Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

We zijn dankbaar voor de steun van NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB en het Royal National Institute for the Deaf. We willen graag de Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru bedanken. We zijn CIFF en EM-faciliteit en laboratoriumondersteuning bij NCBS dankbaar. We bedanken Yoshiko Takahashi en Koichi Kawakami voor de Tol2-eGFP en T2TP constructies, en Guy Richardson voor HCA en G19 Pcdh15 antilichaam. We zijn Earlab-leden dankbaar voor hun constante steun en waardevolle feedback op het protocol.

Protocollen met betrekking tot de aanschaf, kweek en het gebruik van bevruchte kippeneieren en niet-gehate embryo's werden goedgekeurd door de Institutionele Commissie voor Dierenethiek van het National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.
1. In ovo-elektroporatie van auditieve precursoren van kuikens
<ol><li>sgRNA-ontwerp en klonen voor CRISPR/Cas9-gen knock-out<ol><li>Voor het creëren van gen knock-outs, ontwerp gids RNA's om de exon regio's van ...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+cochlea.">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+links:+genetics+as+the+gateway+to+function.">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).</li><li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined.">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1 (2012).</li><li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like.">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833 (2016).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li><li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research.">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li><li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration.">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li><li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+development+and+regeneration:+similarities+and+differences.">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+fins:+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration.">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future.">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li><li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium.">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear.">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li><li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia,+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate.">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear.">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li><li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+labyrinth:+culture+of+the+chicken+inner+ear.">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li><li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium:+an+explant+culture+model.">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells.">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li><li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear.">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li><li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+avian+embryos.">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+past,+present+and+future.">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li><li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear.">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

Het kuiken is een kosteneffectieve en handige aanvulling op de modelorganismen die een laboratorium kan gebruiken om het binnenoor te onderzoeken. De hier beschreven methoden worden routinematig gebruikt in ons laboratorium en vormen een aanvulling op lopend onderzoek in het binnenoor van zoogdieren. In ovo wordt elektroporatie gebruikt om genetische manipulaties in het kuikengenoom te introduceren. Elektroporatie kan ook worden gebruikt om constructen te introduceren die coderen voor fluorescerende eiwitten ger...

Het binnenoor van alle gewervelde dieren is afgeleid van een eenvoudig epitheel dat bekend staat als de otic placode 1,2. Dit zal aanleiding geven tot alle structurele elementen en de celtypen die nodig zijn om de mechanosensorische informatie in verband met gehoor- en evenwichtsperceptie te transduceren. Haarcellen (HCs), de trilhaarsensor van het binnenoor, zijn omgeven door ondersteunende cellen (SC's). HC's geven informatie door aan de auditieve achterhersenen via de neuronen van de achtste hersenzenuw. Deze worden ook gegenereerd uit de otic placode3. De primaire transductie van geluid wordt bereikt aan het apicale oppervlak van de auditieve HC, door een mechanisch gevoelige haarbundel4. Dit wordt gemedieerd door gemodificeerde op actine gebaseerde uitsteeksels genaamd stereocilia, die zijn gerangschikt in een gradueel trappatroon5. Bovendien organiseert een gemodificeerd primair cilium, het kinocilium genaamd, de vorming van haarbundels en grenst het aan de hoogste rij stereocilia 6,7,8. De architectuur van stereocilia is van cruciaal belang voor deze rol bij het omzetten van mechanische stimuli afgeleid van akoestische energie naar elektrische neurale signalen9. Schade aan de auditieve HC door veroudering, infectie, otoakoestisch trauma of ototoxische shock kan leiden tot gedeeltelijk of volledig gehoorverlies dat bij zoogdieren onomkeerbaar is10.
Cellulaire vervangingstherapieën zijn voorgesteld die dergelijke schade kunnen herstellen11,12. De benadering van dit onderzoek is geweest om de normale ontwikkeling van de haarcel van zoogdieren te begrijpen en te vragen of ontwikkelingsprogramma's opnieuw kunnen worden geïnitieerd in voorloperachtige cellen die mogelijk in het binnenoor bestaan13. Een tweede benadering is geweest om buiten zoogdieren te kijken, naar niet-zoogdier gewervelde dieren waarbij robuuste regeneratie van auditieve haarcellen plaatsvindt, zoals vogels14,15. Bij vogels vindt haarcelregeneratie voornamelijk plaats door de dedifferentiatie van een ondersteunende cel naar een voorloperachtige toestand, gevolgd door asymmetrische mitotische deling om een haarcel en ondersteunende cel16 te genereren. Daarnaast is ook directe differentiatie van een ondersteunende cel waargenomen om een haarcel te genereren17.
Hoewel de mechanismen van de auditieve ontwikkeling van vogels significante overeenkomsten vertonen met die van zoogdieren, zijn er verschillen18. HC- en SC-differentiatie in het kuiken BP is duidelijk vanaf embryonale dag (E) 7 en wordt in de loop van de tijd duidelijker. Door E12 kan een goed gevormde en goed gepolariseerde basilaire papilla (BP) worden gevisualiseerd, en door E17 kunnen goed ontwikkelde haarcellen worden gezien19. Deze tijdspunten bieden vensters op de mechanismen van differentiatie, patronen en polariteit, evenals haarcelrijping. Begrijpen of dergelijke mechanismen geconserveerd of divergent zijn, is belangrijk, omdat ze inzicht geven in de diepe homologie van de oorsprong van mechanosensorische haarcellen.
Hier demonstreren we een reeks technieken die in vroege en late embryonale stadia worden uitgevoerd om cellulaire processen te bestuderen, zoals proliferatie, lotspecificatie, differentiatie, patronen en onderhoud tijdens de ontwikkeling van het binnenoororgaan. Dit is een aanvulling op andere protocollen voor het begrijpen van de ontwikkeling van het binnenoor in explantcultuur 20,21,22. We bespreken eerst de introductie van exogene DNA of RNA in BP-precursoren binnen de E3.5-otocyste met behulp van ovo-elektroporatie. Hoewel genetische manipulaties waardevolle inzichten kunnen opleveren, kunnen de aldus gegenereerde fenotypen pleiotroop en bijgevolg verwarrend zijn. Dit geldt met name tijdens de latere ontwikkeling van het binnenoor, waar fundamentele processen zoals cytoskeletale remodellering meerdere rollen spelen bij celdeling, weefselmorfogenese en cellulaire specialisatie. We presenteren protocollen voor farmacologische remming in gekweekte explantaten, die voordelen bieden bij het beheersen van de dosering en de timing en duur van de behandeling, en die nauwkeurige spatiotemporale manipulatie van ontwikkelingsmechanismen bieden.
Verschillende orgaankweekmethoden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de behandelingsduur van kleine remmers. Hier demonstreren we twee methoden van orgaancultuur die inzicht geven in epitheliale morfogenese en cellulaire specialisatie. Een methode voor 3D-cultuur met collageen als matrix om het cochleaire kanaal te kweken, maakt robuuste kweek en live visualisatie van de zich ontwikkelende BP mogelijk. Om de vorming van stereocilia te begrijpen, presenteren we een membraankweekmethode, zodat epitheelweefsel wordt gekweekt op een stijve matrix waardoor actine-uitsteeksels vrij kunnen groeien. Beide methoden maken downstream-verwerking mogelijk, zoals live-cell imaging, immunohistochemie, scanning elektronenmicroscopie (SEM), celregistratie, enz. Deze technieken bieden een routekaart voor het effectieve gebruik van het kuiken als een modelsysteem om de ontwikkeling, rijping en regeneratie van het auditieve epitheel van de aviaire te begrijpen en te manipuleren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

Het binnenoor neemt geluid waar en houdt het evenwicht met behulp van het slakkenhuis en de vestibule. Het doet dit door gebruik te maken van een speciaal mechanosensorisch celtype dat bekend staat als de haarcel. Fundamenteel onderzoek in het binnenoor heeft geleid tot een diep begrip van hoe de haarcel functioneert en hoe ontregeling kan leiden tot gehoorverlies en duizeligheid. Voor dit onderzoek is de muis het modelsysteem bij uitstek geweest. Muizen hebben echter, net als alle zoogdieren, het vermogen verloren om haarcellen te vervangen. Dus, bij het proberen te begrijpen van cellulaire therapieën voor het herstellen van de binnenoorfunctie, kunnen complementaire studies bij andere gewervelde soorten verdere inzichten bieden. Het auditieve epitheel van vogels, de basilaire papilla (BP), is een vel epitheel dat bestaat uit mechanosensorische haarcellen (HC's) geïncaleerd door ondersteunende cellen (SC's). Hoewel de anatomische architectuur van de basilaire papilla en het zoogdier slakkenhuis verschillen, zijn de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling en het gehoor van het binnenoor vergelijkbaar. Dit maakt de basilaire papilla een nuttig systeem voor niet alleen vergelijkende studies, maar ook om regeneratie te begrijpen. Hier beschrijven we dissectie- en manipulatietechnieken voor het binnenoor van de kip. De techniek toont genetische en kleine molecuul remmingsmethoden, die een krachtig hulpmiddel bieden voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van het binnenoor. In dit artikel bespreken we in ovo elektroporatietechnieken om de basilaire papilla genetisch te verstoren met behulp van CRIPSR-Cas9-deleties, gevolgd door dissectie van de basilaire papilla. We demonstreren ook de BP-orgaancultuur en optimaal gebruik van kweekmatrices, om de ontwikkeling van het epitheel en de haarcellen te observeren.

In de elektroporatieopstelling kan elektrodepositionering een rol spelen in het domein van transfectie. De positieve elektrode wordt onder de dooier geplaatst en de negatieve boven het embryo (figuur 1A). Dit resulteert in een hogere GFP-expressie in een groot deel van het binnenoor en zowel vestibulaire organen (figuur 1B) als auditieve basilaire papilla (figuur 1C, D), wat transfectie bevestigt.
<p class="jove...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Leeftijd, infectie en ototoxische geneesmiddelen kunnen degeneratie van haarcellen van het binnenoor veroorzaken, wat bij ons leidt tot gehoorverlies. Bij niet-zoogdier gewervelde dieren, zoals kuikens, kunnen haarcellen worden geregenereerd. De hier beschreven technieken maken gebruik van de kosteneffectiviteit van het werken aan kuikenembryo's, het gemak van het verkrijgen van embryo's en een goede exo-ontwikkeling van weefselexplantaten.Het begrijpen van de ontwikkeling en regeneratie van vogelbinnenoorharen kan belangrijke inzichten bieden in gehoorverlies en mogelijke therapieën, en explantcultuur kan belangrijk zijn voor het evalueren van de ototoxische effecten van verschillende geneesmiddelen. Voordat u met het experiment begint, koopt u vers gelegde eieren en reinigt u ze met 70% ethanol om besmetting te voorkomen. Incubeer de eieren gedurende 3,5 tot 4 dagen, bij 37 tot 38 graden Celsius met 45% vochtigheid.Na incubatie verplaatst u het embryo naar de top van de dooier, door een ei gedurende vijf minuten op zijn kant te plaatsen. Gebruik vervolgens een tang om een klein gaatje aan de bovenkant en een stomp uiteinde van het ei te maken waar een naald van 21 gauge doorheen kan. Verwijder met een spuit van vijf milliliter en een naald van 21 gauge twee milliliter van het albumine uit een gat aan het stompe uiteinde van het ei.Bedek het gat aan het stompe uiteinde met doorzichtige tape. Om het eiervenster te maken, bevestigt u de doorzichtige tape aan de bovenkant van de eierschaal. Houd de naalden van micro-injectie uit standaard glazen haarvaten vast met behulp van een verticale pipettrekker.Breek na het trekken de capillaire punt af met behulp van een fijne tang om een tipdiameter van ongeveer 50 micrometer te verkrijgen met een taps toelopend uiteinde. Meng voor het gen knock-out experiment de drie constructen, namelijk het geleideplasmide, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP in een één-op-één-op-één verhouding met één microgram SP Cas9-eiwit, 30% sucrose en 0,1% snelle groene kleurstof en een eindvolume van 10 microliter. Zorg er bij het elektropoderen van meerdere plasmiden voor dat de uiteindelijke concentratie DNA ten minste vier microgram per microliter is.Met behulp van een springbowschaar knipt u rond een twee centimeter lang en 1,5 centimeter breed venster open en stelt u het embryo bloot. Gebruik vervolgens een tang om de chorionmembranen boven het embryo te openen, waardoor toegang tot het embryo mogelijk is. Injecteer ongeveer 200 nanoliter volume DNA-oplossingsmengsel om het oticblaasje te vullen.Om de gids-RNA-efficiëntie te bepalen, voert u een T7-endonucleasetest uit. Voeg 0,719% zoutoplossing druppels toe aan het embryo om de elektrische weerstand te verlagen en oververhitting te voorkomen. Plaats vervolgens de positieve elektrode door het gat aan de stompe kant van het ei en manoeuvreer de elektrode zo dat deze zich onder de dooier bevindt.Plaats de negatieve elektrode over de gevulde otocyste. Om het plasmide met elektroporatie in het otic blaasje te transfecteren, gebruikt u een vierkante pulsgenerator en past u vijf pulsen van 25 volt toe gedurende 100 milliseconden elk, 50 milliseconden uit elkaar. Bepaal de condities empirisch op basis van een individuele elektroporatieopstelling.Hydrateer na elektroporatie het embryo door een paar druppels van 0,719% zoutoplossing toe te voegen. Sluit het ei opnieuw met doorzichtige tape en keer terug naar de bevochtigde incubator bij 37 tot 38 graden Celsius voor verdere incubatie. Desinfecteer de operatietafel, microscoopfase en omgeving met 70% ethanol en warmte, of alcohol steriliseer de microdissectieapparatuur, inclusief minimaal springboogschaar, microcurettage en twee paar fijne tangen.Bereid de snijplaten voor, waaronder een glazen petrischaal met een zwarte siliconenbasis, een plastic petrischaaltje van 90 millimeter en een petrischaaltje van 60 millimeter. Houd gekoelde PBS of Hanks' gebalanceerde zoutoplossing, ook bekend als HBSS, klaar voor dissecties. Kraak het ei voorzichtig in de petrischaal van 90 millimeter.Identificeer vervolgens het buitenoor van het kuiken en breng het hoofd over naar een petrischaal van 60 millimeter gevuld met ijskoude PBS. Oriënteer vervolgens het embryo met de bovenkant van de snavel naar binnen gericht en houd de snavel vast met behulp van een van de vijf tangen. Schep de ogen uit met behulp van de tweede nummer vijf tang.Snijd vervolgens, van rostral tot caudaal, langs de schedel langs de middellijn en schep de hersenen eruit. Voeg meer ijskoude PBS of HBSS toe en lokaliseer de twee otolieten van de lagena als glanzende structuren aan het einde van het cochleaire kanaal en dicht bij de middellijn. Om twee binnenoren te isoleren, snijdt u tussen de twee lagenas en ruim boven en onder het gebied.Visualiseer vervolgens onder schuine verlichting de omtrek van het binnenoor en verwijder vreemd weefsel en de vestibule. Breng het geïsoleerde slakkenhuis over op een zwarte siliconen bodemplaat met ijskoude PBS. Verwijder de kraakbeenachtige cochleaire capsule met behulp van nummer vijf tang om het cochleaire kanaal te verkrijgen.Lokaliseer vervolgens de golvende laag of het tegmentum van het cochleaire kanaal en verwijder deze met behulp van een tang van nummer 55 om de basilaire papilla of BP bloot te leggen. Verwijder vervolgens het tectoriale membraan om haarcellen en ondersteunende cellen bloot te leggen met behulp van nummer 55-tang. Neem voor membraankweek van de basilaire papilla een weefselkweekplaat met zes putten en rangschik één kweekmembraaninzet per put. Trek wat media op in een pipet van 200 microliter en zuig vervolgens de ontleedde basilaire papilla-explant op met één X HBSS-buffer.Breng de explant over op een membraan en oriënteer het zo dat de basilaire papilla naar boven is gericht en de haar- en ondersteuningscellen vanaf de bovenkant zichtbaar zijn. Zodra de explant is geplaatst, zuigt u de HBSS-buffer langzaam af van het kweekmembraanoppervlak. In dit proces zal de explant zich hechten aan het kweekmembraan.Vul de put van de zes putplaat door 1,2 milliliter dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium, of DMEM-kweekmedium, toe te voegen tussen het membraaninzetstuk en de putwand. Om de collageencultuur van het cochleaire kanaal te bereiden, voegt u drie druppels vers bereid collageenmengsel toe aan elke put van een vier putplaat en brengt u ontleed cochleair kanaal over naar elke collageendruppel. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de collageenmatrix te genezen.Vervang voor een behandeling van kleine moleculen van de culturen de kweekmedia door 700 microliter media aangevuld met de farmacologische modulator, zoals penicilline, en incubeer de platen zoals eerder aangetoond. Vervang elke dag 50% van de cultuurmedia. Verwijder na de juiste incubatietijd de kweekmedia en gebruik de explantaten voor downstream-testen.In de elektroporatie-opstelling resulteerde de juiste elektrodepositionering in een hogere GFP-expressie in het binnenoor in beide vestibulaire organen en auditieve basilaire papilla die transfectie bevestigde. CRISPR Cas9 gemedieerde Atoh1 gen knock-out in het binnenoor, resulteerde in verlies van haarcellen. Atoh1-gen knock-out via een ovo-elektroporatie gevolgd door incubatie tot E10 vertoonde een verminderde haarcelontwikkeling in vergelijking met lege plasmidecontrole.Hoewel elektroporatie mozaïek is, waren controle-elektroporated cellen in staat om haarcellen te vormen. In Atoh1 gRNA-geëlektropoeerde monsters vertoonden groene fluorescerende eiwitpositieve cellen nooit de markers van de ontwikkeling van haarcellen. De orgaancultuur van de basilaire papilla in een 3D-matrix, zoals collageen en vlek met antilichamen tegen haarcelantigeen, zorgde voor het uitstekende behoud van weefselmorfologie gedurende maximaal vijf dagen.De organisatie van haarcellen en ondersteunende cellen werd in deze kweekomstandigheden gehandhaafd. De orgaanculturen op een membraan kunnen tot vijf dagen worden gehandhaafd met behoud van de integriteit van de haarbundel. Dit is te zien in de representatieve afbeelding door de lokalisatie van het tip link eiwit, protocadherine 15.Voor het onderzoeken van de ontwikkeling van de haarbundel kan beeldvorming met een hogere resolutie, zoals superresolutiemicroscopie of scanningelektronenmicroscopie, meer informatie opleveren. Steriele omstandigheden moeten gedurende de hele procedure worden gehandhaafd. Zorg er tijdens het elektropoderen voor dat de embryo's niet uitdrogen.Bij het titreren van farmacologische remmers kan men de concentratie verlagen om eventuele letaliteit te overwinnen. Zowel embryo's als explantaten kunnen worden genomen voor beeldvormingsexperimenten. Ofwel door het uitvoeren van realtime video microscoping, of statisch licht confocale elektronenmicroscoping, zoals getoond in het protocol.Gezien het gemak en de toegankelijkheid van het gebruik van kuiken binnenoor explantaten, kunnen we medium door proof screening gebruiken om nieuwe moleculen te identificeren die essentieel zijn voor de regeneratie van haarcellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporatie Aanpak

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Geoptimaliseerd<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Het kweken van kippenembryo&#39;s tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Een roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding techniek voor Intracardiale Hemodynamica Alter in een embryonale Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo&#39;s

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methoden voor de studie van regeneratie in de Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Het creëren van aviaire voorhersenen chimaera's om de gezichtsontwikkeling te beoordelen

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Voeding van commerciële vleeskuikeneieren: een nauwkeurige en reproduceerbare methode om spierontwikkeling en -groei te beïnvloeden

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...