Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Wir danken Ines Mühlhahn für das Klonen der Konstrukte für die Neuprogrammierung, Paulina Chlebik für die virale Produktion und Magdalena Götz und Judith Fischer-Sternjak für die Kommentare zum Manuskript.

Das folgende Verfahren folgt den Tierpflegerichtlinien des Helmholtz Zentrums München gemäß der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere. Bitte achten Sie auf die Einhaltung der Tierpflegerichtlinien der Einrichtung, in der die Dissektion durchgeführt wird.
1. Vorbereitung von Sezier-, Dissoziations- und Kulturmaterialien
HINWEIS: Bereiten Sie alle Kulturreagenzien in einer biologischen Sicherheitswerkba...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

Primärkulturen muriner Astrozyten sind ein bemerkenswertes In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung der direkten neuronalen Reprogrammierung. Tatsächlich exprimieren Zellen, obwohl sie in einem postnatalen Stadium isoliert wurden, typische Astrozytenmarker 29, behalten die Expression von Mustergenen28,29 bei und behalten die Fähigkeit zur Proliferation bei, ähnlich wie in vivo Astrozyten im vergleichbaren Altervon 38 Jahren....

Das zentrale Nervensystem (ZNS) von Säugetieren ist hochkomplex und besteht aus Hunderten von verschiedenen Zelltypen, darunter eine große Anzahl verschiedener neuronaler Subtypen 1,2,3,4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Organen oder Geweben 7,8,9 hat das ZNS von Säugetieren eine sehr begrenzte Regenerationsfähigkeit; Der neuronale Verlust nach einer traumatischen Hirnverletzung oder Neurodegeneration ist irreversibel und führt häufig zu motorischen und kognitiven Defiziten10. Mit dem Ziel, Gehirnfunktionen zu retten, werden verschiedene Strategien zum Ersatz verlorener Neuronen intensiv untersucht11. Unter ihnen entwickelt sich die direkte Reprogrammierung von Körperzellen in funktionelle Neuronen zu einem vielversprechenden therapeutischen Ansatz12. Direkte Reprogrammierung oder Transdifferenzierung ist der Prozess der Umwandlung eines differenzierten Zelltyps in eine neue Identität, ohne einen intermediären proliferativen oder pluripotenten Zustand13,14,15,16 zu durchlaufen. Entwickelt durch die Identifizierung von MyoD1 als einen Faktor, der ausreicht, um Fibroblasten in Muskelzellenumzuwandeln 17,18, wurde diese Methode erfolgreich angewendet, um mehrere Zelltypen in funktionelle Neuronenumzuprogrammieren 19,20,21.
Astrozyten, die am häufigsten vorkommenden Makroglia im ZNS22,23, sind aus mehreren Gründen ein besonders vielversprechender Zelltyp für die direkte neuronale Reprogrammierung. Erstens sind sie weit und gleichmäßig über das ZNS verteilt und bieten eine reichlich vorhandene Lokquelle für neue Neuronen. Zweitens sind Astrozyten und Neuronen entwicklungseng miteinander verwandt, da sie während der Embryonalentwicklung einen gemeinsamen Vorfahren haben, die radialen Gliazellen24. Der gemeinsame embryonale Ursprung der beiden Zelltypen scheint die neuronale Umwandlung im Vergleich zur Reprogrammierung von Zellen aus verschiedenen Keimschichten zu erleichtern19,21. Darüber hinaus werden Musterinformationen, die von Astrozyten durch ihren radialen Glia-Ursprung geerbt werden, auch in erwachsenen Astrozyten 25,26,27 aufrechterhalten und scheinen zur Erzeugung regional geeigneter neuronaler Subtypen 28,29,30 beizutragen. Daher ist die Untersuchung und das Verständnis der Umwandlung von Astrozyten in Neuronen ein wichtiger Teil, um das volle Potenzial dieser Technik für zellbasierte Ersatzstrategien auszuschöpfen.
Die Umwandlung von in vitro kultivierten Astrozyten in Neuronen hat zu mehreren Durchbrüchen auf dem Gebiet der direkten neuronalen Reprogrammierung geführt, darunter: i) die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren, die ausreichen, um Neuronen aus Astrozyten zu erzeugen15,19,31, ii) die Entschlüsselung molekularer Mechanismen, die durch verschiedene Reprogrammierungsfaktoren im selben zellulären Kontext ausgelöst werden 32 , und iii) Hervorhebung des Einflusses des Entwicklungsursprungs der Astrozyten auf die Induktion verschiedener neuronaler Subtypen28,29,33. Darüber hinaus löste die direkte In-vitro-Umwandlung von Astrozyten mehrere Haupthürden, die die direkte neuronale Reprogrammierung 34,35 begrenzen, wie z.B. eine erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) 34 und Unterschiede zwischen dem mitochondrialen Proteom von Astrozyten und Neuronen 35. Daher unterstützen diese Beobachtungen nachdrücklich die Verwendung von Primärkulturen von Astrozyten als Modell für die direkte neuronale Reprogrammierung, um mehrere grundlegende Fragen in der Biologiezu untersuchen 12, die sich auf die Aufrechterhaltung der Zellidentität, Straßensperren, die Veränderungen des Zellschicksals verhindern, sowie die Rolle des Stoffwechsels bei der Reprogrammierung beziehen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Astrozyten von Mäusen im postnatalen (P) Alter mit sehr hoher Reinheit, wie durch Isolierung von Astrozyten aus dem murinen Rückenmarkgezeigt wird 29. Wir bieten auch Protokolle zur Umprogrammierung von Astrozyten in Neuronen durch virale Transduktion oder DNA-Plasmid-Transfektion an. Reprogrammierte Zellen können 7 Tage nach der Transduktion (7 DPT) analysiert werden, um verschiedene Aspekte wie Reprogrammierungseffizienz und neuronale Morphologie zu beurteilen, oder sie können mehrere Wochen in Kultur gehalten werden, um ihre Reifung im Laufe der Zeit zu beurteilen. Wichtig ist, dass dieses Protokoll nicht spezifisch für Rückenmarksastrozyten ist und leicht angewendet werden kann, um Astrozyten aus verschiedenen anderen Gehirnregionen zu isolieren, einschließlich der kortikalen grauen Substanz, des Mittelhirns und des Kleinhirns.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

Die direkte neuronale Reprogrammierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, um funktionelle Neuronen aus verschiedenen Starterzellpopulationen zu erzeugen, ohne multipotente Zwischenprodukte zu durchlaufen. Diese Technik verspricht nicht nur im Bereich der Krankheitsmodellierung große Versprechungen, da sie es beispielsweise ermöglicht, Fibroblasten für Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen in Neuronen umzuwandeln, sondern stellt auch eine vielversprechende Alternative für zellbasierte Ersatztherapien dar. Ein großer wissenschaftlicher Durchbruch war in diesem Zusammenhang der Nachweis, dass differenzierte nicht-neuronale Zellen innerhalb des Zentralnervensystems, wie Astrozyten, in vitro in funktionelle Neuronen umgewandelt werden können. Seitdem hat die direkte In-vitro-Reprogrammierung von Astrozyten in Neuronen substanzielle Einblicke in die molekularen Mechanismen geliefert, die der erzwungenen Identitätsumwandlung zugrunde liegen, und die Hürden, die eine effiziente Reprogrammierung verhindern. Die Ergebnisse von In-vitro-Experimenten, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden, sind jedoch aufgrund der Unterschiede in den Methoden zur Isolierung, Kultur und Neuprogrammierung von Astrozyten schwer zu vergleichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Isolierung und Kultivierung von Astrozyten mit hoher Reinheit aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems von Mäusen im postnatalen Alter mittels Magnetzellsortierung. Darüber hinaus bieten wir Protokolle zur Umprogrammierung kultivierter Astrozyten in Neuronen durch virale Transduktion oder DNA-Transfektion an. Mit diesem schlanken und standardisierten Protokoll können die molekularen Mechanismen untersucht werden, die der Aufrechterhaltung der Zellidentität, der Etablierung einer neuen neuronalen Identität sowie der Generierung spezifischer neuronaler Subtypen und ihrer funktionellen Eigenschaften zugrunde liegen.

Primärkulturen von Astrozyten erreichen typischerweise zwischen 7 und 10 Tagen nach der MAC-Sortierung und -Beschichtung eine Konfluenz von 80% -90% (Abbildung 1B). Im Allgemeinen liefert ein einzelner T25-Kulturkolben etwa 1-1,5 x 106 Zellen, was für 20-30 Deckgläser ausreicht, wenn Zellen mit einer Dichte von 5-5,5 x 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät werden. Am Tag nach der Beschichtung bedecken die Zellen in der Regel 50 % bis 60 % der Deckglasoberfläche (<stro...

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Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung hochangereicherter Kulturen von Astrozyten, die aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems postnataler Mäuse stammen, und deren direkte Umwandlung in funktionelle Neuronen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Isolierung und direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Astrozyten sind eine interessante autogene Population für die direkte neuronale Programmierung. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Technik zur Isolierung von Kulturastrozyten mit hoher Reinheit aus verschiedenen Regionen oder dem zentralen Nervensystem. Dieses Protokoll wurde entwickelt und optimiert, um die Fähigkeit von Astrozyten zu untersuchen, in funktionelle Neuronen umprogrammiert zu werden, ohne Störfaktoren wie Unterschiede in der Reinheit der Astrozyten verschiedener Startpopulationen zu beeinträchtigen.Die Demonstration des Verfahrens wird von Bob Hersbach, Postdoc im Labor, und Tatiana Simon, einer technischen Assistenz in unserem Labor, durchgeführt. Legen Sie zunächst den Torso einer eingeschläferten Maus in eine 35-Millimeter-Petrischale und halten Sie ihn auf Eis. Öffnen Sie die Haut mit einer Schere und entfernen Sie den Wirbel mit einer kleinen Schere.Dann extrahieren Sie das Rückenmark und legen Sie es in einen Dissektionspuffer auf Eis. Unter einem stereotaktischen Dissektionsmikroskop mit zweifacher Vergrößerung die Hirnhäute mit einer Pinzette aus dem isolierten Rückenmark entfernen und das präparierte und gereinigte Rückenmarksgewebe in ein C-Rohr übertragen. Fügen Sie 50 Mikroliter Enzym P aus dem Neuralgewebedissoziationskit und 30 Mikroliter zuvor vorbereitete Enzymmischung zu jedem C-Röhrchen hinzu.Drehen Sie die C-Röhrchen um und legen Sie sie auf eine beheizte Dissoziation, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe im Deckel der Röhre gesammelt wird. Vermeiden Sie Zellen, indem Sie die Säule aus dem Separator entfernen, 800 Mikroliter Astrozytenkulturmedium hinzufügen und Zellen mit dem mitgelieferten Kolben aus der Säule drücken. Plattenzellen in den zuvor hergestellten Kulturkolben durch Zugabe von 4,2 Milliliter Astrozytenkulturmedium ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter EGF und bFGF.Es ist nicht notwendig, die Kulturkolben für Astrozyten zu beschichten, die aus anderen Gehirnregionen isoliert wurden, aber es bietet ein besseres Substrat für Astrozyten, die aus dem Rückenmark isoliert wurden. Kultur der Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Führen Sie Astrozytensitze unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit einer Sicherheitsstufe eins durch und bereiten Sie 24 Well-Platten mit Poly-D-Lysin-beschichteten Glasabdeckungsgläsern vor, wie im Textmanuskript beschrieben.Für die Beschichtung ergibt die Isolierung von sechs Rückenmark aus P2-Mäusen rund 1 Million Zellen. Medien aus den T-12.5-Kulturkolben mit den kultivierten Astrozyten absaugen und einmal mit 1x PBS waschen. Die Astrozyten aus dem Kulturkolben lösen, indem Sie 0,5 Milliliter 0,05% Trypsin EDTA zugeben und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um Zellen von der Oberfläche des Kulturkolbens zu lösen, und überprüfen Sie die Ablösung unter einem Hellfeldmikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung. Stoppen Sie die Trypsinazation mit 2,5 Milliliter Astrozytenkulturmedium und sammeln Sie die Zellsuspension in 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 300 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Asspirieren Sie Überstand und senden Sie Zellen in einem Milliliter Astrozytenkulturmedium. Berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzählsystem. Basierend auf der Anzahl der Zellen wird die Zellsuspension mit frischem Astrozytenmedium, ergänzt mit EGF und bFGF, bei 10 Nanogramm pro Milliliter pro Faktor verdünnt.In jede Vertiefung der zuvor präparierten 24 Wellplatten und Kulturzellen werden 500 Mikroliter der Zellsuspension bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gegeben. Bereiten Sie das neuronale Differenzierungsmedium vor, indem Sie einen Milliliter B27-Ergänzung zu 49 Milliliter Basiskulturmedium hinzufügen. Nach 24 bis 48 Stunden, je nachdem, ob Zellen transduziert oder transfiziert wurden, ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch ein Milliliter neuronales Differenzierungsmedium pro Well.Kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 9% Kohlendioxid. Um die Reprogrammierungseffizienz zu erhöhen, ergänzen Sie das neuronale Differenzierungsmedium mit Forskolin und Dorsomorphin auf eine Endkonzentration von 30 Mikromolar bzw. einem Mikromolaren, wenn das Astrozytenmedium durch das Differenzierungsmedium ersetzt wird. Wenn Sie sich für die Behandlung von Zellen mit Forskolin und Dorsomorphin entscheiden, geben Sie zwei Tage nach der Erstbehandlung eine zweite Dosis Dorsomorphin an.Fügen Sie diese zweite Behandlung direkt zum Kulturmedium hinzu. Primärkulturen von Astrozyten erreichten eine Konflukation von 80 bis 90% zwischen sieben und 10 Tagen nach der magnetisch unterstützten Zellsortierung und -beschichtung. Am Tag nach der Beschichtung bedeckten die Zellen typischerweise 50 bis 60% der Deckglasoberfläche.Die Kulturen bestanden in diesem Stadium hauptsächlich aus Astrozyten, während andere Zelltypen wie Neuroblasten praktisch fehlten. Sieben Tage nach der Transduktion oder Transfektion waren induzierte neuronale Zellen deutlich von Astrozyten zu unterscheiden. Das neuronale Zellsoma war kleiner als nicht reprogrammierte Astrozyten hatten lange Prozesse und waren positiv für neuronale Marker, Beta-Drei-Tubulin und negativ für Astrozytenmarker GFAP.21 Tage nach der Transduktion oder Transfektion waren viele induzierte Neuronen in der Lage, Aktionspotentiale abzufeuern und waren positiv für den reifen neuronalen Marker NeuN und das pansynaptische Protein Synaptophysin. Es ist wichtig, die Region von Interesse richtig zu sezieren. Vermeidung von Kontamination durch umliegendes Gewebe.Es muss darauf geachtet werden, die Hirnhäute und die Rückenwurzelganglien aus dem isolierten Rückenmark zu entfernen. Diese Methode kann verwendet werden, um Astrozyten aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems zu isolieren, einschließlich der Großhirnrinde, des dorsalen Mittelhirns und des Kleinhirns. In Zukunft wird diese Technik es uns ermöglichen, unser Wissen über regionale Astrozyten und ihr Potenzial, in funktionelle Neuronen umprogrammiert zu werden, zu erweitern.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Forschung

Neurowissenschaften

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Geschlechtsunterschiede in Mäuse Hippocampus Astrozyten nach<em&gt; In-Vitro</em&gt; Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In Vivo Direkte Reprogrammierung von Resident Glial Cells in Interneurons durch Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...