Name: in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt stöd från NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB och Royal National Institute for the Deaf. Vi vill tacka Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Vi är tacksamma för CIFF och EM-anläggning och labbstöd på NCBS. Vi tackar Yoshiko Takahashi och Koichi Kawakami för Tol2-eGFP- och T2TP-konstruktionerna, och Guy Richardson för HCA- och G19 Pcdh15-antikroppen. Vi är tacksamma mot Earlabs medlemmar för deras ständiga stöd och värdefulla feedback på protokollet.

Protokoll som involverar tillvaratagande, odling och användning av befruktade kycklingägg och oskadade embryon godkändes av Institutional Animal Ethics Committee vid National Center for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.
1. Vid ovo elektroporering av kyckling hörselprekursorer
<ol><li>sgRNA-design och kloning för CRISPR/Cas9-genutslag<ol><li>För att skapa genutslag, designguide RNA för att störa exonregionerna i genen, helst närmare 5'-änden av den...

<ol>
	<li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+inner+ear+development:+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode.">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).</li><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li><li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+cochlea.">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+links:+genetics+as+the+gateway+to+function.">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).</li><li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined.">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li><li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms.">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1 (2012).</li><li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like.">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833 (2016).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li><li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research.">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li><li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration.">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li><li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+development+and+regeneration:+similarities+and+differences.">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+fins:+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration.">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future.">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li><li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium.">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear.">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li><li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments,+stereocilia,+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate.">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear.">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li><li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+labyrinth:+culture+of+the+chicken+inner+ear.">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li><li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium:+an+explant+culture+model.">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo.">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+transformation+with+plasmid+vectors.">Cloning and transformation with plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy.">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li><li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness.">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li><li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1:+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells.">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li><li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells.">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li><li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear.">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li><li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+avian+embryos.">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+past,+present+and+future.">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li><li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear.">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li><li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+web+resources+in+quail.">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312 (2020).</li></ol>

Kycklingen är ett kostnadseffektivt och bekvämt tillskott till modellorganismerna som ett laboratorium kan använda för att undersöka innerörat. De metoder som beskrivs här används rutinmässigt i vårt labb och kompletterar pågående forskning i däggdjurets inneröra. I ovo används elektroporation för att införa genetiska manipuleringar i kycklinggenomet. Elektroporering kan också användas för att introducera konstruktioner som kodar för fluorescerande proteiner riktade mot särskilda organeller...

Innerörat hos alla ryggradsdjur härrör från ett enkelt epitel som kallas den otiska plakoden 1,2. Detta kommer att ge upphov till alla strukturella element och de celltyper som är nödvändiga för att överföra den mekanosensoriska informationen i samband med hörsel- och balansuppfattning. Hårceller (HC), den avkalkade sensorn i innerörat, är omgivna av stödceller (SC). HCs vidarebefordrar information till den auditiva bakhjärnan genom neuronerna i den åttonde kranialnerven. Dessa genereras också från den otiska plakoden3. Den primära transduktionen av ljud uppnås vid den apikala ytan av hörsel-HC, genom en mekaniskt känslig hårbunt4. Detta förmedlas genom modifierade aktinbaserade utsprång som kallas stereocilia, som är ordnade i ett graderat trappmönster5. Dessutom organiserar ett modifierat primärt cilium, kallat kinocilium, hårbuntbildning och ligger intill den högsta raden av stereocilia 6,7,8. Arkitekturen av stereocilia är avgörande för denna roll i att omvandla mekaniska stimuli härledda från akustisk energi till elektriska neurala signaler9. Skador på hörsel-HC genom åldrande, infektion, otoakustiskt trauma eller ototoxisk chock kan leda till partiell eller fullständig hörselnedsättning som hos däggdjur är irreversibel10.
Cellulära ersättningsterapier har föreslagits som kan reparera sådana skador11,12. Tillvägagångssättet för denna forskning har varit att förstå den normala utvecklingen av däggdjurshårcellen och fråga om utvecklingsprogram kan återinitieras i stamfaderliknande celler som kan finnas i innerörat13. Ett andra tillvägagångssätt har varit att titta utanför däggdjur, till ryggradsdjur som inte är däggdjur där robust regenerering av hörselhårceller äger rum, såsom fåglar14,15. Hos fåglar sker hårcellsregenerering huvudsakligen genom dedifferentiering av en stödjande cell till ett stamfaderliknande tillstånd, följt av asymmetrisk mitotisk uppdelning för att generera en hårcell och stödjande cell16. Dessutom har direkt differentiering av en stödjande cell för att generera en hårcell också observerats17.
Medan mekanismerna för aviär hörselutveckling visar betydande likheter med däggdjurens, finns det skillnader18. HC- och SC-differentiering i kyckling-BP framgår av embryonal dag (E) 7 och blir mer distinkt med tiden. Vid E12 kan en välmönstrad och välpolariserad basilarpapilla (BP) visualiseras, och av E17 kan välutvecklade hårceller ses19. Dessa tidpunkter ger fönster in i mekanismerna för differentiering, mönstring och polaritet, liksom hårcellsmognad. Att förstå om sådana mekanismer är bevarade eller divergerande är viktigt, eftersom de ger insikter i den djupa homologin av ursprunget till mekanosensoriska hårceller.
Här demonstrerar vi en rad tekniker som utförs i tidiga och sena embryonala stadier för att studera cellulära processer som spridning, ödesspecifikation, differentiering, mönstring och underhåll under hela utvecklingen av inneröratorganet. Detta kompletterar andra protokoll för att förstå innerörats utveckling i explantkultur20,21,22. Vi diskuterar först införandet av exogent DNA eller RNA i BP-prekursorer inom E3.5-otocysten med användning av ovo-elektroporering. Även om genetiska manipulationer kan ge värdefulla insikter, kan de fenotyper som sålunda genereras vara pleiotropa och följaktligen förvirrande. Detta gäller särskilt under senare utveckling av innerörat, där grundläggande processer som cytoskeletal ombyggnad spelar flera roller i celldelning, vävnadsmorfogenes och cellulär specialisering. Vi presenterar protokoll för farmakologisk hämning i odlade explantor, som erbjuder fördelar när det gäller att kontrollera dosering och behandlingstid och varaktighet, vilket ger exakt spatiotemporal manipulation av utvecklingsmekanismer.
Olika organodlingsmetoder kan användas beroende på behandlingstiden för små hämmare. Här demonstrerar vi två metoder för organkultur som möjliggör insikter i epitelmorfogenes och cellulär specialisering. En metod för 3D-odling som använder kollagen som en matris för att odla den cochleära kanalen möjliggör robust odling och levande visualisering av den utvecklande BP. För att förstå bildandet av stereocilia presenterar vi en membranodlingsmetod så att epitelvävnad odlas på en styv matris som gör det möjligt för aktinutsprång att växa fritt. Båda metoderna tillåter nedströms bearbetning såsom levande cellavbildning, immunohistokemi, svepelektronmikroskopi (SEM), cellinspelning etc. Dessa tekniker ger en färdplan för effektiv användning av kycklingen som ett modellsystem för att förstå och manipulera utvecklingen, mognaden och regenereringen av det aviära hörselepitelet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081061</td>
			<td>High fidelity Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q12135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer Leica EM CPD300</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 Electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM5000B Widefield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum Sterile filtered</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM10701</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM980 Airyscan Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVX10 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYO7A antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>138-1</td>
			<td>Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ16 Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Scissors, 14cm (5.5&#39;&#39;)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-10 Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcU6_1sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92395</td>
			<td>Mini vector with modified chicken U6 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ1500 Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputtre Coater K550X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The MERLIN Compact VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L01205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo and ex ovo methods to study avian inner ear development

Innerörat uppfattar ljud och upprätthåller balans med hjälp av snäckan och vestibulen. Det gör detta genom att använda en dedikerad mekanosensorisk celltyp som kallas hårcellen. Grundforskning i innerörat har lett till en djup förståelse för hur hårcellen fungerar, och hur dysreglering kan leda till hörselnedsättning och svindel. För denna forskning har musen varit det främsta modellsystemet. Möss, som alla däggdjur, har dock förlorat förmågan att ersätta hårceller. Således, när man försöker förstå cellulära terapier för att återställa innerörats funktion, kan kompletterande studier på andra ryggradsdjur ge ytterligare insikter. Fåglarnas hörselepitel, basilarpapillen (BP), är ett epitelark som består av mekanosensoriska hårceller (HC) interkalerade av stödjande celler (SC). Även om den anatomiska arkitekturen hos basilarpapillen och däggdjurssnäckan skiljer sig åt, är de molekylära mekanismerna för innerörats utveckling och hörsel likartade. Detta gör basilarpapillen till ett användbart system för inte bara jämförande studier utan också för att förstå regenerering. Här beskriver vi dissektions- och manipulationstekniker för kycklingens inre öra. Tekniken visar genetiska och småmolekylära hämningsmetoder, som erbjuder ett kraftfullt verktyg för att studera de molekylära mekanismerna för innerörats utveckling. I detta dokument diskuterar vi i ovo-elektroporationstekniker för att genetiskt störa basilarpapillen med hjälp av CRIPSR-Cas9-deletioner, följt av dissektion av basilarpapillen. Vi demonstrerar också BP-organkulturen och optimal användning av odlingsmatriser för att observera utvecklingen av epitelet och hårcellerna.

I elektroporationsinställningen kan elektrodpositionering spela en roll inom transfektionsområdet. Den positiva elektroden placeras under äggulan och negativet ovanför embryot (figur 1A). Detta resulterar i högre GFP-uttryck i stora delar av innerörat och både vestibulära organ (figur 1B) och auditiv basilarpapill (figur 1C,D), vilket bekräftar transfektion.
Vid bedömningen av f...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development at JoVE.com

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Kycklingen är en kostnadseffektiv, tillgänglig och allmänt tillgänglig modellorganism för en mängd olika studier. Här beskrivs en serie protokoll för att förstå de molekylära mekanismerna bakom fåglarnas utveckling och regenerering i innerörat.

I Ovo och Ex Ovo metoder för att studera aviär inre öronutveckling

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Ålder, infektion och ototoxiska läkemedel kan orsaka degenerering av hårceller i innerörat, vilket i oss leder till hörselnedsättning. Hos ryggradsdjur som inte är däggdjur, såsom kyckling, kan hårceller regenereras. De tekniker som beskrivs här utnyttjar kostnadseffektiviteten för att arbeta med kycklingembryon, lättheten att erhålla embryon och god exoutveckling av vävnadsutplanteringar.Att förstå fåglarnas utveckling och regenerering i innerörat kan ge viktiga insikter om hörselnedsättning och potentiella terapier, och explantodling kan vara viktigt för att utvärdera de ototoxiska effekterna av olika läkemedel. Innan du börjar experimentet, skaffa nylagda ägg och rengör dem med 70% etanol för att förhindra kontaminering. Inkubera äggen i 3,5 till 4 dagar, vid 37 till 38 grader Celsius med 45% fuktighet.Efter inkubation, placera embryot till toppen av äggulan genom att placera ett ägg på sin sida i fem minuter. Använd sedan pincett för att göra ett litet hål i den övre och trubbiga änden av ägget för att en 21 gauge nål ska passera igenom. Använd en fem milliliters spruta och en 21 gauge nål, ta bort två milliliter albumin från ett hål i äggets trubbiga ände.Täck hålet i den trubbiga änden med klar tejp. För att få äggfönstret att fästa det klara tejpen på toppen av äggskalet. Håll nålarna från mikroinjektion från vanliga glaskapillärer med en vertikal pipettdragare.Efter att ha dragit, bryt av kapillärspetsen med fina pincett för att få en spetsdiameter på cirka 50 mikrometer med en avsmalnande ände. För genutslagsexperimentet, blanda de tre konstruktionerna, nämligen styrplasmiden, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP i ett-till-ett-till-ett-förhållande med ett mikrogram SP Cas9-protein, 30% sackaros och 0,1% snabbt grönt färgämne och en slutlig volym på 10 mikroliter. Medan du elektroporerar flera plasmider, se till att den slutliga koncentrationen av DNA är minst fyra mikrogram per mikroliter.Med hjälp av springbow sax skärs upp runt ett två centimeter långt och 1,5 centimeter brett fönster och exponerar embryot. Använd sedan pincett för att öppna korionmembranen som ligger över embryot, vilket ger tillgång till embryot. Injicera cirka 200 nanoliter volym DNA-lösningsblandning för att fylla den otiska vesikeln.För att bestämma styr-RNA-effektiviteten utför en T7-endonukleasanalys. Tillsätt 0,719% saltlösningsdroppar till embryot för att sänka det elektriska motståndet och förhindra överhettning. Placera sedan den positiva elektroden genom hålet på äggets trubbiga sida och manövrera elektroden så att den ligger under äggulan.Placera den negativa elektroden över den fyllda otocysten. För att transfektera plasmiden i den otiska vesikeln med elektroporering, använd en fyrkantig pulsgenerator och applicera fem pulser på 25 volt i 100 millisekunder vardera, 50 millisekunder från varandra. Bestäm villkoren empiriskt baserat på en individuell elektroporationsuppsättning.Efter elektroporering, hydrera embryot genom att tillsätta några droppar 0,719% saltlösning. Återförslut ägget med klart tejp och återgå till den fuktade inkubatorn vid 37 till 38 grader Celsius för ytterligare inkubation. Desinficera det kirurgiska bordet, mikroskopsteget och det omgivande området med 70% etanol och värme, eller alkohol sterilisera mikrodissektionsutrustningen, inklusive minimalt springbow sax, mikrocuret och två par fina pincett.Förbered dissektionsplattorna inklusive en petriskål i glas med en svart silikonbas, en 90 millimeter petriskål i plast och en 60 millimeter petriskål. Håll kyld PBS eller Hanks balanserade saltlösning, även känd som HBSS, redo för dissektioner. Knäck försiktigt ägget i 90 millimeters petriskålen.Identifiera sedan kycklingens yttre öra och överför huvudet till en 60 millimeter petriskål fylld med iskall PBS. Orientera sedan embryot med toppen av näbben vänd inuti och håll näbben med en av tången nummer fem. Skopa ut ögonen med hjälp av den andra tången nummer fem.Sedan, från rostral till caudal, skär längs skallen längs dess mittlinje och skopa ut hjärnan. Lägg till mer iskall PBS, eller HBSS, och lokalisera de två otoliterna i lagena som glänsande strukturer i slutet av cochleakanalen och nära mittlinjen. För att isolera två inre öron, skär mellan de två lagenorna och långt över och under regionen.Sedan under sned belysning visualisera konturen av innerörat och ta bort främmande vävnad och vestibulen. Överför den isolerade snäckan till en svart silikonplatta med iskall PBS. Skala bort den broskiga cochleakapseln med hjälp av tång nummer fem för att få fram den cochleära kanalen.Leta sedan upp det böljande skiktet eller tegmentumet i den cochleära kanalen och ta bort det med hjälp av tång nummer 55 för att exponera basilarpapillen eller BP. Ta sedan bort tectorialmembranet för att exponera hårceller och stödceller med hjälp av tång nummer 55. För membrankultur av basilarpapillen, ta en vävnadsodlingsplatta med sex brunnar och ordna en odlingsmembraninsats per brunn. Rita upp lite media i en 200 mikroliter pipett och aspirera sedan den dissekerade basilarpapillen med en X HBSS-buffert.Överför explanten till ett membran och orientera det så att basilarpapillen vetter uppåt och håret och stödcellerna är synliga från toppen. När explanten är placerad aspirerar HBSS-bufferten långsamt från odlingsmembranytan. I denna process kommer explanten att fästa vid odlingsmembranet.Fyll upp brunnen på den sex brunnsplattan genom att tillsätta 1,2 ml dulbeccos modifierade örnmedium, eller DMEM-odlingsmedium, mellan membraninsatsen och brunnsväggen. För att förbereda kollagenkulturen i cochleakanalen, tillsätt tre droppar nyberedd kollagenblandning i varje brunn på en fyra brunnsplatta och överför dissekerad cochleakanal till varje kollagendroppe. Inkubera plattan i 10 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid för att härda kollagenmatrisen.För en liten molekylbehandling av kulturerna, ersätt odlingsmediet med 700 mikroliter media kompletterat med den farmakologiska modulatorn, såsom penicillin, och inkubera plattorna som visats tidigare. Byt ut 50% av kulturmedierna varje dag. Efter lämplig inkubationstid, ta bort odlingsmediet och använd explanterna för nedströmsanalyser.I elektroporationsinställningen resulterade rätt elektrodpositionering i högre GFP-uttryck i innerörat i båda vestibulära organen och auditiv basilarpapilla som bekräftade transfektionen. CRISPR Cas9 medierade Atoh1-genutslag i innerörat, resulterade i förlust av hårceller. Atoh1-genutslag via en ovo-elektroporation följt av inkubation tills E10 visade minskad hårcellsutveckling jämfört med tom plasmidkontroll.Även om elektroporering är mosaik, kunde kontrollelektroporerade celler bilda hårceller. I Atoh1 gRNA-elektroporerade prover visade gröna fluorescerande proteinpositiva celler aldrig markörerna för hårcellsutveckling. Organkulturen hos basilarpapillen i en 3D-matris, såsom kollagen och fläck med antikroppar mot hårcellsantigen gav utmärkt bevarande av vävnadsmorfologi i upp till fem dagar.Organisationen av hårceller och stödjande celler upprätthölls under dessa odlingsförhållanden. Organkulturerna på ett membran kan bibehållas i upp till fem dagar samtidigt som hårbuntens integritet bibehålls. Detta kan ses i den representativa bilden genom lokalisering av spetslänkproteinet, protocadherin 15.För att undersöka utvecklingen av hårbunten kan avbildning med högre upplösning, såsom superupplösningsmikroskopi eller svepelektronmikroskopi, ge mer information. Sterila förhållanden bör bibehållas under hela proceduren. När du elektropogerar, se till att embryona inte torkar ut.Vid titrering av farmakologiska hämmare kan man minska koncentrationen för att övervinna eventuell dödlighet. Både embryon och explanter kan tas för avbildningsexperiment. Antingen genom att utföra videomikroskopering i realtid eller konfokal elektronmikroskopering i statiskt ljus, som visas i protokollet.Med tanke på hur enkelt och tillgängligt det är att använda explanter för kycklingens innerörat kan vi använda medium genom bevisscreening för att identifiera nya molekyler som är viktiga för hårcellsregenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick näthinnor för Primär cellkulturstudier: En<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Tillvägagångssätt

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimerad<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Odling av kycklingembryon till avancerade stadier av utveckling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Genöverföring till kyckling hörselorganet genom<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-elektroporering

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

En novell<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding Teknik Alter Intrakardiell Hemodynamik i en embryonala kyckling System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En nedsänkt filterpapper Sandwich för långsiktigt<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse avbildning av tidig kycklingembryon

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metoder för studier av förnyelse i Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Skapa aviära framhjärnschhimärer för att bedöma ansiktsutveckling

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

I Ovo Matning av kommersiella slaktkycklingägg: En exakt och reproducerbar metod för att påverka muskelutveckling och tillväxt

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...