Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Nous tenons à remercier Ines Mühlhahn pour le clonage des constructions pour la reprogrammation, Paulina Chlebik pour la production virale, et Magdalena Götz et Judith Fischer-Sternjak pour les commentaires sur le manuscrit.

La procédure suivante suit les directives de soins aux animaux du Helmholtz Zentrum Munich conformément à la directive 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Veuillez vous assurer de vous conformer aux directives de soins aux animaux de l’établissement où la dissection est effectuée.
1. Préparation du matériel de dissection, de dissociation et de culture
REMARQUE: Préparez tous les réactifs de culture...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

Les cultures primaires d’astrocytes murins sont un système modèle in vitro remarquable pour étudier la reprogrammation neuronale directe. En fait, bien qu’isolées à un stade postnatal, les cellules expriment des marqueurs astrocytaires typiques29, conservent l’expression des gènes de motif 28,29 et maintiennent la capacité de proliférer, semblable aux astrocytes in vivo à un âge comparablede 38 ans....

Le système nerveux central (SNC) des mammifères est très complexe, composé de centaines de types cellulaires différents, y compris un grand nombre de sous-types neuronaux différents 1,2,3,4,5,6. Contrairement à d’autres organes ou tissus 7,8,9, le SNC des mammifères a une capacité de régénération très limitée; La perte neuronale à la suite d’un traumatisme crânien ou d’une neurodégénérescence est irréversible et entraîne souvent des déficits moteurs et cognitifs10. Visant à sauver les fonctions cérébrales, différentes stratégies pour remplacer les neurones perdus font l’objet d’une enquête intense11. Parmi eux, la reprogrammation directe des cellules somatiques en neurones fonctionnels émerge comme une approche thérapeutique prometteuse12. La reprogrammation directe, ou transdifférenciation, est le processus de conversion d’un type de cellule différencié en une nouvelle identité sans passer par un état prolifératif ou pluripotent intermédiaire 13,14,15,16. Pionnière par l’identification de MyoD1 comme facteur suffisant pour convertir les fibroblastes en cellules musculaires17,18, cette méthode a été appliquée avec succès pour reprogrammer plusieurs types de cellules en neurones fonctionnels 19,20,21.
Les astrocytes, la macroglie la plus abondante du SNC22,23, sont un type cellulaire particulièrement prometteur pour la reprogrammation neuronale directe pour plusieurs raisons. Tout d’abord, ils sont largement et uniformément répartis dans le SNC, fournissant une source abondante en loco pour de nouveaux neurones. Deuxièmement, les astrocytes et les neurones sont étroitement liés sur le plan du développement, car ils partagent un ancêtre commun au cours du développement embryonnaire, les cellules gliales radiales24. L’origine embryonnaire commune des deux types de cellules semble faciliter la conversion neuronale par rapport à la reprogrammation des cellules de différentes couches germinales 19,21. En outre, les informations de modelage héritées par les astrocytes à travers leur origine gliale radiale sont également maintenues dans les astrocytes adultes 25,26,27, et semblent contribuer à la génération de sous-types neuronaux 28,29,30 appropriés à la région. Par conséquent, l’étude et la compréhension de la conversion des astrocytes en neurones sont un élément important pour atteindre le plein potentiel de cette technique pour les stratégies de remplacement cellulaires.
La conversion d’astrocytes cultivés in vitro en neurones a conduit à plusieurs percées dans le domaine de la reprogrammation neuronale directe, notamment : i) l’identification de facteurs de transcription suffisants pour générer des neurones à partir d’astrocytes 15,19,31, ii) le démêlage des mécanismes moléculaires déclenchés par différents facteurs de reprogrammation dans le même contexte cellulaire 32 , et iii) mettre en évidence l’impact de l’origine développementale des astrocytes sur l’induction de différents sous-types neuronaux 28,29,33. En outre, la conversion directe in vitro des astrocytes a permis de surmonter plusieurs obstacles majeurs qui limitent la reprogrammation neuronale directe34,35, tels que l’augmentation de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)34 et les différences entre le protéome mitochondrial des astrocytes et des neurones35. Par conséquent, ces observations soutiennent fortement l’utilisation de cultures primaires d’astrocytes comme modèle de reprogrammation neuronale directe pour étudier plusieurs questions fondamentales en biologie12, liées au maintien de l’identité cellulaire, aux obstacles empêchant les changements de destin cellulaire, ainsi qu’au rôle du métabolisme dans la reprogrammation.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour isoler les astrocytes de souris à l’âge postnatal (P) avec une très grande pureté, comme démontré en isolant les astrocytes de la moelle épinière murine29. Nous fournissons également des protocoles pour reprogrammer les astrocytes en neurones par transduction virale ou transfection de plasmides d’ADN. Les cellules reprogrammées peuvent être analysées 7 jours après la transduction (7 DPT) pour évaluer divers aspects, tels que l’efficacité de la reprogrammation et la morphologie neuronale, ou peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs semaines, pour évaluer leur maturation au fil du temps. Il est important de noter que ce protocole n’est pas spécifique aux astrocytes de la moelle épinière et peut être facilement appliqué pour isoler les astrocytes de diverses autres régions du cerveau, y compris la matière grise corticale, le mésencéphale et le cervelet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

La reprogrammation neuronale directe est une approche puissante pour générer des neurones fonctionnels à partir de différentes populations de cellules de départ sans passer par des intermédiaires multipotents. Cette technique est non seulement très prometteuse dans le domaine de la modélisation des maladies, car elle permet de convertir, par exemple, les fibroblastes pour les patients souffrant de maladies neurodégénératives en neurones, mais représente également une alternative prometteuse pour les thérapies de remplacement cellulaires. Dans ce contexte, une percée scientifique majeure a été la démonstration que des cellules non neurales différenciées dans le système nerveux central, telles que les astrocytes, pouvaient être converties en neurones fonctionnels in vitro. Depuis lors, la reprogrammation directe in vitro des astrocytes en neurones a fourni des informations substantielles sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la conversion forcée de l’identité et les obstacles qui empêchent une reprogrammation efficace. Cependant, les résultats d’expériences in vitro réalisées dans différents laboratoires sont difficiles à comparer en raison des différences dans les méthodes utilisées pour isoler, cultiver et reprogrammer les astrocytes. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler et cultiver de manière fiable des astrocytes de haute pureté provenant de différentes régions du système nerveux central de souris à des âges postnatals via le tri de cellules magnétiques. De plus, nous fournissons des protocoles pour reprogrammer les astrocytes cultivés en neurones par transduction virale ou transfection de l’ADN. Ce protocole rationalisé et standardisé peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents au maintien de l’identité cellulaire, à l’établissement d’une nouvelle identité neuronale, ainsi qu’à la génération de sous-types neuronaux spécifiques et à leurs propriétés fonctionnelles.

Les cultures primaires d’astrocytes atteignent généralement une confluence de 80 % à 90 % entre 7 et 10 jours après le tri et le placage de la MAC (figure 1B). Généralement, une seule fiole de culture T25 donne environ 1-1,5 x 106 cellules, ce qui est suffisant pour 20-30 couvertures lors de l’ensemencement de cellules à une densité de 5-5,5 x 104 cellules par puits. Le lendemain du placage, les cellules couvrent généralement 50 % à 60 % de la surface du ...

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Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour générer des cultures hautement enrichies d’astrocytes dérivés de différentes régions du système nerveux central de souris postnatales et leur conversion directe en neurones fonctionnels par l’expression forcée de facteurs de transcription.

Isolement et reprogrammation neuronale directe des astrocytes de souris

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Les astrocytes sont une population autogène intéressante à cibler pour la programmation neuronale directe. Ce protocole fournit une technique fiable pour isoler les astrocytes de culture de haute pureté de différentes régions ou du système nerveux central. Ce protocole est conçu et optimisé pour étudier la capacité des astrocytes à être reprogrammés en neurones fonctionnels sans facteurs de confusion tels que les différences de pureté des astrocytes de différentes populations de démarrage.La démonstration de la procédure sera effectuée par Bob Hersbach, postdoc au laboratoire, et Tatiana Simon, une assistance technique dans notre laboratoire. Pour commencer, placez le torse d’une souris euthanasiée dans une boîte de Petri de 35 millimètres et gardez-la sur de la glace. Ouvrez la peau avec des ciseaux et retirez la vertèbre avec de petits ciseaux.Ensuite, extrayez la moelle épinière et placez-la dans un tampon de dissection sur de la glace. Sous un microscope à dissection stéréotaxique avec un grossissement de deux fois, retirer les méninges de la moelle épinière isolée à l’aide d’une pince et transférer le tissu de la moelle épinière disséqué et nettoyé dans un tube C. Ajouter 50 microlitres d’enzyme P du kit de dissociation du tissu neural et 30 microlitres de mélange d’enzymes préalablement préparé à chaque tube C.Retourner les tubes C et les placer sur un tube dissocié chauffé en veillant à ce que tous les tissus soient recueillis dans le couvercle du tube. Éluder les cellules en retirant la colonne du séparateur en ajoutant 800 microlitres de milieu de culture astrocytaire et en poussant les cellules hors de la colonne avec le piston inclus. Les cellules en plaques dans les flacons de culture précédemment préparés en ajoutant 4,2 millilitres de milieu de culture astrocytaire complété par 10 nanogrammes par millilitre d’EGF et de bFGF.Il n’est pas nécessaire d’enduire les flacons de culture pour les astrocytes isolés d’autres régions du cerveau, mais cela fournit un meilleur substrat pour les astrocytes isolés de la moelle épinière. Culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Effectuer des sièges d’astrocytes sous une armoire de sécurité biologique avec un niveau de sécurité un et préparer 24 plaques de puits avec des couvercles en verre revêtu de poly-D-Lysine comme décrit dans le manuscrit du texte.Pour le placage, isoler six moelles épinières de souris P2 donne environ 1 million de cellules. Aspirer les milieux des flacons de culture T-12.5 contenant les astrocytes cultivés et laver une fois avec 1x PBS. Détacher les astrocytes du flacon de culture en ajoutant 0,5 millilitre d’EDTA à 0,05% de trypsine et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Tapoter doucement le côté de la fiole pour libérer les cellules de la surface du flacon de culture et vérifier le détachement au microscope à fond clair à l’aide d’un grossissement de 10 fois. Arrêtez la trypsinazation avec 2,5 millilitres de milieu de culture astrocytaire et recueillez la suspension cellulaire dans des tubes de 15 millilitres. Centrifuger à 300 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Aspirer le surnageant et renvoyer les cellules dans un millilitre de milieu de culture astrocytaire. Calculez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un système automatisé de comptage cellulaire. En fonction du nombre de cellules, diluer la suspension cellulaire avec un milieu astrocytaire frais complété par EGF et bFGF à 10 nanogrammes par millilitre et par facteur.Ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits des 24 plaques de puits et des cellules de culture préparées précédemment à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Préparer le milieu de différenciation neuronale en ajoutant un supplément de B27 millilitre à 49 millilitres de milieu de culture de base. Après 24 à 48 heures, selon que les cellules ont été transduites ou transfectées, remplacer le milieu astrocytaire par un milieu de différenciation neuronale d’un millilitre par puits.Culture des cellules à 37 degrés Celsius avec 9% de dioxyde de carbone. Pour augmenter l’efficacité de la reprogrammation, compléter le milieu de différenciation neuronale avec de la forskoline et de la dorsomorphine jusqu’à une concentration finale de 30 micromolaires et une micromolaire respectivement en remplaçant le milieu astrocytaire par le milieu de différenciation. Lorsque vous choisissez de traiter les cellules avec de la forskoline et de la dorsomorphine, fournissez une deuxième dose de dorsomorphine deux jours après le traitement initial.Ajouter ce deuxième traitement directement sur le milieu de culture. Les cultures primaires d’astrocytes ont atteint 80 à 90% de confluence entre sept et 10 jours après le tri et le placage cellulaire assisté par magnétose. Le lendemain du placage, les cellules couvraient généralement 50 à 60 % de la surface du couvercle.Les cultures étaient principalement constituées d’astrocytes à ce stade, tandis que d’autres types de cellules telles que les explosions neurologiques étaient pratiquement absents. Sept jours après la transduction ou la transfection, les cellules neuronales induites se distinguaient clairement des astrocytes. Le soma cellulaire neuronal était plus petit que les astrocytes non reprogrammés avaient des processus longs et étaient positifs pour le marqueur neuronal, la tubuline bêta-trois et négatif pour le marqueur astrocytaire GFAP.21 jours après la transduction ou la transfection, de nombreux neurones induits étaient capables de déclencher des potentiels d’action et étaient positifs pour le marqueur neuronal mature NeuN et la protéine pan synaptique Synaptophysine. Il est essentiel de bien disséquer la région d’intérêt. Éviter la contamination par les tissus environnants.Il faut prendre soin d’enlever les méninges et les ganglions de la racine dorsose de la moelle épinière isolée. Cette méthode peut être utilisée pour isoler les astrocytes de diverses régions du système nerveux central, y compris le cortex cérébral, le mésencéphale dorsal et le cervelet. À l’avenir, cette technique nous permettra d’élargir nos connaissances sur les astrocytes régionaux et leur potentiel à être reprogrammés en neurones fonctionnels.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

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