Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
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Agradecemos el apoyo de NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB y el Royal National Institute for the Deaf. Nos gustaría agradecer a la Organización Central de Desarrollo Avícola y al Instituto de Capacitación, Hesaraghatta, Bangalore. Estamos agradecidos con el apoyo de laboratorio y las instalaciones de CIFF y EM en NCBS. Agradecemos a Yoshiko Takahashi y Koichi Kawakami por las construcciones Tol2-eGFP y T2TP, y a Guy Richardson por HCA y el anticuerpo G19 Pcdh15. Agradecemos a los miembros de Earlab por su apoyo constante y valiosos comentarios sobre el protocolo.

Los protocolos relacionados con la obtención, el cultivo y el uso de huevos de gallina fertilizados y embriones no eclosionados fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal del Centro Nacional de Ciencias Biológicas, Bangalore, Karnataka.
1. Electroporación in ovo de precursores auditivos de pollitos
<ol><li>Diseño y clonación de sgRNA para la eliminación del gen CRISPR/Cas9<ol><li>Para crear knockouts genéticos, diseñe ARN guía para inter...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+cochlea.">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+links:+genetics+as+the+gateway+to+function.">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).</li><li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined.">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1 (2012).</li><li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like.">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833 (2016).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li><li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research.">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li><li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration.">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li><li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+development+and+regeneration:+similarities+and+differences.">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+fins:+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration.">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future.">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li><li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium.">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear.">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li><li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia,+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate.">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear.">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li><li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+labyrinth:+culture+of+the+chicken+inner+ear.">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li><li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium:+an+explant+culture+model.">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells.">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li><li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear.">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li><li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+avian+embryos.">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+past,+present+and+future.">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li><li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear.">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

El pollito es una adición rentable y conveniente a los organismos modelo que un laboratorio puede usar para investigar el oído interno. Los métodos descritos aquí se utilizan rutinariamente en nuestro laboratorio y complementan la investigación en curso en el oído interno de los mamíferos. La electroporación in ovo se utiliza para introducir manipulaciones genéticas en el genoma del pollo. La electroporación también puede ser utilizada para introducir constructos que codifican proteínas fluorescentes...

El oído interno de todos los vertebrados se deriva de un epitelio simple conocido como el placode ótico 1,2. Esto dará lugar a todos los elementos estructurales y los tipos de células necesarios para transducir la información mecanosensorial asociada con la audición y la percepción del equilibrio. Las células ciliadas (HC), el sensor ciliado del oído interno, están rodeadas por células de soporte (SC). Los HC transmiten información al cerebro posterior auditivo a través de las neuronas del octavo nervio craneal. Estos también se generan a partir del placa ótica3. La transducción primaria del sonido se logra en la superficie apical de la HC auditiva, a través de un haz de cabello mecánicamente sensible4. Esto está mediado a través de protuberancias modificadas basadas en actina llamadas estereocilios, que están dispuestas en un patrón de escalera gradual5. Además, un cilio primario modificado, llamado kinocilium, organiza la formación del haz capilar y es adyacente a la fila más alta de estereocilios 6,7,8. La arquitectura de los estereocilios es crítica para este papel en la conversión de estímulos mecánicos derivados de la energía acústica en señales neuronales eléctricas9. El daño a la HC auditiva por envejecimiento, infección, trauma otoacústico o shock ototóxico puede resultar en pérdida parcial o completa de la audición que, en los mamíferos, es irreversible10.
Se han propuesto terapias de reemplazo celular que podrían reparar ese daño11,12. El enfoque de esta investigación ha sido comprender el desarrollo normal de las células ciliadas de mamíferos y preguntar si los programas de desarrollo pueden reiniciarse en células progenitoras que pueden existir dentro del oído interno13. Un segundo enfoque ha sido mirar fuera de los mamíferos, a vertebrados no mamíferos en los que se produce una regeneración robusta de las células ciliadas auditivas, como las aves14,15. En las aves, la regeneración de las células ciliadas ocurre predominantemente a través de la desdiferenciación de una célula de soporte a un estado similar al progenitor, seguida de una división mitótica asimétrica para generar una célula ciliada y una célula de soporte16. Además, también se ha observado diferenciación directa de una célula de soporte para generar una célula ciliada17.
Si bien los mecanismos del desarrollo auditivo aviar muestran similitudes significativas con los de los mamíferos, existen diferencias18. La diferenciación de HC y SC en la PA del pollo es evidente desde el día embrionario (E) 7, volviéndose más clara con el tiempo. Para E12, se puede visualizar una papila basilar (PA) bien modelada y bien polarizada, y para E17 se pueden ver células ciliadas bien desarrolladas19. Estos puntos de tiempo proporcionan ventanas a los mecanismos de diferenciación, patrones y polaridad, así como a la maduración de las células ciliadas. Comprender si tales mecanismos se conservan o divergen es importante, ya que proporcionan información sobre la profunda homología de los orígenes de las células ciliadas mecanosensoriales.
Aquí, demostramos una serie de técnicas realizadas en etapas embrionarias tempranas y tardías para estudiar procesos celulares como la proliferación, la especificación del destino, la diferenciación, el patrón y el mantenimiento a lo largo del desarrollo del órgano del oído interno. Esto complementa otros protocolos para comprender el desarrollo del oído interno en el cultivo de explantes20,21,22. Primero discutimos la introducción de ADN o ARN exógeno en precursores de PA dentro del otocisto E3.5 utilizando electroporación in ovo. Aunque las manipulaciones genéticas pueden proporcionar información valiosa, los fenotipos así generados pueden ser pleiotrópicos y, en consecuencia, confusos. Esto es particularmente cierto durante el desarrollo posterior del oído interno, donde los procesos fundamentales como la remodelación citoesquelética desempeñan múltiples funciones en la división celular, la morfogénesis tisular y la especialización celular. Presentamos protocolos de inhibición farmacológica en explantes cultivados, que ofrecen ventajas en el control de la dosis y el tiempo y duración del tratamiento, ofreciendo una manipulación espaciotemporal precisa de los mecanismos de desarrollo.
Se pueden utilizar diferentes métodos de cultivo de órganos dependiendo de la duración del tratamiento de los inhibidores pequeños. Aquí demostramos dos métodos de cultivo de órganos que permiten comprender la morfogénesis epitelial y la especialización celular. Un método para el cultivo 3D utilizando colágeno como matriz para cultivar el conducto coclear permite un cultivo robusto y una visualización en vivo de la PA en desarrollo. Para comprender la formación de estereocilios, presentamos un método de cultivo de membrana tal que el tejido epitelial se cultiva en una matriz rígida que permite que las protuberancias de actina crezcan libremente. Ambos métodos permiten el procesamiento posterior, como imágenes de células vivas, inmunohistoquímica, microscopía electrónica de barrido (SEM), registro celular, etc. Estas técnicas proporcionan una hoja de ruta para el uso efectivo del pollito como un sistema modelo para comprender y manipular el desarrollo, la maduración y la regeneración del epitelio auditivo aviar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

El oído interno percibe el sonido y mantiene el equilibrio utilizando la cóclea y el vestíbulo. Lo hace mediante el uso de un tipo de célula mecanosensorial dedicada conocida como la célula ciliada. La investigación básica en el oído interno ha llevado a una comprensión profunda de cómo funciona la célula ciliada y cómo la desregulación puede conducir a la pérdida de audición y vértigo. Para esta investigación, el ratón ha sido el sistema modelo preeminente. Sin embargo, los ratones, como todos los mamíferos, han perdido la capacidad de reemplazar las células ciliadas. Por lo tanto, al tratar de comprender las terapias celulares para restaurar la función del oído interno, los estudios complementarios en otras especies de vertebrados podrían proporcionar más información. El epitelio auditivo de las aves, la papila basilar (PA), es una lámina de epitelio compuesta de células ciliadas mecanosensoriales (HC) intercaladas por células de soporte (SC). Aunque la arquitectura anatómica de la papila basilar y la cóclea de mamíferos difieren, los mecanismos moleculares del desarrollo del oído interno y la audición son similares. Esto hace que la papila basilar sea un sistema útil no solo para estudios comparativos sino también para comprender la regeneración. Aquí, describimos técnicas de disección y manipulación para el oído interno del pollo. La técnica muestra métodos genéticos y de inhibición de moléculas pequeñas, que ofrecen una potente herramienta para estudiar los mecanismos moleculares del desarrollo del oído interno. En este artículo, discutimos técnicas de electroporación in ovo para perturbar genéticamente la papila basilar utilizando deleciones CRIPSR-Cas9, seguidas de la disección de la papila basilar. También demostramos el cultivo de órganos de PA y el uso óptimo de matrices de cultivo, para observar el desarrollo del epitelio y las células ciliadas.

En la configuración de electroporación, el posicionamiento del electrodo puede desempeñar un papel en el dominio de la transfección. El electrodo positivo se coloca debajo de la yema, y el negativo sobre el embrión (Figura 1A). Esto da como resultado una mayor expresión de GFP en gran parte del oído interno y ambos órganos vestibulares (Figura 1B) y papila basilar auditiva (Figura 1C, D), lo que confirma la ...

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In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

La edad, la infección y los medicamentos ototóxicos pueden causar la degeneración de las células ciliadas del oído interno, lo que en nosotros conduce a la pérdida de audición. En vertebrados no mamíferos, como el pollo, las células ciliadas pueden regenerarse. Las técnicas descritas aquí hacen uso de la rentabilidad de trabajar en embriones de pollo, la facilidad de obtención de embriones y el buen desarrollo exo de los explantes de tejidos.Comprender el desarrollo y la regeneración de los pelos del oído interno aviar puede proporcionar información importante sobre la pérdida auditiva y las posibles terapias, y el cultivo de explantes puede ser importante para evaluar los efectos ototóxicos de varios medicamentos. Antes de comenzar el experimento, obtenga huevos recién puestos y límpielos con etanol al 70% para evitar la contaminación. Incubar los huevos durante 3,5 a 4 días, a 37 a 38 grados centígrados con 45% de humedad.Después de la incubación, vuelva a colocar el embrión en la parte superior de la yema, colocando un huevo de lado durante cinco minutos. Luego, use fórceps para hacer un pequeño orificio en la parte superior y el extremo romo del huevo para que pase una aguja de calibre 21. Con una jeringa de cinco mililitros y una aguja de calibre 21, retire dos mililitros de albúmina de un orificio en el extremo romo del huevo.Cubra el orificio en el extremo romo con cinta transparente. Para hacer que la ventana del huevo fije la cinta transparente a la parte superior de la cáscara del huevo. Sostenga las agujas de la microinyección de capilares de vidrio estándar utilizando un extractor de pipeta vertical.Después de tirar, rompa la punta capilar con pinzas finas para obtener un diámetro de punta de aproximadamente 50 micrómetros con un extremo cónico. Para el experimento de eliminación de genes, mezcle las tres construcciones, a saber, el plásmido guía, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP en una proporción de uno a uno a uno con un microgramo de proteína SP Cas9, 30% de sacarosa y 0.1% de colorante verde rápido, y un volumen final de 10 microlitros. Al electroporar múltiples plásmidos, asegúrese de que la concentración final de ADN sea de al menos cuatro microgramos por microlitro.Con la ayuda de tijeras de arco de resorte, abra alrededor de una ventana de dos centímetros de largo y 1,5 centímetros de ancho, y exponga el embrión. Luego use fórceps para abrir las membranas coriónicas que recubren el embrión, permitiendo el acceso al embrión. Inyecte alrededor de 200 nanolitros de volumen de mezcla de solución de ADN para llenar la vesícula ótica.Para determinar la eficiencia del ARN guía realice un ensayo de endonucleasa T7. Agregue gotas salinas al embrión al 0,719% para reducir la resistencia eléctrica y evitar el sobrecalentamiento. A continuación, coloque el electrodo positivo a través del orificio hecho en el lado romo del huevo y maniobra el electrodo para que quede debajo de la yema.Coloque el electrodo negativo sobre el otocisto lleno. Para transfectar el plásmido en la vesícula ótica con electroporación, use un generador de pulsos cuadrados y aplique cinco pulsos de 25 voltios durante 100 milisegundos cada uno, con 50 milisegundos de diferencia. Determinar las condiciones empíricamente basándose en una configuración de electroporación individual.Después de la electroporación, hidratar el embrión añadiendo unas gotas de solución salina al 0,719%. Vuelva a sellar el huevo con cinta transparente y regrese a la incubadora humidificada a 37 a 38 grados centígrados para su posterior incubación. Desinfecte la mesa quirúrgica, la etapa del microscopio y el área circundante con etanol y calor al 70%, o esterilice con alcohol el equipo de microdisección, incluidas las tijeras mínimamente de resorte, el microcuret y dos pares de pinzas finas.Prepare las placas de disección, incluida una placa de Petri de vidrio con una base de silicona negra, una placa de Petri de plástico de 90 milímetros y una placa de Petri de 60 milímetros. Mantenga PBS refrigerado o la solución salina balanceada de Hanks, también conocida como HBSS, lista para las disecciones. Rompe suavemente el huevo en la placa de Petri de 90 milímetros.Luego identifique la oreja externa del pollito y transfiera la cabeza a una placa de Petri de 60 milímetros llena de PBS helado. A continuación, oriente el embrión con la parte superior del pico mirando hacia adentro, y sostenga el pico con uno de los pinzas número cinco. Saque los ojos con el segundo número cinco fórceps.Luego, de rostral a caudal, corte a lo largo del cráneo a lo largo de su línea media y saque el cerebro. Agregue más PBS helado, o HBSS, y ubique los dos otolitos de la lagena como estructuras brillantes al final del conducto coclear y cerca de la línea media. Para aislar dos oídos internos, corte entre las dos lagenas, y muy por encima y por debajo de la región.Luego, bajo iluminación oblicua, visualice el contorno del oído interno y elimine el tejido extraño y el vestíbulo. Transfiera la cóclea aislada a una placa base de silicona negra con PBS helado. Despegue la cápsula coclear cartilaginosa usando pinzas número cinco para obtener el conducto coclear.Luego localice la capa ondulada o tegmento del conducto coclear, y retírela usando pinzas número 55 para exponer la papila basilar o PA. A continuación, retire la membrana tectorial para exponer las células ciliadas y las células de soporte utilizando fórceps número 55. Para el cultivo por membrana de la papila basilar, tome una placa de cultivo de tejido de seis pocillos y organice un inserto de membrana de cultivo por pocillo. Extraiga algunos medios en una pipeta de 200 microlitros y luego aspire el explante de papila basilar disecado con un tampón X HBSS.Transfiera el explante a una membrana y oriente de modo que la papila basilar mire hacia arriba, y el cabello y las células de soporte sean visibles desde la parte superior. Una vez colocado el explante, aspire el tampón HBSS lentamente desde la superficie de la membrana de cultivo. En este proceso, el explante se unirá a la membrana de cultivo.Llene el pozo de la placa de seis pozos agregando 1.2 mililitros del medio de águila modificado de dulbecco, o medio de cultivo DMEM, entre el inserto de la membrana y la pared del pozo. Para preparar el cultivo de colágeno del conducto coclear, agregue tres gotas de mezcla de colágeno recién preparada en cada pocillo de una placa de cuatro pocillos y transfiera el conducto coclear disecado a cada gota de colágeno. Incubar la placa durante 10 minutos a 37 grados centígrados, y 5% de dióxido de carbono para curar la matriz de colágeno.Para un tratamiento de moléculas pequeñas de los cultivos, reemplazar los medios de cultivo con 700 microlitros de medios suplementados con el modulador farmacológico, como la penicilina, e incubar las placas como se demostró anteriormente. Reemplace el 50% de los medios de cultivo todos los días. Después del tiempo de incubación adecuado, retire los medios de cultivo y utilice los explantes para los ensayos posteriores.En la configuración de electroporación, el posicionamiento correcto del electrodo resultó en una mayor expresión de GFP en el oído interno en ambos órganos vestibulares y en la papila basilar auditiva que confirma la transfección. CRISPR Cas9 medió la eliminación del gen Atoh1 en el oído interno, lo que resultó en la pérdida de células ciliadas. La eliminación del gen Atoh1 a través de una ovo-electroporación seguida de incubación hasta E10 mostró un desarrollo reducido de células ciliadas en comparación con el control de plásmidos vacíos.Aunque la electroporación es mosaico, las células electroporadas de control fueron capaces de formar células ciliadas. En muestras electroporadas de ARNg de Atoh1, las células positivas de proteína fluorescente verde nunca mostraron los marcadores de desarrollo de células ciliadas. El cultivo de órganos de la papila basilar en una matriz 3D, como colágeno y tinción con anticuerpos contra el antígeno de las células ciliadas, proporcionó la excelente preservación de la morfología del tejido durante un máximo de cinco días.La organización de las células ciliadas y las células de soporte se mantuvieron en estas condiciones de cultivo. Los cultivos de órganos en una membrana se pueden mantener hasta por cinco días mientras se mantiene la integridad del haz capilar. Esto se puede ver en la imagen representativa por la localización de la proteína de enlace de punta, protocadherina 15.Para investigar el desarrollo del haz capilar, las imágenes de mayor resolución, como la microscopía de súper resolución o la microscopía electrónica de barrido, pueden proporcionar más información. Las condiciones estériles deben mantenerse durante todo el procedimiento. Mientras electropo, asegúrese de que los embriones no se sequen.Al valorar los inhibidores farmacológicos, se puede reducir la concentración para superar cualquier letalidad. Tanto los embriones como los explantes se pueden tomar para experimentos de imágenes. Ya sea realizando microscopía de video en tiempo real o microscopía electrónica confocal de luz estática, como se muestra en el protocolo.Dada la facilidad y accesibilidad del uso de explantes de oído interno de pollo, podemos usar el medio a través de la detección de prueba para identificar nuevas moléculas esenciales para la regeneración de las células ciliadas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Una novela<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banda Técnica para alterar intracardiaca Hemodinámica en un sistema embrionario de pollo

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

En Ovo Alimentación de huevos de pollos de engorde comerciales: un método preciso y reproducible para afectar el desarrollo y el crecimiento muscular

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...