Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

We willen Ines Mühlhahn bedanken voor het klonen van de constructies voor herprogrammering, Paulina Chlebik voor virale productie en Magdalena Götz en Judith Fischer-Sternjak voor commentaar op het manuscript.

De volgende procedure volgt de richtlijnen voor dierverzorging van het Helmholtz Zentrum München in overeenstemming met de richtlijn 2010/63/EU inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Zorg ervoor dat u voldoet aan de richtlijnen voor dierverzorging van de instelling waar de dissectie wordt uitgevoerd.
1. Voorbereiding van dissectie-, dissociatie- en cultuurmaterialen
OPMERKING: Bereid alle kweekreagenti...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

Primaire culturen van muizenastrocyten zijn een opmerkelijk in vitro modelsysteem om directe neuronale herprogrammering te bestuderen. In feite, ondanks dat ze geïsoleerd zijn in een postnatale fase, brengen cellen typische astrocytenmarkers29 tot expressie, behouden ze de expressie van patroongenen 28,29 en behouden ze het vermogen om zich te vermenigvuldigen, vergelijkbaar met in vivo astrocyten op een vergelijkbare leeftijdvan 38</sup...

Het centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CZS) is zeer complex en bestaat uit honderden verschillende celtypen, waaronder een groot aantal verschillende neuronale subtypen 1,2,3,4,5,6. In tegenstelling tot andere organen of weefsels 7,8,9 heeft het CZS van zoogdieren een zeer beperkt regeneratief vermogen; neuronaal verlies na traumatisch hersenletsel of neurodegeneratie is onomkeerbaar en resulteert vaak in motorische en cognitieve tekorten10. Gericht op het redden van hersenfuncties, worden verschillende strategieën om verloren neuronen te vervangen intensief onderzocht11. Onder hen is directe herprogrammering van somatische cellen in functionele neuronen in opkomst als een veelbelovende therapeutische aanpak12. Directe herprogrammering, of transdifferentiatie, is het proces van het omzetten van een gedifferentieerd celtype in een nieuwe identiteit zonder door een intermediaire proliferatieve of pluripotente toestand te gaan 13,14,15,16. Gepionierd door de identificatie van MyoD1 als een factor die voldoende is om fibroblasten om te zetten in spiercellen 17,18, is deze methode met succes toegepast om verschillende celtypen te herprogrammeren in functionele neuronen 19,20,21.
Astrocyten, de meest voorkomende macroglia in het CZS 22,23, zijn om verschillende redenen een bijzonder veelbelovend celtype voor directe neuronale herprogrammering. Ten eerste zijn ze wijd en gelijkmatig verdeeld over het CZS, wat een overvloedige locobron voor nieuwe neuronen oplevert. Ten tweede zijn astrocyten en neuronen ontwikkelingsmatig nauw verwant, omdat ze een gemeenschappelijke voorouder delen tijdens de embryonale ontwikkeling, de radiale gliacellen24. De gemeenschappelijke embryonale oorsprong van de twee celtypen lijkt neuronale conversie te vergemakkelijken in vergelijking met herprogrammering van cellen uit verschillende kiemlagen19,21. Bovendien wordt patrooninformatie die door astrocyten wordt geërfd door hun radiale glia-oorsprong ook gehandhaafd in volwassen astrocyten 25,26,27, en lijkt het bij te dragen aan het genereren van regionaal geschikte neuronale subtypen 28,29,30. Daarom is het onderzoeken en begrijpen van de omzetting van astrocyten in neuronen een belangrijk onderdeel van het bereiken van het volledige potentieel van deze techniek voor op cellen gebaseerde vervangingsstrategieën.
De omzetting van in vitro gekweekte astrocyten in neuronen heeft geleid tot verschillende doorbraken op het gebied van directe neuronale herprogrammering, waaronder: i) de identificatie van transcriptiefactoren die voldoende zijn om neuronen uit astrocyten te genereren 15,19,31, ii) het ontrafelen van moleculaire mechanismen veroorzaakt door verschillende herprogrammeringsfactoren in dezelfde cellulaire context 32 , en iii) het benadrukken van de impact van de ontwikkelingsoorsprong van de astrocyten op het induceren van verschillende neuronale subtypen 28,29,33. Bovendien ontrafelde in vitro directe conversie van astrocyten verschillende belangrijke hindernissen die directe neuronale herprogrammeringbeperken 34,35, zoals verhoogde reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie34 en verschillen tussen het mitochondriale proteoom van astrocyten en neuronen35. Vandaar dat deze waarnemingen sterk het gebruik van primaire culturen van astrocyten ondersteunen als een model voor directe neuronale herprogrammering om verschillende fundamentele vragen in de biologie te onderzoeken12, gerelateerd aan het onderhoud van de celidentiteit, wegversperringen die veranderingen in het lot van cellen voorkomen, evenals de rol van het metabolisme bij herprogrammering.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om astrocyten te isoleren van muizen op postnatale (P) leeftijd met een zeer hoge zuiverheid, zoals aangetoond door het isoleren van astrocyten uit het muizenmerg29. We bieden ook protocollen om astrocyten te herprogrammeren in neuronen via virale transductie of DNA-plasmidetransfectie. Geherprogrammeerde cellen kunnen worden geanalyseerd op 7 dagen na transductie (7 DPT) om verschillende aspecten te beoordelen, zoals herprogrammeringsefficiëntie en neuronale morfologie, of kunnen gedurende enkele weken in cultuur worden gehouden om hun rijping in de loop van de tijd te beoordelen. Belangrijk is dat dit protocol niet specifiek is voor ruggenmergastrocyten en gemakkelijk kan worden toegepast om astrocyten te isoleren uit verschillende andere hersengebieden, waaronder de corticale grijze stof, middenhersenen en cerebellum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

Directe neuronale herprogrammering is een krachtige benadering om functionele neuronen te genereren uit verschillende startcelpopulaties zonder door multipotente tussenproducten te gaan. Deze techniek houdt niet alleen grote beloften in op het gebied van ziektemodellering, omdat het bijvoorbeeld fibroblasten voor patiënten met neurodegeneratieve ziekten kan omzetten in neuronen, maar vertegenwoordigt ook een veelbelovend alternatief voor celgebaseerde vervangingstherapieën. In deze context was een belangrijke wetenschappelijke doorbraak de demonstratie dat gedifferentieerde niet-neurale cellen in het centrale zenuwstelsel, zoals astrocyten, in vitro konden worden omgezet in functionele neuronen. Sindsdien heeft in vitro directe herprogrammering van astrocyten in neuronen substantiële inzichten opgeleverd in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gedwongen identiteitsconversie en de hindernissen die efficiënte herprogrammering voorkomen. Resultaten van in vitro experimenten uitgevoerd in verschillende laboratoria zijn echter moeilijk te vergelijken vanwege verschillen in de methoden die worden gebruikt om astrocyten te isoleren, te kweken en te herprogrammeren. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om astrocyten met hoge zuiverheid betrouwbaar te isoleren en te kweken uit verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van muizen op postnatale leeftijd via magnetische celsortering. Verder bieden we protocollen om gekweekte astrocyten te herprogrammeren tot neuronen via virale transductie of DNA-transfectie. Dit gestroomlijnde en gestandaardiseerde protocol kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan het behoud van de celidentiteit, de vaststelling van een nieuwe neuronale identiteit, evenals het genereren van specifieke neuronale subtypen en hun functionele eigenschappen.

Primaire culturen van astrocyten bereiken doorgaans 80% -90% confluentie tussen 7 en 10 dagen na MAC-sortering en plating (figuur 1B). Over het algemeen levert een enkele T25-kweekkolf ongeveer 1-1,5 x 106 cellen op, wat voldoende is voor 20-30 coverslips bij het zaaien van cellen met een dichtheid van 5-5,5 x 104 cellen per put. De dag na het plateren bedekken cellen meestal 50% -60% van het coverslipoppervlak (figuur 1C). In dit stadium b...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om sterk verrijkte culturen van astrocyten te genereren die zijn afgeleid van verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van postnatale muizen en hun directe omzetting in functionele neuronen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Isolatie en directe neuronale herprogrammering van muisastryoten

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Astrocyten zijn een interessante autogene populatie om te targeten voor directe neuronale programmering. Dit protocol biedt een betrouwbare techniek om cultuurastrocyten met hoge zuiverheid uit verschillende regio's of het centrale zenuwstelsel te isoleren. Dit protocol is ontworpen en geoptimaliseerd om het vermogen van astrocyten te onderzoeken om te worden geherprogrammeerd in functionele neuronen zonder verstorende factoren zoals verschillen in de zuiverheid van astrocyten van verschillende startup-populaties.Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Bob Hersbach, Postdoc in het lab, en Tatiana Simon een technische assistentie in ons laboratorium. Plaats om te beginnen de romp van een geëuthanaseerde muis in een petrischaaltje van 35 millimeter en houd het op ijs. Open de huid met een schaar en verwijder de wervel met een kleine schaar.Haal vervolgens het ruggenmerg eruit en plaats het in een dissectiebuffer op ijs. Verwijder onder een stereotactische dissectiemicroscoop met twee keer vergroting de hersenvliezen uit het geïsoleerde ruggenmerg met behulp van een tang en breng ontleed en gereinigd ruggenmergweefsel over naar een C-buis. Voeg 50 microliter enzym P uit de neurale weefseldissociatiekit en 30 microliter eerder bereide enzymmix toe aan elke C-buis.Keer de C-buisjes om en plaats ze op een verwarmd gedissocieerd om ervoor te zorgen dat al het weefsel in het deksel van de buis wordt verzameld. Ontwijk cellen door de kolom uit de separator te verwijderen door 800 microliter astrocytenkweekmedium toe te voegen en cellen uit de kolom te duwen met de meegeleverde zuiger. Plaatcellen in de eerder bereide kweekkolven door toevoeging van 4,2 milliliter astrocytenkweekmedium aangevuld met 10 nanogram per milliliter EGF en bFGF.Het is niet nodig om de kweekkolven te coaten voor astrocyten geïsoleerd uit andere hersengebieden, maar het biedt een beter substraat voor astrocyten geïsoleerd uit het ruggenmerg. Kweek de cellen op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voer astrocytenstoelen uit onder een biologische veiligheidskast met een veiligheidsniveau en bereid 24 putplaten voor met Poly-D-Lysine gecoate glazen afdekfolies zoals beschreven in het tekstmanuscript.Isoleer voor plating zes ruggenmerggen van P2-muizen levert ongeveer 1 miljoen cellen op. Aspirateer media uit de T-12.5 kweekkolven met de gekweekte astrocyten en was eenmaal met 1x PBS. Maak de astrocyten los van de kweekkolf door 0,5 milliliter 0,05% trypsine EDTA toe te voegen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.Tik voorzichtig op de zijkant van de kolf om cellen van het oppervlak van de kweekkolf vrij te maken en controleer het losmaken onder een helderveldmicroscoop met behulp van een vergroting van 10 keer. Stop trypsinazatie met 2,5 milliliter astrocytenkweekmedium en verzamel celsuspensie in buizen van 15 milliliter. Centrifugeer bij 300 RCF gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Aspirateer supernatant en resend cellen in een milliliter van astrocyten cultuurmedium. Bereken de celconcentratie met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerd celtelsysteem. Verdun op basis van het aantal cellen de celsuspensie met vers astrocytenmedium aangevuld met EGF en bFGF met 10 nanogram per milliliter per factor.Voeg 500 microliter van de celsuspensie toe aan elk putje van de eerder bereide 24 putplaten en kweekcellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Bereid neuronaal differentiatiemedium voor door één milliliter B27-supplement toe te voegen aan 49 milliliter basiscultuurmedium. Vervang na 24 tot 48 uur, afhankelijk van of cellen zijn getransduceerd of getransfecteerd, astrocytenmedium door één milliliter neuronaal differentiatiemedium per put.Kweek de cellen op 37 graden Celsius met 9% koolstofdioxide. Om de herprogrammeringsefficiëntie te verhogen, vult u het neuronale differentiatiemedium aan met forskoline en dorsomorfine tot een eindconcentratie van respectievelijk 30 micromolair en één micromolair bij het vervangen van het astrocytenmedium door het differentiatiemedium. Wanneer u ervoor kiest om cellen te behandelen met forskoline en dorsomorfine, geef dan een tweede dosis dorsomorfine twee dagen na de eerste behandeling.Voeg deze tweede behandeling direct toe aan het kweekmedium. Primaire culturen van astrocyten bereikten 80 tot 90% confluentie tussen zeven en 10 dagen na magnetische geassisteerde celsortering en plating. De dag na het plateren bedekten cellen meestal 50 tot 60% van het afdekvlakoppervlak.Culturen bestonden in dit stadium voornamelijk uit astrocyten, terwijl andere celtypen zoals neuroblasten vrijwel afwezig waren. Zeven dagen na transductie of transfectie waren geïnduceerde neuronale cellen duidelijk te onderscheiden van astrocyten. De neuronale cel soma was kleiner dan niet-geprogrammeerde Astrocyten had lange processen en was positief voor neuronale marker, beta drie tubuline en negatief voor astrocytenmarker GFAP.21 dagen na transductie of transfectie waren veel geïnduceerde neuronen in staat om actiepotentialen af te vuren en waren ze positief voor de volwassen neuronale marker NeuN en het pan-synaptische eiwit Synaptophysin. Het is essentieel om de regio van belang goed te ontleden. Het vermijden van besmetting door omringend weefsel.Er moet voor worden gezorgd dat de hersenvliezen en de dorsowortelganglia uit het geïsoleerde ruggenmerg worden verwijderd. Deze methode kan worden gebruikt om astrocyten te isoleren uit verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel, waaronder de hersenschors, dorsale middenhersenen en cerebellum. In de toekomst zal deze techniek ons in staat stellen om onze kennis over regionale astrocyten en hun potentieel om te worden geherprogrammeerd tot functionele neuronen uit te breiden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Verschillen in Mouse hippocampus Astrocytes na<em&gt; In-vitro</em&gt; Ischemie

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transcraniële elektrische stimulatie en Intracortical opname in ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analyseren van de grootte, de vorm en de directionaliteit van netwerken van gekoppelde astrocyten

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers om Cortical Mouse Astrocytes te individualiseren

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...