Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

نود أن نشكر إينيس مولهان على استنساخ التركيبات لإعادة برمجتها، وبولينا شليبيك على الإنتاج الفيروسي، وماجدالينا غوتز وجوديث فيشر-ستيرنجاك على تعليقاتهما على المخطوطة.

يتبع الإجراء التالي المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات في Helmholtz Zentrum Munich وفقا للتوجيه 2010/63/EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية. يرجى التأكد من الامتثال للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات في المؤسسة التي يتم فيها إجراء التشريح.
1. إعداد مواد التشريح والتفكك ...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

الثقافات الأولية للخلايا النجمية الفئران هي نظام نموذج رائع في المختبر لدراسة إعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة. في الواقع ، على الرغم من عزلها في مرحلة ما بعد الولادة ، تعبر الخلايا عن علامات الخلايا النجمية النموذجية 29 ، وتحتفظ بالتعبير عن الجينات النمطية 28,29...

الجهاز العصبي المركزي للثدييات (CNS) معقد للغاية ، ويتكون من مئات أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك عدد كبير من الأنواع الفرعية العصبية المختلفة1،2،3،4،5،6. على عكس الأعضاء أو الأنسجة الأخرى7،8،9 ، فإن الجهاز العصبي المركزي للثدييات لديه قدرة تجديدية محدودة للغاية. فقدان الخلايا العصبية بعد إصابة الدماغ الرضحية أو التنكس العصبي لا رجعة فيه وغالبا ما يؤدي إلى عجز حركي ومعرفي10. بهدف إنقاذ وظائف الدماغ ، تخضع استراتيجيات مختلفة لاستبدال الخلايا العصبية المفقودة لتحقيق مكثف11. من بينها ، تظهر إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الجسدية إلى خلايا عصبية وظيفية كنهج علاجي واعد12. إعادة البرمجة المباشرة ، أو التمايز المتبادل ، هي عملية تحويل نوع خلية متمايزة واحدة إلى هوية جديدة دون المرور عبر حالة تكاثرية وسيطة أو متعددة القدرات13،14،15،16. رائدة من خلال تحديد MyoD1 كعامل كاف لتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا عضلية17,18 ، تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لإعادة برمجة عدة أنواع من الخلايا إلى خلايا عصبية وظيفية19,20,21.
الخلايا النجمية ، وهي أكثر الخلايا الدبقية الكبيرة وفرة في الجهاز العصبي المركزي22,23 ، هي نوع من الخلايا الواعدة بشكل خاص لإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة لعدة أسباب. أولا ، يتم توزيعها على نطاق واسع وبالتساوي عبر الجهاز العصبي المركزي ، مما يوفر مصدرا وفيرا في loco للخلايا العصبية الجديدة. ثانيا ، ترتبط الخلايا النجمية والخلايا العصبية ارتباطا وثيقا من الناحية التنموية ، لأنها تشترك في سلف مشترك أثناء التطور الجنيني ، الخلايا الدبقية الشعاعية24. يبدو أن الأصل الجنيني الشائع لنوعي الخلايا يسهل تحويل الخلايا العصبية مقارنة بإعادة برمجة الخلايا من طبقات جرثومية مختلفة19,21. علاوة على ذلك ، يتم الاحتفاظ أيضا بمعلومات الأنماط الموروثة من قبل الخلايا النجمية من خلال أصلها الدبقي الشعاعي في الخلايا النجمية البالغة25،26،27 ، ويبدو أنها تساهم في توليد الأنواع الفرعية العصبية المناسبة إقليميا28،29،30. وبالتالي ، فإن التحقيق في تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية وفهمه هو جزء مهم من تحقيق الإمكانات الكاملة لهذه التقنية لاستراتيجيات الاستبدال القائمة على الخلايا.
أدى تحويل الخلايا النجمية المستزرعة في المختبر إلى خلايا عصبية إلى العديد من الاختراقات في مجال إعادة البرمجة العصبية المباشرة ، بما في ذلك: i) تحديد عوامل النسخ الكافية لتوليد الخلايا العصبية من الخلايا النجمية 15,19,31 ، ii) تفكك الآليات الجزيئية الناجمة عن عوامل إعادة برمجة مختلفة في نفس السياق الخلوي 32 ، و iii) تسليط الضوء على تأثير الأصل التنموي للخلايا النجمية على تحفيز أنواع فرعية عصبية مختلفة28،29،33. علاوة على ذلك ، كشف التحويل المباشر للخلايا النجمية في المختبر عن العديد من العقبات الرئيسية التي تحد من إعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة 34,35 ، مثل زيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)34 والاختلافات بين بروتيوم الميتوكوندريا للخلايا النجمية والخلايا العصبية 35. وبالتالي ، تدعم هذه الملاحظات بقوة استخدام الثقافات الأولية للخلايا النجمية كنموذج لإعادة البرمجة العصبية المباشرة للتحقيق في العديد من الأسئلة الأساسية في علم الأحياء12 ، المتعلقة بالحفاظ على هوية الخلية ، وحواجز الطرق التي تمنع تغيرات مصير الخلية ، وكذلك دور التمثيل الغذائي في إعادة البرمجة.
نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا النجمية عن الفئران في سن ما بعد الولادة (P) بنقاء عال جدا ، كما يتضح من عزل الخلايا النجمية عن الحبل الشوكي الفئران29. كما نقدم بروتوكولات لإعادة برمجة الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية عن طريق النقل الفيروسي أو نقل بلازميد الحمض النووي. يمكن تحليل الخلايا المعاد برمجتها في 7 أيام بعد النقل (7 DPT) لتقييم جوانب مختلفة ، مثل كفاءة إعادة البرمجة ومورفولوجيا الخلايا العصبية ، أو يمكن الحفاظ عليها في الثقافة لعدة أسابيع ، لتقييم نضجها بمرور الوقت. الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول ليس خاصا بالخلايا النجمية في الحبل الشوكي ويمكن تطبيقه بسهولة لعزل الخلايا النجمية عن مختلف مناطق الدماغ الأخرى ، بما في ذلك المادة الرمادية القشرية والدماغ المتوسط والمخيخ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

إعادة البرمجة العصبية المباشرة هي نهج قوي لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية من مجموعات الخلايا المبتدئة المختلفة دون المرور عبر وسيطات متعددة القدرات. هذه التقنية لا تحمل فقط وعودا كبيرة في مجال نمذجة الأمراض ، لأنها تسمح بتحويل ، على سبيل المثال ، الخلايا الليفية للمرضى الذين يعانون من أمراض تنكسية عصبية إلى خلايا عصبية ، ولكنها تمثل أيضا بديلا واعدا للعلاجات البديلة القائمة على الخلايا. في هذا السياق، كان الاختراق العلمي الرئيسي هو إثبات أن الخلايا غير العصبية المتباينة داخل الجهاز العصبي المركزي، مثل الخلايا النجمية، يمكن تحويلها إلى خلايا عصبية وظيفية في المختبر. ومنذ ذلك الحين، قدمت إعادة البرمجة المباشرة في المختبر للخلايا النجمية إلى خلايا عصبية رؤى جوهرية حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء التحويل القسري للهوية والعقبات التي تمنع إعادة البرمجة الفعالة. ومع ذلك ، يصعب مقارنة نتائج التجارب المختبرية التي أجريت في مختبرات مختلفة بسبب الاختلافات في الطرق المستخدمة لعزل الخلايا النجمية وزراعتها وإعادة برمجتها. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا النجمية واستزراعها بشكل موثوق به مع نقاء عال من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للفئران في سن ما بعد الولادة عن طريق فرز الخلايا المغناطيسية. علاوة على ذلك ، نحن نقدم بروتوكولات لإعادة برمجة الخلايا النجمية المستزرعة في الخلايا العصبية عن طريق النقل الفيروسي أو نقل الحمض النووي. يمكن استخدام هذا البروتوكول المبسط والموحد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحفاظ على هوية الخلية ، وإنشاء هوية عصبية جديدة ، بالإضافة إلى توليد أنواع فرعية عصبية محددة وخصائصها الوظيفية.

عادة ما تصل الثقافات الأولية للخلايا النجمية إلى 80٪ -90٪ من الالتقاء بين 7 إلى 10 أيام بعد فرز وطلاء MAC (الشكل 1B). بشكل عام ، تنتج قارورة واحدة من ثقافة T25 حوالي 1-1.5 × 106 خلايا ، وهو ما يكفي ل 20-30 غطاء عند بذر الخلايا بكثافة 5-5.5 × 104 خلايا لكل بئر. في اليوم التالي للطلاء ، ت...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

هنا نصف بروتوكولا مفصلا لتوليد ثقافات عالية الإثراء من الخلايا النجمية المستمدة من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للفئران بعد الولادة وتحويلها المباشر إلى خلايا عصبية وظيفية عن طريق التعبير القسري عن عوامل النسخ.

عزل وإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة للخلايا النجمية للفئران

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

الخلايا النجمية هي مجموعة ذاتية المنشأ مثيرة للاهتمام لاستهدافها للبرمجة العصبية المباشرة. يوفر هذا البروتوكول تقنية موثوقة لعزل الخلايا النجمية المستزرعة ذات النقاء العالي من مناطق مختلفة أو الجهاز العصبي المركزي. تم تصميم هذا البروتوكول وتحسينه للتحقيق في قدرة الخلايا النجمية على إعادة برمجتها إلى خلايا عصبية وظيفية دون عوامل مربكة مثل الاختلافات في نقاء الخلايا النجمية لمختلف مجموعات الشركات الناشئة.سيتم عرض الإجراء من قبل بوب هيرسباخ ، ما بعد الدكتوراه في المختبر ، وتاتيانا سيمون مساعدة فنية في مختبرنا. للبدء ، ضع جذع فأر القتل الرحيم في طبق بتري 35 ملم واحتفظ به على الجليد. افتح الجلد بالمقص وأزل الفقرة بمقص صغير.ثم استخراج الحبل الشوكي ووضعه في مخزن تشريح مؤقت على الجليد. تحت مجهر تشريح التجسيمي مع تكبير مرتين ، قم بإزالة السحايا من الحبل الشوكي المعزول باستخدام ملقط ونقل أنسجة الحبل الشوكي المشوهة والنظيفة إلى أنبوب C. أضف 50 ميكرولتر من إنزيم P من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية و 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المعد مسبقا إلى كل أنبوب C.قم بعكس الأنابيب C وضعها على جهاز منفصل ساخن لضمان جمع جميع الأنسجة في غطاء الأنبوب. تهرب من الخلايا عن طريق إزالة العمود من الفاصل بإضافة 800 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا النجمية ودفع الخلايا خارج العمود باستخدام المكبس المضمن. خلايا الصفائح في قوارير المزرعة المعدة مسبقا عن طريق إضافة 4.2 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا النجمية مع استكمال 10 نانوغرام لكل ملليلتر من EGF و bFGF.ليس من الضروري تغطية قوارير الثقافة للخلايا النجمية المعزولة عن مناطق الدماغ الأخرى ولكنها توفر ركيزة أفضل للخلايا النجمية المعزولة من الحبل الشوكي. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإجراء مقاعد الخلايا النجمية تحت خزانة السلامة البيولوجية مع مستوى السلامة الأول وقم بإعداد 24 لوحة بئر مع زلات غطاء زجاجي مطلي ب Poly-D-Lysine كما هو موضح في مخطوطة النص.للطلاء ، عزل ستة حبال شوكية من الفئران P2 تنتج حوالي 1 مليون خلية. استنشق الوسائط من قوارير الثقافة T-12.5 التي تحتوي على الخلايا النجمية المستزرعة واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS. افصل الخلايا النجمية عن قارورة الاستزراع بإضافة 0.5 ملليلتر من 0.05٪ من التربسين EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.اضغط برفق على جانب القارورة لإطلاق الخلايا من سطح قارورة المزرعة وتحقق من الانفصال تحت مجهر ساطع باستخدام تكبير 10 مرات. توقف عن التربسيناز باستخدام 2.5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا النجمية وجمع تعليق الخلايا في أنابيب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 300 RCF لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.شفط الخلايا الفائقة وإعادة إرسالها في ملليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا النجمية. احسب تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم أو نظام عد الخلايا الآلي. بناء على عدد الخلايا ، قم بتخفيف تعليق الخلية بوسط الخلايا النجمية الطازج المكمل ب EGF و bFGF بمعدل 10 نانوغرام لكل ملليلتر لكل عامل.أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من 24 لوحة بئر تم إعدادها مسبقا وخلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. تحضير وسط التمايز العصبي عن طريق إضافة ملليلتر واحد B27 الملحق إلى 49 ملليلتر من وسط الثقافة الأساسية. بعد 24 إلى 48 ساعة ، اعتمادا على ما إذا كانت الخلايا قد تم نقلها أو نقلها ، استبدل وسط الخلايا النجمية بوسط تمايز عصبي واحد ملليلتر لكل بئر.زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 9٪ من ثاني أكسيد الكربون. لزيادة كفاءة إعادة البرمجة ، استكمل وسط التمايز العصبي بفورسكولين ودورسومورفين إلى تركيز نهائي من 30 ميكرومولار وميكرومولار واحد على التوالي عند استبدال وسط الخلايا النجمية بوسط التمايز. عند اختيار علاج الخلايا مع فورسكولين ودورسومورفين توفير جرعة ثانية من دورسومورفين بعد يومين من العلاج الأولي.أضف هذا العلاج الثاني مباشرة إلى وسط الثقافة. وصلت الثقافات الأولية للخلايا النجمية إلى 80 إلى 90٪ من الالتقاء بين سبعة إلى 10 أيام بعد فرز الخلايا بمساعدة مغناطيسية وطلائها. في اليوم التالي للطلاء ، تغطي الخلايا عادة 50 إلى 60٪ من سطح انزلاق الغطاء.تألفت الثقافات بشكل رئيسي من الخلايا النجمية في هذه المرحلة ، في حين أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الانفجارات العصبية كانت غائبة تقريبا. في سبعة أيام بعد النقل أو النقل ، كانت الخلايا العصبية المستحثة مميزة بوضوح عن الخلايا النجمية. كانت سوما الخلايا العصبية أصغر من الخلايا النجمية غير المعاد برمجتها لديها عمليات طويلة وكانت إيجابية لعلامة الخلايا العصبية ، بيتا ثلاثة توبولين ، وسلبية لعلامة الخلايا النجمية GFAP.في 21 يوما بعد النقل أو النقل ، كانت العديد من الخلايا العصبية المستحثة قادرة على إطلاق إمكانات العمل وكانت إيجابية للعلامة العصبية الناضجة NeuN والبروتين المشبكي الشامل Synaptophysin. من الضروري تشريح المنطقة ذات الاهتمام بشكل صحيح. تجنب التلوث من الأنسجة المحيطة.يجب توخي الحذر لإزالة السحايا والعقد الجذرية الظهرية من الحبل الشوكي المعزول. يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل الخلايا النجمية عن مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك القشرة الدماغية والدماغ الأوسط الظهري والمخيخ. في المستقبل ، ستسمح لنا هذه التقنية بتوسيع معرفتنا بالخلايا النجمية الإقليمية وإمكانية إعادة برمجتها إلى خلايا عصبية وظيفية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

الفروق بين الجنسين في ماوس الحصين النجمية بعد<em&gt; في المختبر</em&gt; نقص التروية

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

تحليل في الحجم والشكل واتجاهية شبكات من أستروسيتيس إلى جانب

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

في فيفو إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الغلية المقيمة في الخلايا العصبية المشتركة عن طريق الحقن داخل الدماغ من ناقلات الفيروسية

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

في Electroporation الرحمية من متعدد الجينوم التكامل اللون (السحر) علامات لفردية استروقراط الماوس القشرية

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

في المختبر النمذجة للأمراض العصبية باستخدام التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى خلايا السلف العصبية والتمايز إلى الخلايا الفلكية

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...