Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

NCBS、TIFR、Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant、DST-SERB、および王立国立ろう研究所からの支援に感謝します。バンガロールのヘサラガッタにある中央家禽開発機構および訓練研究所に感謝します。NCBSのCIFFおよびEM施設およびラボのサポートに感謝しています。Tol2-eGFPおよびT2TPコンストラクトを提供してくれた高橋佳子と川上浩一、HCAとG19 Pcdh15抗体についてGuy Richardsonに感謝します。プロトコルに関する絶え間ないサポートと貴重なフィードバックを提供してくれたEarlabメンバーに感謝します。

受精鶏卵と孵化していない胚の調達、培養、使用を含むプロトコルは、カルナータカ州バンガロールの国立生物科学センターの制度的動物倫理委員会によって承認されました。
1. ニワトリ聴覚前駆体の ovo エレクトロポレーション
<ol><li>CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトのためのsgRNA設計とクローニング<ol><li>遺伝子ノックアウトを作成するために、遺伝?...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+cochlea.">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+links:+genetics+as+the+gateway+to+function.">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).</li><li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined.">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1 (2012).</li><li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like.">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833 (2016).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li><li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research.">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li><li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration.">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li><li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+development+and+regeneration:+similarities+and+differences.">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+fins:+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration.">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future.">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li><li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium.">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear.">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li><li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia,+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate.">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear.">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li><li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+labyrinth:+culture+of+the+chicken+inner+ear.">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li><li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium:+an+explant+culture+model.">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells.">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li><li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear.">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li><li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+avian+embryos.">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+past,+present+and+future.">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li><li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear.">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

ひよこは、実験室が内耳の研究に使用できるモデル生物への費用効果が高く便利な追加です。ここで説明されている方法は、私たちの研究室で日常的に使用されており、哺乳類の内耳で進行中の研究を補完します。ovoでは、エレクトロポレーションは、ニワトリゲノムに遺伝子操作を導入するために使用されます。エレクトロポレーションはまた、特定の細胞小器官または細胞内構造?...

すべての脊椎動物の内耳は、耳のプラコード1,2として知られる単純な上皮に由来します。これにより、聴覚とバランスの知覚に関連する機械感覚情報を伝達するために必要なすべての構造要素と細胞型が生じます。内耳の繊毛センサーである有毛細胞(HC)は、支持細胞(SC)に囲まれています。HCは、第8脳神経のニューロンを介して聴覚後脳に情報を中継します。これらも耳プラコード3から生成される。音の一次伝達は、機械的に敏感な毛束4を介して、聴覚HCの頂端表面で達成される。これは、立体繊毛と呼ばれる修飾されたアクチンベースの突起を介して媒介され、それらは傾斜した階段パターン5に配置されています。さらに、キノシリウムと呼ばれる修飾一次繊毛は、毛束形成を組織し、ステレオ繊毛の最も高い列に隣接しています6,7,8。ステレオ繊毛の構造は、音響エネルギーに由来する機械的刺激を電気的神経信号に変換するこの役割にとって重要です9。加齢、感染、耳音響外傷、または耳毒性ショックによる聴覚HCの損傷は、哺乳類では不可逆的な部分的または完全な難聴を引き起こす可能性があります10。
そのような損傷を修復する可能性のある細胞補充療法が提案されている11,12。この研究のアプローチは、哺乳類の有毛細胞の正常な発達を理解し、内耳13内に存在する可能性のある前駆細胞で発生プログラムを再開できるかどうかを尋ねることでした。第2のアプローチは、哺乳類の外側、鳥類などの聴覚有毛細胞の強力な再生が起こる非哺乳類の脊椎動物に目を向けることでした14,15。鳥類では、有毛細胞の再生は、主に支持細胞の前駆細胞様状態への脱分化、続いて非対称有糸分裂によって有毛細胞および支持細胞16を生成することによって起こる。また、有毛細胞を生成する支持細胞の直接分化も認められている17。
鳥類の聴覚発達のメカニズムは哺乳類のそれと有意な類似性を示していますが、違いがあります18。ニワトリBPにおけるHCおよびSC分化は、胚期(E)7日目から明らかになり、時間とともにより明瞭になる。E12によって、よくパターン化され、よく分極された脳底乳頭(BP)を視覚化することができ、E17によって、よく発達した有毛細胞を見ることができます19。これらの時点は、分化、パターン形成、極性、および有毛細胞の成熟のメカニズムへの窓を提供します。このようなメカニズムが保存されているか分岐しているかを理解することは、機械感覚有毛細胞の起源の深い相同性への洞察を提供するため、重要です。
ここでは、内耳器官の発達全体にわたる増殖、運命の特定、分化、パターン形成、維持などの細胞プロセスを研究するために、初期および後期の胚期に実行される一連の技術を示します。これは、外植片培養における内耳の発達を理解するための他のプロトコルを補完するものです20,21,22。まず、Ovoエレクトロポレーションを用いてE3.5耳嚢胞内のBP前駆体に外因性DNAまたはRNAを導入する方法について説明します。遺伝子操作は貴重な洞察を提供することができますが、このようにして生成された表現型は多面的であり、その結果、交絡する可能性があります。これは、細胞骨格リモデリングなどの基本的なプロセスが細胞分裂、組織形態形成、および細胞の特殊化において複数の役割を果たす後期の内耳発達に特に当てはまります。本研究では、外植体培養における薬理阻害のプロトコールを提示し、投与量や治療のタイミングや期間の制御に利点をもたらし、発生機構の正確な時空間操作を提供します。
小さな阻害剤の処理期間に応じて、さまざまな臓器培養方法を利用できます。ここでは、上皮の形態形成と細胞の特殊化に関する洞察を可能にする2つの臓器培養方法を示します。コラーゲンをマトリックスとして蝸牛管を培養する3D培養法は、発達中のBPの堅牢な培養とライブ可視化を可能にします。ステレオ繊毛の形成を理解するために、硬いマトリックス上で上皮組織を培養し、アクチン突起を自由に成長させる膜培養法を紹介します。どちらの方法でも、ライブセルイメージング、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡(SEM)、細胞記録などのダウンストリーム処理が可能です。これらの技術は、鳥類の聴覚上皮の発生、成熟、再生を理解および操作するためのモデルシステムとしてひよこを効果的に使用するためのロードマップを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

内耳は音を知覚し、蝸牛と前庭を使用してバランスを維持します。これは、有毛細胞として知られる専用の機械感覚細胞タイプを使用して行われます。内耳の基礎研究は、有毛細胞がどのように機能するか、そして調節不全がどのように難聴やめまいにつながるかについての深い理解につながりました。この研究では、マウスが卓越したモデルシステムとなっています。しかし、マウスは、すべての哺乳類と同様に、有毛細胞を置き換える能力を失っています。したがって、内耳機能を回復するための細胞療法を理解しようとするとき、他の脊椎動物種での補完的な研究はさらなる洞察を提供する可能性があります。鳥の聴覚上皮である脳底乳頭(BP)は、支持細胞(SC)によって挿入された機械感覚有毛細胞(HC)で構成される上皮のシートです。脳底乳頭と哺乳類の蝸牛の解剖学的構造は異なりますが、内耳の発達と聴覚の分子メカニズムは似ています。これにより、脳底乳頭は比較研究だけでなく、再生を理解するための有用なシステムになります。ここでは、鶏内耳の解剖・操作技術について述べる。この手法は、遺伝的および低分子阻害法を示しており、内耳発生の分子メカニズムを研究するための強力なツールを提供します。本稿では、CRIPSR-Cas9欠失を用いて脳底乳頭を遺伝的に摂動させ、その後脳底乳頭を解剖する ovo エレクトロポレーション技術について議論する。また、BP臓器培養と培養マトリックスの最適な使用を実証し、上皮と有毛細胞の発達を観察します。

エレクトロポレーションのセットアップでは、電極の位置決めがトランスフェクションの領域で役割を果たすことができます。正極は卵黄の下に、負極は胚の上に配置されます(図1A)。これにより、内耳の大部分と両前庭器官(図1B)、および聴覚脳底乳頭(図1C、D)でGFP発現が高くなり、トランスフェクションが確認?...

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In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

ひよこは、さまざまな研究のために費用効果が高く、アクセスしやすく、広く利用可能なモデル生物です。ここでは、鳥類の内耳の発達と再生の根底にある分子メカニズムを理解するための一連のプロトコルが詳述されています。

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

年齢、感染症、耳毒性薬は内耳の有毛細胞の変性を引き起こす可能性があり、それは私たちの中で難聴につながります。ひよこなどの非哺乳類脊椎動物では、有毛細胞を再生することができます。ここで説明する技術は、ニワトリ胚に取り組むことの費用対効果、胚の入手の容易さ、および組織外植片の良好な外出発達を利用している。鳥類の内耳毛の発達と再生を理解することは、難聴と潜在的な治療法に関する重要な洞察を提供することができ、外植片培養は、さまざまな薬物の耳毒性効果を評価するために重要になる可能性があります。実験を開始する前に、産みたての卵を調達し、汚染を防ぐために70%エタノールで洗浄してください。卵を摂氏37〜48度、湿度45%で3.5〜4日間インキュベートします。孵卵後、卵を横に5分間置き、胚を卵黄の上に再配置します。次に、鉗子を使用して卵の上部に小さな穴を開け、21ゲージの針が通過するように卵の端を鈍くします。5ミリリットルの注射器と21ゲージの針を使用して、卵の鈍い端の穴から2ミリリットルのアルブミンを取り除きます。透明なテープを使用して鈍い端の穴を覆います。卵窓を作るには、卵殻の上部に透明なテープを貼り付けます。垂直ピペットプーラーを使用して、標準的なガラス毛細血管からのマイクロインジェクションから針を保持します。引っ張った後、細い鉗子を使用して毛細管先端を切り離し、先細りの端を持つ約50マイクロメートルの先端直径を得る。遺伝子ノックアウト実験では、ガイドプラスミドpcU6.1sgRNA、T2KeGFP、T2TPの3つのコンストラクトを1対1の比率で、1マイクログラムのSP Cas9タンパク質、30%スクロース、0.1%ファストグリーン色素と混合し、最終容量は10マイクロリットルです。複数のプラスミドをエレクトロポレーションする際に、DNAの最終濃度がマイクロリットルあたり少なくとも4マイクログラムであることを確認してください。スプリングボウハサミの助けを借りて、長さ2センチ、幅1.5センチの窓の周りを切り開き、胚を露出させます。次に、鉗子を使用して胚の上にある絨毛膜を開き、胚にアクセスできるようにします。約200ナノリットルのDNA溶液混合物を注入して、耳小胞を満たします。ガイドRNA効率を決定するために、T7エンドヌクレアーゼアッセイを行う。胚に0.719%生理食塩水滴を加えて電気抵抗を下げ、過熱を防ぎます。次に、卵の鈍い側に作られた穴に正極を通し、卵黄の下になるように電極を操作します。満たされた耳嚢胞の上に負極を置きます。エレクトロポレーションでプラスミドを耳小胞にトランスフェクトするには、方形パルス発生器を使用し、25ボルトの5つのパルスをそれぞれ100ミリ秒、50ミリ秒間隔で印加します。個々のエレクトロポレーション設定に基づいて経験的に条件を決定します。エレクトロポレーション後、0.719%生理食塩水を数滴加えて胚を水和させます。卵を透明なテープで再密封し、さらに孵卵するために摂氏37〜38度で加湿インキュベーターに戻します。手術台、顕微鏡ステージ、およびその周辺を70%エタノールと熱、またはアルコールを使用して消毒し、最小限のスプリングボウハサミ、マイクロキュレット、および2組の細かい鉗子を含むマイクロ解剖装置を滅菌します。黒いシリコンベースのガラスペトリ皿、90ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿、および60ミリメートルのペトリ皿を含む解剖プレートを準備します。冷やしたPBSまたはHBSSとしても知られるハンクスのバランスの取れた塩溶液を解剖の準備をしてください。卵を90ミリメートルのペトリ皿にそっと割る。次に、ひよこの外耳を特定し、氷のように冷たいPBSで満たされた60ミリメートルのペトリ皿に頭を移します。次に、くちばしの上部を内側に向けて胚の向きを変え、5番の鉗子の1つを使用してくちばしを保持します。2番目の5番目の鉗子を使用して目をすくい取ります。次に、吻側から尾側まで、正中線に沿って頭蓋骨に沿って切り、脳をすくい取ります。氷のように冷たいPBS(HBSS)を追加し、ラゲナの2つの耳石を光沢のある構造として蝸牛管の端と正中線の近くに配置します。2つの内耳を隔離するには、2つのラゲナの間、および領域の上下を切ります。次に、斜めの照明の下で内耳の輪郭を視覚化し、無関係な組織と前庭を取り除きます。単離した蝸牛を、氷冷PBSを備えた黒色のシリコンベースプレートに移します。5番鉗子を使用して軟骨性蝸牛カプセルを剥がし、蝸牛管を取得します。次に、蝸牛管の起伏のある層または被蓋を見つけ、55番の鉗子を使用してそれを取り除き、脳底乳頭またはBPを露出させます。次に、55番の鉗子を使用して有毛細胞と支持細胞を露出させるために構造膜を取り外します。脳底乳頭の膜培養には、6ウェル組織培養プレートを取り、1ウェルにつき1つの培養膜インサートを配置します。200マイクロリットルのピペットで培地を作成し、解剖した脳底乳頭外植片を1つのX HBSSバッファーで吸引します。外植体を膜に移し、脳底乳頭が上を向くように向きを変え、毛髪と支持細胞が上から見えるようにします。外植体が配置されたら、HBSS緩衝液を培養膜表面からゆっくりと吸引する。このプロセスでは、外植片は培養膜に付着します。メンブレンインサートとウェル壁の間に1.2ミリリットルのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM培養培地)を加えて、6ウェルプレートのウェルを満たします。蝸牛管のコラーゲン培養物を調製するために、新たに調製したコラーゲン混合物を4ウェルプレートの各ウェルに3滴加え、解剖した蝸牛管を各コラーゲン滴に移す。プレートを摂氏37度で10分間インキュベートし、5%二酸化炭素でコラーゲンマトリックスを硬化させます。培養物の低分子処理では、培養培地をペニシリンなどの薬理学的モジュレーターを添加した700マイクロリットルの培地に交換し、前述のようにプレートをインキュベートします。培養液の50%を毎日交換してください。適切なインキュベーション時間の後、培地を除去し、下流アッセイに外植片を使用します。エレクトロポレーションのセットアップでは、正しい電極の位置により、両方の前庭器官の内耳でより高いGFP発現が得られ、聴覚脳底乳頭がトランスフェクションを確認しました。CRISPR Cas9は、内耳におけるAtoh1遺伝子ノックアウトを媒介し、有毛細胞の喪失をもたらした。OvoエレクトロポレーションによるAtoh1遺伝子ノックアウトとそれに続くE10までのインキュベーションは、空のプラスミドコントロールと比較して有毛細胞の発達の減少を示しました。エレクトロポレーションはモザイクであるが、コントロールのエレクトロポレーション細胞は有毛細胞を形成することができた。Atoh1 gRNAエレクトロポレーションサンプルでは、緑色蛍光タンパク質陽性細胞は有毛細胞発生のマーカーを示さなかった。コラーゲンなどの3Dマトリックス中の脳底乳頭の臓器培養は、有毛細胞抗原に対する抗体による染色剤により、最大5日間組織形態の優れた保存を提供しました。有毛細胞および支持細胞の組織は、これらの培養条件において維持された。膜上の臓器培養は、毛束の完全性を維持しながら最大5日間維持することができます。これは、先端リンクタンパク質であるプロトカドヘリン15の局在化によって代表像に見ることができる。毛束の発達を調査するために、超解像顕微鏡や走査型電子顕微鏡などの高解像度イメージングは、より多くの情報を提供することができます。無菌状態は処置を通して維持されるべきです。エレクトロポレーション中は、胚が乾いていないことを確認してください。薬理学的阻害剤を滴定する場合、致死性を克服するために濃度を下げることができます。胚と外植片の両方をイメージング実験のために採取することができます。プロトコルに示されているように、リアルタイムのビデオ顕微鏡、または静的光共焦点電子顕微鏡を実行するかのいずれか。ニワトリ内耳外植片の使用の容易さとアクセスのしやすさを考えると、プルーフスクリーニングを通じて培地を使用して、有毛細胞の再生に不可欠な新しい分子を特定することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em&gt;元オボ</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

最適化された<em&gt;元OVO</em&gt;開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

小説<em&gt;例OVO</emニワトリ胚のシステムで心臓内血行動態を変えるために&gt;バンディングテクニック

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ<em&gt;例OVO</emニワトリ初期胚の&gt;タイムラプスイメージング

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

ラッパムシの再生の研究のための方法

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

顔の発達を評価するための鳥類前脳キメラの作成

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

オヴォで 市販のブロイラー卵の給餌:筋肉の発達と成長に影響を与える正確で再現可能な方法

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...