Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

Vi takker for støtte fra NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB og Royal National Institute for the Deaf. Vi vil gjerne takke Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Vi er takknemlige for CIFF og EM-anlegg og laboratoriestøtte på NCBS. Vi takker Yoshiko Takahashi og Koichi Kawakami for Tol2-eGFP- og T2TP-konstruksjonene, og Guy Richardson for HCA- og G19 Pcdh15-antistoffet. Vi er takknemlige for Earlab-medlemmer for deres konstante støtte og verdifulle tilbakemeldinger på protokollen.

Protokoller som involverer innkjøp, kultur og bruk av befruktede kyllingegg og uutviklede embryoer ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee ved National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.
1. I ovo elektroporering av kylling auditive forløpere
<ol><li>sgRNA design og kloning for CRISPR / Cas9 gen knockout<ol><li>For å lage gen knockouts, design guide RNA for å forstyrre eksonregionene i genet, helst nærmere 5 'enden av kodingsomr?...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+cochlea.">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+links:+genetics+as+the+gateway+to+function.">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).</li><li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined.">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1 (2012).</li><li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like.">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833 (2016).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li><li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research.">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li><li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration.">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li><li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+development+and+regeneration:+similarities+and+differences.">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+fins:+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration.">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future.">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li><li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium.">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear.">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li><li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia,+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate.">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear.">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li><li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+labyrinth:+culture+of+the+chicken+inner+ear.">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li><li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium:+an+explant+culture+model.">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells.">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li><li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear.">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li><li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+avian+embryos.">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+past,+present+and+future.">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li><li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear.">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

Kyllingen er et kostnadseffektivt og praktisk tillegg til modellorganismene som et laboratorium kan bruke til å undersøke det indre øret. Metodene beskrevet her brukes rutinemessig i vårt laboratorium og utfyller pågående forskning i pattedyrets indre øre. I ovo brukes elektroporering til å introdusere genetiske manipulasjoner i kyllinggenomet. Elektroporering kan også brukes til å introdusere konstruksjoner som koder for fluorescerende proteiner rettet mot bestemte organeller eller subcellulære struk...

Det indre øret til alle virveldyr er avledet fra et enkelt epitel kjent som otic placode 1,2. Dette vil gi opphav til alle strukturelle elementer og celletyper som er nødvendige for å transdusere mekanosensorisk informasjon knyttet til hørsel og balanseoppfattelse. Hårceller (HCs), den cilierte sensoren i det indre øret, er omgitt av støtteceller (SCs). HCs videresender informasjon til den hørbare bakhjernen gjennom nevronene i den åttende kranialnerven. Disse genereres også fra otic placode3. Den primære transduksjonen av lyd oppnås på den apikale overflaten av den auditive HC, gjennom en mekanisk følsom hårbunt4. Dette formidles gjennom modifiserte aktinbaserte fremspring kalt stereocilia, som er ordnet i et gradert trappemønster5. I tillegg organiserer en modifisert primær cilium, kalt kinocilium, hårbuntdannelse og ligger ved siden av den høyeste raden av stereocilia 6,7,8. Arkitekturen til stereocilia er kritisk for denne rollen i å konvertere mekaniske stimuli avledet fra akustisk energi til elektriske nevrale signaler9. Skade på hørsels-HC gjennom aldring, infeksjon, otoakustisk traume eller ototoksisk sjokk kan resultere i delvis eller fullstendig hørselstap som hos pattedyr er irreversibelt10.
Cellulære erstatningsterapier har blitt foreslått som kan reparere slike skader11,12. Tilnærmingen til denne forskningen har vært å forstå den normale utviklingen av pattedyrhårcellen og spørre om utviklingsprogrammer kan gjenopptas i stamcellelignende celler som kan eksistere i det indre øret13. En annen tilnærming har vært å se utenfor pattedyr, til ikke-pattedyrvirveldyr der robust regenerering av auditive hårceller finner sted, for eksempel fugler14,15. Hos fugler skjer hårcelleregenerering hovedsakelig gjennom dedifferensiering av en støttecelle til en stamcellelignende tilstand, etterfulgt av asymmetrisk mitotisk deling for å generere en hårcelle og støttecelle16. I tillegg er det også observert direkte differensiering av en støttecelle for å generere en hårcelle17.
Mens mekanismene for aviær auditiv utvikling viser betydelige likheter med pattedyr, er det forskjeller18. HC- og SC-differensiering hos kyllingen BP er tydelig fra embryonal dag (E) 7, og blir tydeligere over tid. Ved E12 kan en velmønstret og godt polarisert basilær papilla (BP) visualiseres, og ved E17 kan velutviklede hårceller ses19. Disse tidspunktene gir vinduer inn i mekanismene for differensiering, mønster og polaritet, samt hårcellemodning. Det er viktig å forstå om slike mekanismer er konserverte eller divergerende, da de gir innsikt i den dype homologien til opprinnelsen til mekanosensoriske hårceller.
Her demonstrerer vi en rekke teknikker utført på tidlige og sene embryonale stadier for å studere cellulære prosesser som spredning, skjebnespesifikasjon, differensiering, mønster og vedlikehold gjennom utviklingen av det indre øreorganet. Dette utfyller andre protokoller for å forstå utviklingen av det indre øret i eksplantkultur20,21,22. Vi diskuterer først introduksjonen av eksogent DNA eller RNA i BP-forløpere i E3.5-otocysten ved bruk i ovo-elektroporering. Selv om genetiske manipulasjoner kan gi verdifull innsikt, kan fenotypene som genereres være pleiotropiske og følgelig forvirrende. Dette gjelder spesielt under senere indre øreutvikling, hvor grunnleggende prosesser som cytoskeletal remodeling spiller flere roller i celledeling, vevmorfogenese og cellulær spesialisering. Vi presenterer protokoller for farmakologisk inhibering i dyrkede eksplanter, som gir fordeler ved å kontrollere dosering og behandlingstidspunkt og varighet, og tilbyr presis spatiotemporal manipulering av utviklingsmekanismer.
Ulike organkulturmetoder kan benyttes avhengig av behandlingsvarigheten av små hemmere. Her demonstrerer vi to metoder for organkultur som gir innsikt i epitelmorfogenese og cellulær spesialisering. En metode for 3D-kultur ved å bruke kollagen som en matrise for å dyrke cochleakanalen muliggjør robust dyrking og levende visualisering av utviklings-BP. For å forstå dannelsen av stereocilia presenterer vi en membrankulturmetode slik at epitelvev dyrkes på en stiv matrise som gjør det mulig for aktinfremspring å vokse fritt. Begge metodene tillater nedstrøms prosessering som levende celleavbildning, immunhistokjemi, skanning elektronmikroskopi (SEM), celleopptak, etc. Disse teknikkene gir et veikart for effektiv bruk av kyllingen som et modellsystem for å forstå og manipulere utviklingen, modningen og regenereringen av aviært hørselsepitel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

Det indre øret oppfatter lyd og opprettholder balanse ved hjelp av sneglehuset og vestibylen. Det gjør dette ved å bruke en dedikert mekanosensorisk celletype kjent som hårcellen. Grunnforskning i det indre øret har ført til en dyp forståelse av hvordan hårcellen fungerer, og hvordan dysregulering kan føre til hørselstap og svimmelhet. For denne forskningen har musen vært det fremste modellsystemet. Imidlertid har mus, som alle pattedyr, mistet evnen til å erstatte hårceller. Således, når man prøver å forstå cellulære terapier for å gjenopprette indre ørefunksjon, kan komplementære studier hos andre vertebratarter gi ytterligere innsikt. Det hørbare epitelet av fugler, basilær papilla (BP), er et epitelark sammensatt av mekanosensoriske hårceller (HCs) interkalert av støtteceller (SCs). Selv om den anatomiske arkitekturen til basilær papilla og pattedyrs cochlea er forskjellige, er de molekylære mekanismene for indre øreutvikling og hørsel like. Dette gjør basilar papilla til et nyttig system for ikke bare komparative studier, men også for å forstå regenerering. Her beskriver vi disseksjons- og manipulasjonsteknikker for kyllingens indre øre. Teknikken viser genetiske og små molekylinhiberingsmetoder, som tilbyr et kraftig verktøy for å studere molekylære mekanismer for indre øreutvikling. I dette papiret diskuterer vi i ovo-elektroporeringsteknikker for genetisk å forstyrre basilær papilla ved bruk av CRIPSR-Cas9-delesjoner, etterfulgt av disseksjon av basilær papilla. Vi demonstrerer også BP-organkultur og optimal bruk av kulturmatriser, for å observere utviklingen av epitelet og hårcellene.

I elektroporeringsoppsettet kan elektrodeposisjonering spille en rolle i transfeksjonsdomenet. Den positive elektroden er plassert under eggeplommen, og den negative over embryoet (figur 1A). Dette resulterer i høyere GFP-uttrykk i mye av det indre øret og begge vestibulære organer (figur 1B) og auditiv basilær papilla (figur 1C, D), som bekrefter transfeksjon.
Ved vurdering av fenoty...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Kyllingen er en kostnadseffektiv, tilgjengelig og allment tilgjengelig modellorganisme for en rekke studier. Her er en rekke protokoller detaljert for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for aviær indre øreutvikling og regenerering.

I Ovo og Ex Ovo metoder for å studere aviær indre øreutvikling

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Alder, infeksjon og ototoksiske stoffer kan forårsake degenerasjon av hårceller i det indre øret, noe som i oss fører til hørselstap. I ikke-pattedyrs vertebrater, som kylling, kan hårceller regenereres. Teknikkene som er beskrevet her, benytter seg av kostnadseffektiviteten ved å jobbe med kyllingembryoer, det enkle å skaffe embryoer og god eksoutvikling av vevseksplanter.Forståelse av utvikling og regenerering av aviært indre ørehår kan gi viktig innsikt i hørselstap og potensielle terapier, og eksplantasjonskultur kan være viktig for å evaluere de ototoksiske effektene av ulike legemidler. Før du starter eksperimentet, må du skaffe nylagte egg og rengjøre dem med 70% etanol for å forhindre forurensning. Inkuber eggene i 3,5 til 4 dager, ved 37 til 38 grader Celsius med 45% fuktighet.Etter inkubasjon, flytt embryoet til toppen av eggeplommen, ved å plassere et egg på siden i fem minutter. Bruk deretter tang for å lage et lite hull øverst og stump ende av egget for en 21 gauge nål å passere gjennom. Ved hjelp av en fem milliliter sprøyte og en 21 gauge nål, fjern to milliliter av albumin fra et hull i den stumpe enden av egget.Dekk hullet i den stumpe enden med klar tape. For å lage eggvinduet, fest det klare båndet til toppen av eggeskallet. Hold nålene fra mikroinjeksjon fra standard glasskapillærer ved hjelp av en vertikal pipettetrekker.Etter trekking, bryt av kapillærspissen med fine tang for å oppnå en spissdiameter på ca. 50 mikrometer med en konisk ende. For genet knockout-eksperimentet, bland de tre konstruksjonene, nemlig guideplasmidet, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP i et en-til-en-forhold med ett mikrogram SP Cas9-protein, 30% sukrose og 0,1% raskt grønt fargestoff, og et endelig volum på 10 mikroliter. Mens du elektropotterer flere plasmider, må du sørge for at den endelige konsentrasjonen av DNA er minst fire mikrogram per mikroliter.Ved hjelp av springbow saks kuttet åpne rundt et to centimeter langt og 1,5 centimeter bredt vindu, og utsett embryoet. Bruk deretter tang for å åpne de korioniske membranene som ligger over embryoet, slik at du får tilgang til embryoet. Injiser rundt 200 nanoliter volum av DNA-løsningsblanding for å fylle den otiske vesikkelen.For å bestemme veiledningen utfører RNA-effektiviteten en T7-endonukleaseanalyse. Tilsett 0,719% saltvannsdråper til embryoet for å senke den elektriske motstanden og forhindre overoppheting. Deretter plasserer du den positive elektroden gjennom hullet som er laget på den stumpe siden av egget, og manøvrerer elektroden slik at den er under eggeplommen.Plasser den negative elektroden over den fylte otocysten. For å transfektere plasmidet inn i den otiske vesikkelen med elektroporering, bruk en firkantet pulsgenerator, og påfør fem pulser på 25 volt i 100 millisekunder hver, 50 millisekunder fra hverandre. Bestem forholdene empirisk basert på et individuelt elektroporeringsoppsett.Etter elektroporering hydrerer du embryoet ved å tilsette noen dråper 0,719% saltvann. Reseal egget med klart tape, og gå tilbake til den fuktede inkubatoren ved 37 til 38 grader Celsius for videre inkubasjon. Desinfiser det kirurgiske bordet, mikroskopstadiet og området rundt ved hjelp av 70% etanol og varme, eller alkohol steriliserer mikrodisseksjonsutstyret, inkludert minimal springbow saks, mikro curet og to par fine tang.Forbered disseksjonsplatene, inkludert et glass petriskål med en svart silikonbase, en 90 millimeter plast petriskål og en 60 millimeter petriskål. Hold kjølt PBS eller Hanks balansert saltløsning, også kjent som HBSS, klar for disseksjoner. Knekk egget forsiktig i 90 millimeter petriskålen.Identifiser deretter kyllingens ytre øre, og overfør hodet til en 60 millimeter petriskål fylt med iskald PBS. Deretter orienterer du embryoet med toppen av nebbet vendt innvendig, og hold nebbet ved hjelp av en av de fem tangene. Øs ut øynene ved hjelp av den andre nummer fem tangen.Deretter, fra rostral til caudal, kutt langs skallen langs midtlinjen, og øs ut hjernen. Legg til mer iskald PBS, eller HBSS, og finn de to otolittene i lagenaen som skinnende strukturer på enden av cochlearkanalen, og nær midtlinjen. For å isolere to indre ører, kutt mellom de to lagenaene, og godt over og under regionen.Deretter visualiserer du omrisset av det indre øret under skrå belysning, og fjerner fremmed vev og vestibulen. Overfør det isolerte sneglehuset til en svart silikonbunnplate med iskald PBS. Fjern den bruskholdige cochleakapselen med tang nummer fem for å oppnå cochleakanalen.Finn deretter det bølgede laget eller tegmentum av cochleakanalen, og fjern det ved hjelp av nummer 55 tang for å eksponere basilær papilla eller BP. Fjern deretter tektorialmembranen for å eksponere hårceller og støtteceller ved hjelp av tang nummer 55. For membrankultur av basilær papilla, ta en seks brønnvevskulturplate, og ordne en kulturmembraninnsats per brønn. Tegn opp noen medier i en 200 mikroliter pipette, og aspirer deretter den dissekerte basilære papilla explant med en X HBSS-buffer.Overfør utstillingen til en membran, og orienter den slik at basilarpapillen vender oppover, og håret og støttecellene er synlige fra toppen. Når eksplanten er plassert, aspirerer HBSS-bufferen sakte fra kulturmembranoverflaten. I denne prosessen vil eksplanten feste seg til kulturmembranen.Fyll opp brønnen på de seks brønnplatene ved å tilsette 1,2 milliliter dulbeccos modifiserte ørnemedium, eller DMEM-kulturmedier, mellom membraninnsatsen og brønnveggen. For å forberede kollagenkulturen i cochlearkanalen, tilsett tre dråper nytilberedt kollagenblanding i hver brønn på en firebrønnsplate, og overfør dissekert cochleakanal til hver kollagendråpe. Inkuber platen i 10 minutter ved 37 grader Celsius, og 5% karbondioksid for å kurere kollagenmatrisen.For en liten molekylbehandling av kulturene, erstatt kulturmediet med 700 mikroliter media supplert med den farmakologiske modulatoren, for eksempel penicillin, og inkuber platene som demonstrert før. Bytt ut 50% av kulturmediene hver dag. Etter passende inkubasjonstid, fjern kulturmediet, og bruk eksplantene for nedstrøms analyser.I elektroporeringsoppsettet resulterte riktig elektrodeposisjonering i høyere GFP-uttrykk i det indre øret i begge vestibulære organer, og auditiv basilær papilla som bekreftet transfeksjon. CRISPR Cas9-mediert Atoh1-genet knockout i det indre øret, resulterte i tap av hårceller. Atoh1 gen knockout via en ovo-elektroporering etterfulgt av inkubasjon til E10 viste redusert hårcelleutvikling sammenlignet med tom plasmidkontroll.Selv om elektroporering er mosaikk, var kontrollelektroporerte celler i stand til å danne hårceller. I Atoh1 gRNA elektroporerte prøver viste grønne fluorescerende proteinpositive celler aldri markørene for hårcelleutvikling. Organkulturen til basilær papilla i en 3D-matrise, som kollagen og flekk med antistoffer mot hårcelleantigen, ga utmerket bevaring av vevsmorfologi i opptil fem dager.Organiseringen av hårceller og støtteceller ble opprettholdt under disse kulturforholdene. Organkulturene på en membran kan opprettholdes i opptil fem dager samtidig som hårbuntens integritet opprettholdes. Dette kan ses i det representative bildet ved lokalisering av spisslinkproteinet, protocadherin 15.For å undersøke utviklingen av hårbunten, kan bildebehandling med høyere oppløsning, for eksempel superoppløsningsmikroskopi eller skanning elektronmikroskopi gi mer informasjon. Sterile forhold bør opprettholdes under hele prosedyren. Mens du elektroponerer, må du sørge for at embryoene ikke tørker ut.Ved titrering av farmakologiske hemmere kan man redusere konsentrasjonen for å overvinne eventuell dødelighet. Både embryoer og eksplanter kan tas for avbildningseksperimenter. Enten ved å utføre sanntids videomikroskopering, eller statisk lys konfokal elektronmikroskopering, som vist i protokollen.Gitt enkelheten og tilgjengeligheten ved å bruke kylling indre øreeksplanter, kan vi bruke medium gjennom bevis screening for å identifisere nye molekyler som er avgjørende for hårcelleregenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimalisert<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrking av Chick embryoer til avanserte stadier av utvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer inn i Chicken hørbar Organ av<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

En novelle<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding Technique Alter Intrakardial hemodynamikken i en Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En Submerged filterpapir Sandwich for Long-term<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging of Early kyllingfoster

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metoder for studier av gjenfødelse Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Opprette Avian Forebrain Chimeras for å vurdere ansiktsutvikling

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

I Ovo Fôring av kommersielle broileregg: En nøyaktig og reproduserbar metode for å påvirke muskelutvikling og vekst

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...