Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

אנו מודים על תמיכה מ-NCBS, TIFR, מענק מחקר מוביל של Infosys-TIFR, DST-SERB והמכון הלאומי המלכותי לחירשים. ברצוננו להודות לארגון פיתוח עופות מרכזי ומכון הכשרה, Hesaraghatta, בנגלור. אנו אסירי תודה לתמיכת המתקן והמעבדה של CIFF ו- EM ב- NCBS. אנו מודים ליושיקו טקהאשי וקויצ'י קוואקאמי על בניית Tol2-eGFP ו- T2TP, ולגיא ריצ'רדסון על נוגדן HCA ו- G19 Pcdh15. אנו מודים לחברי ארלאב על תמיכתם המתמדת והמשוב החשוב שלהם על הפרוטוקול.

פרוטוקולים הכוללים רכישה, תרבית ושימוש בביצי תרנגולות מופרות ובעוברים שלא נקטפו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים של המרכז הלאומי למדעי הביולוגיה, בנגלור, קרנטקה.
1. ב ovo electroporation של מבשרי השמיעה אפרוח
<ol><li>תכנון ושיבוט sgRNA עבור נוקאאוט הגן CRISPR/Cas9<...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+cochlea.">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+links:+genetics+as+the+gateway+to+function.">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).</li><li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined.">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1 (2012).</li><li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like.">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833 (2016).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li><li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research.">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li><li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration.">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li><li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+development+and+regeneration:+similarities+and+differences.">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+fins:+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration.">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future.">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li><li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium.">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear.">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li><li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia,+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate.">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear.">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li><li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+labyrinth:+culture+of+the+chicken+inner+ear.">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li><li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium:+an+explant+culture+model.">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells.">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li><li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear.">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li><li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+avian+embryos.">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+past,+present+and+future.">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li><li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear.">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

הגוזל הוא תוספת חסכונית ונוחה לאורגניזמי המודל שמעבדה עשויה להשתמש בהם כדי לחקור את האוזן הפנימית. השיטות המתוארות כאן משמשות באופן שגרתי במעבדה שלנו ומשלימות מחקר מתמשך באוזן הפנימית של היונקים. ב ovo אלקטרופורציה משמש כדי להציג מניפולציות גנטיות לתוך הגנום אפרוח. אלקטרופורציה יכול...

האוזן הפנימית של כל בעלי החוליות נגזרת מאפיתל פשוט המכונה placodeotic 1,2. זה יוליד את כל האלמנטים המבניים ואת סוגי התאים הדרושים כדי להמיר את המידע mechanosensory הקשורים שמיעה ותפיסת שיווי משקל. תאי השערה (HCs), החיישן הציליאטי של האוזן הפנימית, מוקפים בתאים תומכים (SCs). HCs מעבירים מידע למוח האחורי השמיעתי דרך הנוירונים של עצב הגולגולת השמיני. אלה נוצרים גם מן placode otic3. ההתמרה הראשונית של הצליל מושגת על פני השטח האפיקליים של HC השמיעתי, באמצעות צרור שיער רגיש מכנית4. זה מתווך באמצעות בליטות מבוססות אקטין מותאמות הנקראות סטריאוציליה, המסודרות בתבנית מדרגות מדורגת5. בנוסף, cilium ראשוני שונה, הנקרא kinocilium, מארגן היווצרות צרור שיער והוא צמוד לשורה הגבוהה ביותר של סטריאוציליה 6,7,8. הארכיטקטורה של סטריאוציליה היא קריטית לתפקיד זה בהמרת גירויים מכניים הנגזרים מאנרגיה אקוסטית לאותות עצביים חשמליים9. נזק ל-HC השמיעתי כתוצאה מהזדקנות, זיהום, טראומה אוטואקוסטית או הלם אוטוטוקסי עלול לגרום לליקוי שמיעה חלקי או מלא, שביונקים הוא בלתי הפיך10.
הוצעו טיפולים תחליפיים תאיים שעשויים לתקן נזק כזה11,12. הגישה של מחקר זה הייתה להבין את ההתפתחות התקינה של תאי השערה של יונקים ולשאול אם ניתן להתחיל מחדש תוכניות התפתחות בתאים דמויי אב שעשויים להתקיים בתוך האוזן הפנימית13. גישה שנייה הייתה להסתכל מחוץ ליונקים, אל בעלי חוליות שאינם יונקים שבהם מתרחשת התחדשות חזקה של תאי שערה שמיעתיים, כגון ציפורים14,15. אצל ציפורים, התחדשות תאי השערה מתרחשת בעיקר באמצעות דה-דיפרנציאציה של תא תומך למצב דמוי אב, ולאחר מכן חלוקה מיטוטית אסימטרית ליצירת תא שערה ותאתומך 16. בנוסף, הבחנה ישירה של תא תומך ליצירת תא שערה נצפתה גם17.
בעוד שהמנגנונים של התפתחות שמיעת העופות מראים דמיון משמעותי לזה של יונקים, ישנם הבדלים18. התמיינות HC ו-SC באפרוח BP ניכרת מיום עוברי (E) 7, והופכת מובחנת יותר עם הזמן. על ידי E12, ניתן לדמיין פפילה בזילרית (BP) מעוצבת ומקוטבת היטב, ועל ידי E17 ניתן לראות תאי שיער מפותחים היטב19. נקודות זמן אלה מספקות חלונות למנגנונים של התמיינות, דפוס וקוטביות, כמו גם התבגרות תאי שערה. ההבנה אם מנגנונים כאלה נשמרים או מסתעפים היא חשובה, שכן הם מספקים תובנות על ההומולוגיה העמוקה של מקורות תאי השערה המכנו-חושיים.
כאן אנו מדגימים מגוון טכניקות המבוצעות בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחרים כדי לחקור תהליכים תאיים כגון התפשטות, אפיון גורל, התמיינות בתבניות ותחזוקה לאורך התפתחות איבר האוזן הפנימית. זה משלים פרוטוקולים אחרים על הבנת התפתחות האוזן הפנימית בתרבית explant20,21,22. תחילה נדון בהחדרת דנ"א אקסוגני או רנ"א למבשרי BP בתוך האוטוציסט E3.5 באמצעות אלקטרופורציה של ovo. למרות שמניפולציות גנטיות יכולות לספק תובנות חשובות, הפנוטיפים שנוצרו כך יכולים להיות פליאוטרופיים וכתוצאה מכך מבלבלים. זה נכון במיוחד במהלך התפתחות מאוחרת יותר של האוזן הפנימית, שבה תהליכים בסיסיים כגון שיפוץ ציטוסקטלי ממלאים תפקידים רבים בחלוקת תאים, מורפוגנזה של רקמות והתמחות תאית. אנו מציגים פרוטוקולים לעיכוב פרמקולוגי במרגלים מתורבתים, המציעים יתרונות בשליטה על תזמון ומשך הטיפול והטיפול, ומציעים מניפולציה מרחבית-טמפורלית מדויקת של מנגנוני התפתחות.
ניתן להשתמש בשיטות שונות של תרבית איברים בהתאם למשך הטיפול במעכבים קטנים. כאן אנו מדגימים שתי שיטות של תרבית איברים המאפשרות תובנות על מורפוגנזה אפיתליאלית והתמחות תאית. שיטה לתרבית תלת-ממדית המשתמשת בקולגן כמטריצה לתרבית צינור השבלול מאפשרת התרבות החזקה והדמיה חיה של ה-BP המתפתח. להבנת היווצרות הסטריאוציליה, אנו מציגים שיטת תרבית ממברנה כך שרקמת האפיתל עוברת בתרבית על מטריצה נוקשה המאפשרת לבליטות אקטין לגדול בחופשיות. שתי השיטות מאפשרות עיבוד במורד הזרם כגון הדמיית תאים חיים, אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM), הקלטת תאים וכו '. טכניקות אלה מספקות מפת דרכים לשימוש יעיל בגוזל כמערכת מודל להבנה ולמניפולציה של ההתפתחות, ההבשלה וההתחדשות של אפיתל השמיעה של העופות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

האוזן הפנימית קולטת צלילים ושומרת על איזון באמצעות השבלול והפרוזדור. הוא עושה זאת על ידי שימוש בסוג תא מכניו-חושי ייעודי המכונה תא השערה. מחקר בסיסי באוזן הפנימית הוביל להבנה עמוקה של האופן שבו תאי השערה מתפקדים, וכיצד חוסר ויסות יכול להוביל לליקוי שמיעה ולסחרחורת. לצורך מחקר זה, העכבר היה מערכת המודל הבולטת ביותר. עם זאת, עכברים, כמו כל היונקים, איבדו את היכולת להחליף תאי שערה. לכן, כאשר מנסים להבין טיפולים תאיים לשיקום תפקוד האוזן הפנימית, מחקרים משלימים במינים אחרים של בעלי חוליות יכולים לספק תובנות נוספות. האפיתל השמיעתי של ציפורים, הפפילה הבזילרית (BP), הוא יריעה של אפיתל המורכבת מתאי שערה מכנו-חושיים (HCs) המשולבים על ידי תאים תומכים (SCs). למרות שהארכיטקטורה האנטומית של הפפילה הבזילרית והשבלול של היונקים שונה, המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית והשמיעה דומים. זה הופך את הפפילה הבזילרית למערכת שימושית לא רק למחקרים השוואתיים אלא גם להבנת התחדשות. כאן נתאר טכניקות דיסקציה ומניפולציה לאוזן הפנימית של התרנגולת. הטכניקה מציגה שיטות עיכוב גנטיות ומולקולות קטנות, המציעות כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית. במאמר זה, אנו דנים בטכניקות אלקטרופורציה של ovo כדי להפריע גנטית לפפילה הבזילרית באמצעות מחיקות CRIPSR-Cas9, ולאחר מכן דיסקציה של הפפילה הבזילית. אנו גם מדגימים את תרבית איברי BP ושימוש אופטימלי במטריצות תרבית, כדי לבחון את התפתחות האפיתל ותאי השערה.

במערך האלקטרופורציה, מיקום אלקטרודות יכול למלא תפקיד בתחום הטרנספקציה. האלקטרודה החיובית ממוקמת מתחת לחלמון, והשלילית מעל העובר (איור 1A). התוצאה היא ביטוי GFP גבוה יותר בחלק גדול מהאוזן הפנימית ובשני איברי שיווי המשקל (איור 1B), ופפילה בזילרית שמיעתית (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

גיל, זיהום ותרופות אוטוטוקסיות עלולים לגרום לניוון תאי השערה של האוזן הפנימית, מה שמוביל אצלנו לירידה בשמיעה. אצל בעלי חוליות שאינם יונקים, כגון אפרוח, תאי השערה יכולים להתחדש. הטכניקות המתוארות כאן עושות שימוש בעלות התועלת של עבודה על עוברי אפרוחים, בקלות השגת העוברים ובפיתוח אקסו טוב של צמחי רקמות.הבנת ההתפתחות וההתחדשות של שערות האוזן הפנימית של העופות יכולה לספק תובנות חשובות לגבי ליקוי שמיעה וטיפולים פוטנציאליים, ותרבית צמחים יכולה להיות חשובה להערכת ההשפעות האוטוטוקסיות של תרופות שונות. לפני תחילת הניסוי, רכשו ביצים טריות, ונקו אותן עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום. לדגור על הביצים במשך 3.5 עד 4 ימים, ב 37 עד 38 מעלות צלזיוס עם 45% לחות.לאחר הדגירה, מקם מחדש את העובר לחלק העליון של החלמון, על ידי הנחת ביצית על צדו במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי ליצור חור קטן בחלק העליון והקצה הקהה של הביצה כדי שמחט של 21 מדים תעבור דרכה. בעזרת מזרק של חמישה מיליליטר ומחט של 21 מיליליטר, מוציאים שני מיליליטר של האלבומין מחור בקצה הבוטה של הביצה.מכסים את החור בקצה הקהה באמצעות סרט שקוף. כדי לגרום לחלון הביצה להדביק את הסרט השקוף לחלק העליון של קליפת הביצה. החזיקו את המחטים ממיקרו-הזרקה מנימי זכוכית סטנדרטיים באמצעות מושך פיפטה אנכי.לאחר המשיכה, נתקו את קצה הנימים באמצעות מלקחיים עדינים כדי לקבל קוטר קצה של כ-50 מיקרומטר עם קצה מחודד. עבור ניסוי נוקאאוט הגנים, ערבבו את שלושת המבנים, כלומר פלסמיד המנחה, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP ביחס של אחד לאחד עם מיקרוגרם אחד של חלבון SP Cas9, 30% סוכרוז וצבע ירוק מהיר ב-0.1%, ונפח סופי של 10 מיקרוליטרים. בעת אלקטרופולציה של פלסמידים מרובים, ודא שהריכוז הסופי של הדנ"א הוא לפחות ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר.בעזרת מספריים קפיציים לחתוך פתוח סביב חלון באורך שני סנטימטרים ו 1.5 ס"מ רוחב, ולחשוף את העובר. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הקרומים הכוריוניים מעל העובר, ולאפשר גישה לעובר. להזריק כ-200 ננוליטר נפח של תערובת תמיסות DNA כדי למלא את שלפוחית השקית.כדי לקבוע את יעילות ה- RNA המנחה בצע בדיקת אנדונוקלאז T7. יש להוסיף לעובר טיפות מלח של 0.719% כדי להוריד את ההתנגדות החשמלית ולמנוע התחממות יתר. לאחר מכן, מניחים את האלקטרודה החיובית דרך החור שנעשה בצד הבוטה של הביצה, ומתמרנים את האלקטרודה כך שהיא תהיה מתחת לחלמון.מניחים את האלקטרודה השלילית מעל האוטוציסטה המלאה. כדי להעביר את הפלסמיד לתוך שלפוחית otic עם electroporation, להשתמש מחולל פולסים מרובע, ולהחיל חמש פולסים של 25 וולט במשך 100 אלפיות השנייה כל אחד, 50 אלפיות השנייה זה מזה. קבע את התנאים באופן אמפירי בהתבסס על מערך אלקטרופורציה בודד.לאחר אלקטרופורציה, לחות את העובר על ידי הוספת כמה טיפות של 0.719% מלוחים. אטמו מחדש את הביצה בנייר דבק שקוף, וחזרו לאינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 עד 38 מעלות צלזיוס להמשך הדגירה. יש לחטא את שולחן הניתוחים, שלב המיקרוסקופ והסביבה באמצעות 70% אתנול וחום, או לעקר באלכוהול את ציוד המיקרו-דיסקציה, כולל מספריים קפיציים מינימליים, מיקרו קורט ושני זוגות מלקחיים עדינים.הכינו את צלחות הדיסקציה הכוללות צלחת פטרי זכוכית עם בסיס סיליקון שחור, צלחת פטרי מפלסטיק 90 מילימטר וצלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר. שמור על PBS מקורר או תמיסת מלח מאוזנת של Hanks הידוע גם בשם HBSS מוכן לנתיחות. מפצחים בעדינות את הביצה לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מילימטר.לאחר מכן לזהות את האוזן החיצונית של הגוזל, ולהעביר את הראש לצלחת פטרי 60 מ"מ מלא PBS קר כקרח. לאחר מכן, כוון את העובר כאשר החלק העליון של המקור פונה פנימה, והחזק את המקור באמצעות אחד ממלקחיים מספר חמש. הוציאו את העיניים בעזרת המלקחיים השניים מספר חמש.לאחר מכן, מרוסטרל לקאודל, חותכים לאורך הגולגולת לאורך קו האמצע שלה, ומוציאים את המוח החוצה. הוסיפו עוד PBS קר כקרח, או HBSS, ואתרו את שני האוטוליטים של הלגנה כמבנים מבריקים בקצה צינור השבלול, וקרוב לקו האמצע. כדי לבודד שתי אוזניים פנימיות, חותכים בין שתי הלגנות, והרבה מעל ומתחת לאזור.ואז תחת תאורה אלכסונית לדמיין את קווי המתאר של האוזן הפנימית, ולהסיר רקמות חיצוניות ואת הפרוזדור. העבירו את השבלול המבודד לצלחת בסיס מסיליקון שחור עם PBS קר כקרח. יש לקלף את כמוסת השבלול הסחוסית באמצעות מספר חמש מלקחיים כדי להשיג את צינור השבלול.לאחר מכן אתרו את השכבה הגלית או הטגמנטום של צינור השבלול, והסירו אותה באמצעות מלקחיים מספר 55 כדי לחשוף את הפפילה הבזיליארית או BP. לאחר מכן, הסר את הממברנה הטקטוריאלית כדי לחשוף תאי שערה ותאים תומכים באמצעות מלקחיים מספר 55. עבור תרבית ממברנה של הפפילה הבזילרית, קח צלחת תרבית רקמה של שש בארות, וסדר ממברנת תרבית אחת לכל באר. ציירו כמה מדיות בפיפטה של 200 מיקרוליטר, ואז שאפו את צמח הפפילה הבזילרי המנותח עם חיץ HBSS X אחד.מעבירים את הצמח על קרום, ומכוונים אותו כך שהפאפילה הבזילרית פונה כלפי מעלה, והשיער ותאי התמיכה נראים מלמעלה. ברגע שהדגל ממוקם לשאוף את חיץ HBSS לאט מפני השטח של קרום התרבית. בתהליך זה יתחבר האקסצ'ר לקרום התרבית.מלא את הבאר של צלחת שש הבאר על ידי הוספת 1.2 מיליליטר של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו, או מדיה תרבותית DMEM, בין תוסף הממברנה לדופן הבאר. כדי להכין את תרבית הקולגן של צינור השבלול, הוסיפו שלוש טיפות של תערובת קולגן טרייה לכל באר של צלחת ארבע בארות, והעבירו את צינור השבלול המנותק לכל טיפת קולגן. דגרו את הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו-חמצני כדי לרפא את מטריצת הקולגן.לטיפול במולקולה קטנה של התרביות, החליפו את מדיית התרבית ב-700 מיקרוליטרים של מדיה בתוספת המודולטור הפרמקולוגי, כגון פניצילין, ודגרו על הצלחות כפי שהוכח קודם לכן. החלף 50% מהתקשורת התרבותית מדי יום. לאחר זמן הדגירה המתאים, הסר את מדיית התרבית, והשתמש בצמחים לבדיקות במורד הזרם.במערך האלקטרופורציה, מיקום האלקטרודה הנכון הביא לביטוי GFP גבוה יותר באוזן הפנימית בשני איברי שיווי המשקל, ופפילה בזילרית שמיעתית המאשרת טרנספקציה. קריספר Cas9 תיווך נוקאאוט גן Atoh1 באוזן הפנימית, הביא לאובדן תאי שיער. נוקאאוט של הגן Atoh1 באמצעות אובו-אלקטרופורציה ואחריו דגירה עד ש-E10 הראה התפתחות מופחתת של תאי שיער בהשוואה לבקרת פלסמידים ריקים.אף על פי שאלקטרופורציה היא פסיפס, תאי בקרה אלקטרופואטיים הצליחו ליצור תאי שערה. בדגימות אלקטרופורציה של Atoh1 gRNA, תאים חיוביים של חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים מעולם לא הראו את הסמנים של התפתחות תאי שיער. תרבית האיברים של הפפילה הבזילרית במטריצה תלת-ממדית, כגון, קולגן וכתם עם נוגדנים כנגד אנטיגן תאי שיער סיפקו שימור מצוין של מורפולוגיה של רקמות למשך עד חמישה ימים.ארגון תאי השערה והתאים התומכים נשמרו בתנאי תרבית אלה. ניתן לשמור על תרביות האיברים על הממברנה עד חמישה ימים תוך שמירה על שלמות צרור השיער. ניתן לראות זאת בתמונה הייצוגית על ידי לוקליזציה של חלבון קישור הקצה, פרוטוקדהרין 15.כדי לחקור את התפתחות חבילת השיער, הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, כגון, מיקרוסקופיית סופר-רזולוציה או מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת יכולה לספק מידע נוסף. תנאים סטריליים צריכים להישמר לאורך כל ההליך. בזמן האלקטרופורציה, יש לוודא שהעוברים אינם מתייבשים.כאשר מעכבים פרמקולוגיים, ניתן להפחית את הריכוז כדי להתגבר על כל קטלניות. ניתן לקחת גם עוברים וגם צמחים לניסויים בהדמיה. או על ידי ביצוע מיקרוסקופ וידאו בזמן אמת, או מיקרוסקופ אלקטרונים קונפוקלי אור סטטי, כפי שמוצג בפרוטוקול.בהתחשב בקלות ובנגישות של שימוש בצמחים באוזן הפנימית של אפרוחים, אנו יכולים להשתמש במדיום באמצעות סינון הוכחות כדי לזהות מולקולות חדשות החיוניות להתחדשות תאי השיער.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

באובו האכלה של ביצי ברוילר מסחריות: שיטה מדויקת וניתנת לשחזור המשפיעה על התפתחות השרירים וצמיחתם

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...