og tæt på midterlinjen. For at isolere to indre ører, skåret mellem de to lagenas og godt over og under regionen.Derefter visualiseres omridset af det indre øre under skrå belysning og fjerner fremmed væv og vestibulen. Overfør den isolerede cochlea til en sort silikone bundplade med iskold PBS. Skræl bruskkapslen væk ved hjælp af nummer fem tang for at opnå cochlear-kanalen.Find derefter det bølgede lag eller tegmentum i cochlearkanalen, og fjern det ved hjælp af nummer 55 tang for at udsætte basilar papilla eller BP. Fjern derefter brystmembranen for at udsætte hårceller og understøttende celler ved hjælp af nummer 55 tang. Til membrankultur af basilar papillaen skal du tage en seks brøndvævskulturplade og arrangere en kulturmembranindsats pr. Brønd. Tegn nogle medier i en 200 mikroliter pipette, og opsug derefter den dissekerede basilar papilla explant med en X HBSS buffer.Overfør explanten til en membran, og orienter den, så basilarpapillen vender opad, og hår- og støttecellerne er synlige fra toppen. Når explanten er placeret, aspireres HBSS-bufferen langsomt fra kulturmembranoverfladen. I denne proces vil explanten fastgøres til kulturmembranen.Fyld brønden på de seks brøndplader ved at tilføje 1,2 ml dulbeccos modificerede ørnemedium eller DMEM-kulturmedie mellem membranindsatsen og brøndvæggen. For at forberede kollagenkulturen i cochlearkanalen tilsættes tre dråber frisklavet kollagenblanding i hver brønd af en fire brøndplade og overfører dissekeret cochlearkanal til hver kollagendråbe. Inkuber pladen i 10 minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid for at helbrede kollagenmatrixen.For en lille molekylebehandling af kulturerne skal du erstatte kulturmediet med 700 mikroliter medier suppleret med den farmakologiske modulator, såsom penicillin, og inkubere pladerne som vist før. Udskift 50% af kulturmedierne hver dag. Efter passende inkubationstid skal du fjerne kulturmediet og bruge explanterne til nedstrøms assays.I elektroporationsopsætningen resulterede den korrekte elektrodepositionering i højere GFP-ekspression i det indre øre i begge vestibulære organer og auditiv basilar papilla, der bekræftede transfektion. CRISPR Cas9 medierede Atoh1 gen knockout i det indre øre, hvilket resulterede i tab af hårceller. Atoh1 gen knockout via en ovo-elektroporation efterfulgt af inkubation indtil E10 viste reduceret hårcelleudvikling sammenlignet med tom plasmidkontrol.Selvom elektroporation er mosaik, var kontrolelektroporerede celler i stand til at danne hårceller. I Atoh1 gRNA elektroporerede prøver viste grønne fluorescerende proteinpositive celler aldrig markørerne for hårcelleudvikling. Organkulturen af basilar papilla i en 3D-matrix, såsom kollagen og plet med antistoffer mod hårcelleantigen gav fremragende bevarelse af vævsmorfologi i op til fem dage.Organiseringen af hårceller og understøttende celler blev opretholdt under disse kulturforhold. Organkulturerne på en membran kan opretholdes i op til fem dage, samtidig med at hårbundtets integritet opretholdes. Dette kan ses på det repræsentative billede ved lokaliseringen af tiplinkproteinet, protocadherin 15.For at undersøge udviklingen af hårbundtet kan billeddannelse med højere opløsning, såsom superopløsningsmikroskopi eller scanningselektronmikroskopi, give mere information. Sterile tilstande bør opretholdes under hele proceduren. Under elektropolering skal du sikre dig, at embryonerne ikke tørrer ud.Ved titrering af farmakologiske hæmmere kan man reducere koncentrationen for at overvinde enhver dødelighed. Både embryoner og explants kan tages til billeddannelsesforsøg. Enten ved at udføre videomikroskopering i realtid eller statisk lys konfokal elektronmikroskopering, som vist i protokollen.I betragtning af den lethed og tilgængelighed ved at bruge chick indre øre explants, kan vi bruge medium gennem bevis screening til at identificere nye molekyler, der er afgørende for hårcelleregenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimeret<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrkning af kyllingeembryoer til fremskredne stadier af udvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer til kylling Auditory Organ med<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

En roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding Teknik til Alter intrakardielle Hæmodynamik i en Embryonale Kylling System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En neddykket Filter Paper Sandwich til Langsigtet<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging af Early Chick embryoner

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metoder til undersøgelse af regenerering i Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Oprettelse af fugleforhjernekimærer til vurdering af ansigtsudvikling

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

I Ovo Fodring af kommercielle slagtekyllinger: En nøjagtig og reproducerbar metode til at påvirke muskeludvikling og vækst

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...