Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
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Wir danken Ihnen für die Unterstützung von NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB und dem Royal National Institute for the Deaf. Wir möchten uns bei der Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru, bedanken. Wir danken dem CIFF und der EM-Einrichtung und der Laborunterstützung bei NCBS. Wir danken Yoshiko Takahashi und Koichi Kawakami für die Tol2-eGFP- und T2TP-Konstrukte und Guy Richardson für HCA und G19 Pcdh15-Antikörper. Wir danken den Earlab-Mitgliedern für ihre ständige Unterstützung und ihr wertvolles Feedback zum Protokoll.

Protokolle, die die Beschaffung, Kultur und Verwendung von befruchteten Hühnereiern und nicht geschlüpften Embryonen beinhalten, wurden von der Institutional Animal Ethics Committee des National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka, genehmigt.
1. Bei der Elektroporation von Gehörvorläufern von Küken
<ol><li>sgRNA-Design und Klonierung für CRISPR/Cas9-Gen-Knockout<ol><li>Um Gen-Knockouts zu erzeugen, entwerfen Sie RNAs, um die Exon-Regionen des ...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. 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How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. 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P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. 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M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

Das Küken ist eine kostengünstige und bequeme Ergänzung zu den Modellorganismen, mit denen ein Labor das Innenohr erforschen kann. Die hier beschriebenen Methoden werden routinemäßig in unserem Labor eingesetzt und ergänzen die laufende Forschung im Innenohr von Säugetieren. In der Ovo wird Elektroporation verwendet, um genetische Manipulationen in das Kükengenom einzuführen. Die Elektroporation kann auch verwendet werden, um Konstrukte einzuführen, die fluoreszierende Proteine kodieren, die auf bestim...

Das Innenohr aller Wirbeltiere leitet sich von einem einfachen Epithel ab, das als otische Placode 1,2 bekannt ist. Dadurch entstehen alle strukturellen Elemente und Zelltypen, die notwendig sind, um die mechanosensorischen Informationen zu übertragen, die mit dem Hören und der Gleichgewichtswahrnehmung verbunden sind. Haarzellen (HCs), der Flimmersensor des Innenohrs, sind von Stützzellen (SCs) umgeben. HCs leiten Informationen über die Neuronen des achten Hirnnervs an das auditorische Hinterhirn weiter. Diese werden ebenfalls aus dem otischen Placode3 generiert. Die primäre Schalltransduktion wird an der apikalen Oberfläche des auditorischen HC durch ein mechanisch empfindliches Haarbündel4 erreicht. Dies wird durch modifizierte Aktin-basierte Vorsprünge, sogenannte Stereozilien, vermittelt, die in einem abgestuften Treppenmusterangeordnet sind 5. Darüber hinaus organisiert ein modifiziertes primäres Zilium, das sogenannte Kinocilium, die Haarbündelbildung und grenzt an die höchste Reihe von Stereozilien 6,7,8. Die Architektur der Stereozilien ist entscheidend für diese Rolle bei der Umwandlung mechanischer Reize, die von akustischer Energie in elektrische neuronale Signale abgeleitet werden9. Eine Schädigung des auditiven HC durch Alterung, Infektion, otoakustisches Trauma oder ototoxischer Schock kann zu einem teilweisen oder vollständigen Hörverlust führen, der bei Säugetieren irreversibel ist10.
Es wurden zelluläre Ersatztherapien vorgeschlagen, die solche Schäden reparieren könnten11,12. Der Ansatz dieser Forschung bestand darin, die normale Entwicklung der Haarzelle von Säugetieren zu verstehen und zu fragen, ob Entwicklungsprogramme in vorläuferähnlichen Zellen, die im Innenohr existieren können, wieder aufgenommen werden können13. Ein zweiter Ansatz bestand darin, außerhalb von Säugetieren auf Nicht-Säugetier-Wirbeltiere zu schauen, bei denen eine robuste Regeneration von Gehörhaarzellen stattfindet, wie z.B. Vögel14,15. Bei Vögeln erfolgt die Haarzellregeneration überwiegend durch die Dedifferenzierung einer Stützzelle in einen vorläuferähnlichen Zustand, gefolgt von einer asymmetrischen mitotischen Teilung zur Erzeugung einer Haarzelle und einer Stützzelle16. Darüber hinaus wurde auch eine direkte Differenzierung einer Stützzelle zur Erzeugung einer Haarzelle beobachtet17.
Während die Mechanismen der auditiven Entwicklung von Vögeln signifikante Ähnlichkeiten mit denen von Säugetieren aufweisen, gibt es Unterschiede18. Die HC- und SC-Differenzierung beim Küken-BP ist ab dem embryonalen Tag (E) 7 erkennbar und wird im Laufe der Zeit deutlicher. Durch E12 kann eine gut strukturierte und gut polarisierte Basilarpapille (BP) sichtbar gemacht werden, und durch E17 können gut entwickelte Haarzellen gesehen werden19. Diese Zeitpunkte bieten Fenster in die Mechanismen der Differenzierung, Strukturierung und Polarität sowie in die Reifung der Haarzellen. Es ist wichtig zu verstehen, ob solche Mechanismen konserviert oder divergent sind, da sie Einblicke in die tiefe Homologie der Ursprünge mechanosensorischer Haarzellen geben.
Hier demonstrieren wir eine Reihe von Techniken, die in frühen und späten embryonalen Stadien durchgeführt werden, um zelluläre Prozesse wie Proliferation, Schicksalsspezifikation, Differenzierung, Musterung und Aufrechterhaltung während der gesamten Entwicklung des Innenohrorgans zu untersuchen. Dies ergänzt andere Protokolle zum Verständnis der Innenohrentwicklung in der Explantatkultur20,21,22. Wir diskutieren zunächst die Einführung von exogener DNA oder RNA in BP-Vorläufer innerhalb der E3.5-Otozyste unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation. Obwohl genetische Manipulationen wertvolle Erkenntnisse liefern können, können die so erzeugten Phänotypen pleiotrop und folglich verwirrend sein. Dies gilt insbesondere für die spätere Innenohrentwicklung, wo grundlegende Prozesse wie der Umbau des Zytoskeletts vielfältige Rollen bei der Zellteilung, der Gewebemorphogenese und der zellulären Spezialisierung spielen. Wir präsentieren Protokolle zur pharmakologischen Hemmung in kultivierten Explantaten, die Vorteile bei der Kontrolle von Dosierung und Behandlungszeitpunkt und -dauer bieten und eine präzise raumzeitliche Manipulation von Entwicklungsmechanismen ermöglichen.
Je nach Behandlungsdauer kleiner Inhibitoren können unterschiedliche Organkulturmethoden eingesetzt werden. Hier zeigen wir zwei Methoden der Organkultur, die Einblicke in die epitheliale Morphogenese und zelluläre Spezialisierung ermöglichen. Eine Methode zur 3D-Kultur mit Kollagen als Matrix zur Kultur des Cochlea-Gangs ermöglicht eine robuste Kultivierung und Live-Visualisierung des sich entwickelnden BP. Um die Bildung von Stereozilien zu verstehen, stellen wir eine Membrankulturmethode vor, bei der Epithelgewebe auf einer steifen Matrix kultiviert wird, so dass Aktinvorsprünge frei wachsen können. Beide Methoden ermöglichen die Weiterverarbeitung wie Lebendzellbildgebung, Immunhistochemie, Rasterelektronenmikroskopie (REM), Zellaufzeichnung usw. Diese Techniken bieten eine Roadmap für die effektive Nutzung des Kükens als Modellsystem, um die Entwicklung, Reifung und Regeneration des aviären Gehörepithels zu verstehen und zu manipulieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

Das Innenohr nimmt Geräusche wahr und hält das Gleichgewicht über die Cochlea und den Vorraum aufrecht. Dies geschieht durch die Verwendung eines dedizierten mechanosensorischen Zelltyps, der als Haarzelle bekannt ist. Die Grundlagenforschung im Innenohr hat zu einem tiefen Verständnis geführt, wie die Haarzellen funktionieren und wie Dysregulation zu Hörverlust und Schwindel führen kann. Für diese Forschung war die Maus das herausragende Modellsystem. Mäuse haben jedoch, wie alle Säugetiere, die Fähigkeit verloren, Haarzellen zu ersetzen. Wenn man also versucht, zelluläre Therapien zur Wiederherstellung der Innenohrfunktion zu verstehen, könnten ergänzende Studien an anderen Wirbeltierarten weitere Erkenntnisse liefern. Das auditorische Epithel von Vögeln, die Basilarpapille (BP), ist eine Epithelschicht, die aus mechanosensorischen Haarzellen (HCs) besteht, die von Stützzellen (SCs) interkaliert werden. Obwohl sich die anatomische Architektur der Basilarpapille und der Säugetier-Cochlea unterscheidet, sind die molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung und des Hörens ähnlich. Dies macht die Basilarpapille zu einem nützlichen System nicht nur für vergleichende Studien, sondern auch für das Verständnis der Regeneration. Hier beschreiben wir Sezier- und Manipulationstechniken für das Hühnerinnenohr. Die Technik zeigt genetische und niedermolekulare Hemmungsmethoden, die ein potentes Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung bieten. In diesem Artikel diskutieren wir in Ovo-Elektroporationstechniken, um die Basilarpapille unter Verwendung von CRIPSR-Cas9-Deletionen genetisch zu stören, gefolgt von der Dissektion der Basilarpapille. Wir demonstrieren auch die BP-Organkultur und die optimale Verwendung von Kulturmatrices, um die Entwicklung des Epithels und der Haarzellen zu beobachten.

Im Elektroporationsaufbau kann die Elektrodenpositionierung eine Rolle im Bereich der Transfektion spielen. Die positive Elektrode wird unter das Eigelb und die negative über dem Embryo platziert (Abbildung 1A). Dies führt zu einer höheren GFP-Expression in einem Großteil des Innenohrs und beider vestibulären Organe (Abbildung 1B) und der auditorischen Basilarpapille (Abbildung 1C,D), was die Transfektion best?...

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In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Alter, Infektion und ototoxische Medikamente können eine Degeneration der Haarzellen des Innenohrs verursachen, was bei uns zu Hörverlust führt. Bei Nicht-Säugetier-Wirbeltieren, wie dem Küken, können Haarzellen regeneriert werden. Die hier beschriebenen Techniken nutzen die Kosteneffizienz der Arbeit an Hühnerembryonen, die Leichtigkeit der Embryonengewinnung und die gute Exo-Entwicklung von Gewebeexplantaten.Das Verständnis der Entwicklung und Regeneration der Innenohrhaare von Vögeln kann wichtige Einblicke in Hörverlust und mögliche Therapien liefern, und Explantatkultur kann wichtig sein, um die ototoxischen Wirkungen verschiedener Medikamente zu bewerten. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, beschaffen Sie frisch gelegte Eier und reinigen Sie sie mit 70% Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden. Inkubieren Sie die Eier für 3,5 bis 4 Tage, bei 37 bis 38 Grad Celsius mit 45% Luftfeuchtigkeit.Positionieren Sie den Embryo nach der Inkubation erneut auf die Oberseite des Eigelbs, indem Sie ein Ei für fünf Minuten auf die Seite legen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um ein kleines Loch am oberen und stumpfen Ende des Eies zu machen, durch das eine 21-Gauge-Nadel passieren kann. Entfernen Sie mit einer Fünf-Milliliter-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel zwei Milliliter des Albumins aus einem Loch am stumpfen Ende des Eies.Decken Sie das Loch am stumpfen Ende mit durchsichtigem Klebeband ab. Damit das Eierfenster das durchsichtige Klebeband oben auf der Eierschale anbringt. Halten Sie die Nadeln von der Mikroinjektion aus Standardglaskapillaren mit einem vertikalen Pipettenzieher.Nach dem Ziehen brechen Sie die Kapillarspitze mit einer feinen Pinzette ab, um einen Spitzendurchmesser von etwa 50 Mikrometern mit einem konischen Ende zu erhalten. Für das Gen-Knockout-Experiment mischen Sie die drei Konstrukte, nämlich das Leitplasmid, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP in einem Verhältnis von eins zu eins zu eins mit einem Mikrogramm SP Cas9-Protein, 30% Saccharose und 0,1% schnellem grünen Farbstoff und einem Endvolumen von 10 Mikrolitern. Stellen Sie bei der Elektropolierung mehrerer Plasmide sicher, dass die Endkonzentration der DNA mindestens vier Mikrogramm pro Mikroliter beträgt.Mit Hilfe einer Springbow-Schere um ein zwei Zentimeter langes und 1,5 Zentimeter breites Fenster aufschneiden und den Embryo freilegen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um die Chorionmembranen über dem Embryo zu öffnen und den Zugang zum Embryo zu ermöglichen. Injizieren Sie etwa 200 Nanoliter DNA-Lösungsmischung, um das otische Vesikel zu füllen.Um die Effizienz der Guide-RNA zu bestimmen, wird ein T7-Endonuklease-Assay durchgeführt. Fügen Sie dem Embryo 0,719% Kochsalzlösung hinzu, um den elektrischen Widerstand zu senken und eine Überhitzung zu verhindern. Als nächstes legen Sie die positive Elektrode durch das Loch an der stumpfen Seite des Eies und manövrieren Sie die Elektrode so, dass sie sich unter dem Eigelb befindet.Legen Sie die negative Elektrode über die gefüllte Otozyste. Um das Plasmid mit Elektroporation in das otische Vesikel zu transfizieren, verwenden Sie einen quadratischen Pulsgenerator und wenden Sie fünf Impulse von 25 Volt für jeweils 100 Millisekunden im Abstand von 50 Millisekunden an. Bestimmen Sie die Bedingungen empirisch basierend auf einem individuellen Elektroporationsaufbau.Nach der Elektroporation hydratisieren Sie den Embryo, indem Sie einige Tropfen 0,719% Kochsalzlösung hinzufügen. Verschließen Sie das Ei wieder mit durchsichtigem Klebeband und kehren Sie bei 37 bis 38 Grad Celsius zur weiteren Inkubation in den befeuchteten Inkubator zurück. Desinfizieren Sie den OP-Tisch, den Mikroskoptisch und die Umgebung mit 70% Ethanol und Hitze oder sterilisieren Sie die Mikrodissektionsausrüstung, einschließlich einer minimalen Federbogenschere, einer Mikroküre und zwei Paar feiner Pinzetten.Bereiten Sie die Dissektionsplatten einschließlich einer Glas-Petrischale mit schwarzer Silikonbasis, einer 90-Millimeter-Kunststoff-Petrischale und einer 60-Millimeter-Petrischale vor. Halten Sie gekühltes PBS oder Hanks' ausgewogene Salzlösung, auch bekannt als HBSS, für die Sektion bereit. Knacken Sie das Ei vorsichtig in die 90 Millimeter Petrischale.Identifizieren Sie dann das äußere Ohr des Kükens und übertragen Sie den Kopf auf eine 60-Millimeter-Petrischale, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Als nächstes richten Sie den Embryo mit der Spitze des Schnabels nach innen aus und halten Sie den Schnabel mit einer der fünf Pinzetten Nummer fünf. Schöpfen Sie die Augen mit der zweiten Pinzette Nummer fünf aus.Dann, von rostral zu kaudal, schneiden Sie entlang des Schädels entlang seiner Mittellinie und schöpfen Sie das Gehirn aus. Fügen Sie mehr eiskaltes PBS oder HBSS hinzu und lokalisieren Sie die beiden Otolithen der Lagena als glänzende Strukturen am Ende des Cochlea-Kanals und in der Nähe der Mittellinie. Um zwei Innenohren zu isolieren, schneiden Sie zwischen den beiden Lagenas und weit über und unter der Region.Visualisieren Sie dann unter schräger Beleuchtung die Umrisse des Innenohrs und entfernen Sie Fremdgewebe und den Vorraum. Übertragen Sie die isolierte Cochlea auf eine schwarze Silikongrundplatte mit eiskaltem PBS. Ziehen Sie die knorpelige Cochlea-Kapsel mit einer fünften Pinzette ab, um den Cochlea-Gang zu erhalten.Suchen Sie dann die gewellte Schicht oder das Tegmentum des Cochlea-Gangs und entfernen Sie sie mit einer Pinzette Nummer 55, um die Basilarpapille oder den Blutdruck freizulegen. Als nächstes entfernen Sie die tektoriale Membran, um Haarzellen und Stützzellen mit einer Pinzette Nummer 55 freizulegen. Für die Membrankultur der Basilarpapille nehmen Sie eine Sechs-Well-Gewebekulturplatte und ordnen Sie einen Kulturmembraneinsatz pro Vertiefung an. Ziehen Sie einige Medien in einer 200-Mikroliter-Pipette auf und saugen Sie dann die sezierte Basilarpapille mit einem X-HBSS-Puffer ab.Übertragen Sie die Explantat auf eine Membran und richten Sie sie so aus, dass die Basilarpapille nach oben zeigt und die Haare und Stützzellen von oben sichtbar sind. Sobald die Explantat positioniert ist, saugen Sie den HBSS-Puffer langsam von der Oberfläche der Kulturmembran ab. Dabei wird sich die Explantat an die Kulturmembran anheften.Füllen Sie die Vertiefung der Sechs-Well-Platte, indem Sie 1,2 Milliliter des modifizierten Eagle-Mediums oder DMEM-Kulturmediums von Dulbecco zwischen dem Membraneinsatz und der Brunnenwand hinzufügen. Um die Kollagenkultur des Cochlea-Gangs vorzubereiten, fügen Sie drei Tropfen frisch zubereiteter Kollagenmischung in jede Vertiefung einer Vier-Well-Platte hinzu und übertragen Sie den präparierten Cochlea-Gang auf jeden Kollagentropfen. Inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Kollagenmatrix auszuhärten.Für eine niedermolekulare Behandlung der Kulturen ersetzen Sie die Kulturmedien durch 700 Mikroliter Medien, die mit dem pharmakologischen Modulator wie Penicillin ergänzt sind, und inkubieren Sie die Platten wie zuvor gezeigt. Ersetzen Sie jeden Tag 50% der Kulturmedien. Nach entsprechender Inkubationszeit werden die Nährmedien entfernt und die Explantate für nachgeschaltete Assays verwendet.Im Elektroporationsaufbau führte die korrekte Elektrodenpositionierung zu einer höheren GFP-Expression im Innenohr in beiden vestibulären Organen und zu einer auditiven Basilarpapille, die die Transfektion bestätigte. CRISPR Cas9-vermittelte den Atoh1-Gen-Knockout im Innenohr und führte zum Verlust von Haarzellen. Atoh1-Gen-Knockout über eine Ovo-Elektroporation, gefolgt von Inkubation bis E10, zeigte eine reduzierte Haarzellentwicklung im Vergleich zur leeren Plasmidkontrolle.Obwohl Elektroporation Mosaik ist, konnten elektropolierte Kontrollzellen Haarzellen bilden. In elektropolierten Atoh1-gRNA-Proben zeigten grün fluoreszierende Protein-positive Zellen nie die Marker der Haarzellentwicklung. Die Organkultur der Basilarpapille in einer 3D-Matrix, wie Kollagen und Färbung mit Antikörpern gegen Haarzellantigen, sorgte für die hervorragende Erhaltung der Gewebemorphologie für bis zu fünf Tage.Die Organisation von Haarzellen und Stützzellen wurde unter diesen Kulturbedingungen aufrechterhalten. Die Organkulturen auf einer Membran können bis zu fünf Tage aufrechterhalten werden, während die Integrität des Haarbündels erhalten bleibt. Dies ist im repräsentativen Bild durch die Lokalisation des Tip-Link-Proteins, Protocadherin 15, zu sehen.Um die Entwicklung des Haarbündels zu untersuchen, kann die Bildgebung mit höherer Auflösung, wie die Superauflösungsmikroskopie oder die Rasterelektronenmikroskopie, mehr Informationen liefern. Sterile Bedingungen sollten während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten werden. Achten Sie beim Elektropolieren darauf, dass die Embryonen nicht austrocknen.Bei der Titration pharmakologischer Inhibitoren kann man die Konzentration reduzieren, um jede Letalität zu überwinden. Sowohl Embryonen als auch Explantate können für bildgebende Experimente entnommen werden. Entweder durch Echtzeit-Videomikroskopie oder konfokale Elektronenmikroskopie mit statischem Licht, wie im Protokoll gezeigt.Angesichts der Leichtigkeit und Zugänglichkeit der Verwendung von Hühner-Innenohr-Explantaten können wir Medium durch Proof-Screening verwenden, um neue Moleküle zu identifizieren, die für die Regeneration von Haarzellen unerlässlich sind.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Fütterung von kommerziellen Masthähncheneiern: eine genaue und reproduzierbare Methode, um die Muskelentwicklung und das Muskelwachstum zu beeinflussen

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...