Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

ברצוננו להודות לאינס מולהאן על שיבוט המבנים לתכנות מחדש, לפאולינה צ'לביק על ההפקה הוויראלית, ולמגדלנה גץ וג'ודית פישר-שטרניאק על הערות על כתב היד.

ההליך הבא תואם את הנחיות הטיפול בבעלי חיים של הלמהולץ צנטרום מינכן בהתאם להנחיה 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. אנא הקפידו לציית להנחיות הטיפול בבעלי חיים של המוסד שבו מתבצעת הנתיחה.
1. הכנת דיסקציה, דיסוציאציה וחומרי תרבות
הערה: ?...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים של מורין הן מערכת מודלים יוצאת דופן במבחנה לחקר תכנות מחדש של נוירונים ישירים. למעשה, למרות היותם מבודדים בשלב שלאחר הלידה, תאים מבטאים סמני אסטרוציטים טיפוסיים29, שומרים על הביטוי של גנים דפוס28,29, ושומרים על ה...

מערכת העצבים המרכזית של היונקים (CNS) מורכבת מאוד, המורכבת ממאות סוגי תאים שונים, כולל מספר עצום של תת-סוגים עצביים שונים 1,2,3,4,5,6. שלא כמו איברים או רקמות אחרים 7,8,9, ליונק CNS יש יכולת התחדשות מוגבלת מאוד; אובדן עצבי בעקבות פגיעה מוחית טראומטית או ניוון עצבי הוא בלתי הפיך ולעתים קרובות גורם לליקויים מוטוריים וקוגניטיביים10. במטרה להציל את תפקודי המוח, אסטרטגיות שונות להחלפת תאי עצב אבודים נמצאות תחת חקירה אינטנסיבית11. ביניהם, תכנות מחדש ישיר של תאים סומטיים לנוירונים פונקציונליים מתגלה כגישה טיפולית מבטיחה12. תכנות מחדש ישיר, או טרנסדיפרנציה, הוא תהליך של המרת סוג תא מובחן אחד לזהות חדשה מבלי לעבור דרך מצב התפשטות ביניים או פלוריפוטנטי 13,14,15,16. שיטה זו, שהומצאה על ידי זיהוי של MyoD1 כגורם מספיק כדי להמיר פיברובלסטים לתאי שריר17,18, יושמה בהצלחה כדי לתכנת מחדש מספר סוגי תאים לנוירונים פונקציונליים 19,20,21.
אסטרוציטים, המקרוגליה הנפוצה ביותר במערכת העצבים המרכזית 22,23, הם סוג תא מבטיח במיוחד לתכנות מחדש ישיר של העצבים מכמה סיבות. ראשית, הם מופצים באופן נרחב ושווה על פני מערכת העצבים המרכזית, ומספקים מקור לוקו בשפע לנוירונים חדשים. שנית, אסטרוציטים ותאי עצב קשורים זה לזה מבחינה התפתחותית, שכן הם חולקים אב קדמון משותף במהלך ההתפתחות העוברית, תאי הגלייה הרדיאליים24. נראה כי המקור העוברי הנפוץ של שני סוגי התאים מקל על המרה עצבית בהשוואה לתכנות מחדש של תאים משכבות נבט שונות19,21. יתר על כן, דפוס מידע שעובר בירושה על ידי אסטרוציטים באמצעות מקור הגליה הרדיאלי שלהם נשמר גם אצל אסטרוציטים בוגרים 25,26,27, ונראה שהוא תורם ליצירת תת-סוגים עצביים מתאימים אזורית 28,29,30. לפיכך, חקר והבנת ההמרה של אסטרוציטים לנוירונים היא חלק חשוב בהשגת מלוא הפוטנציאל של טכניקה זו לאסטרטגיות החלפה מבוססות תאים.
ההמרה של אסטרוציטים בתרבית חוץ גופית לנוירונים הובילה למספר פריצות דרך בתחום התכנות מחדש של נוירונים ישירים, כולל: 1) זיהוי גורמי שעתוק מספיקים כדי ליצור נוירונים מאסטרוציטים 15,19,31, ii) חשיפת מנגנונים מולקולריים המופעלים על ידי גורמי תכנות מחדש שונים באותו הקשר תאי 32 ו-3) הדגשת ההשפעה של המקור ההתפתחותי של האסטרוציטים על גרימת תת-סוגים עצביים שונים 28,29,33., יתר על כן, המרה ישירה במבחנה של אסטרוציטים פענחה מספר מכשולים עיקריים המגבילים תכנות מחדש של נוירונים ישירים34,35, כגון ייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי (ROS)34 והבדלים בין הפרוטאום המיטוכונדריאלי של אסטרוציטים ותאי עצב35. לפיכך, תצפיות אלה תומכות מאוד בשימוש בתרביות ראשוניות של אסטרוציטים כמודל לתכנות מחדש של נוירונים ישירים כדי לחקור מספר שאלות יסוד בביולוגיה12, הקשורות לתחזוקת זהות התא, מחסומים המונעים שינויים בגורל התא, כמו גם תפקידו של חילוף החומרים בתכנות מחדש.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד אסטרוציטים מעכברים בגיל שלאחר הלידה (P) עם טוהר גבוה מאוד, כפי שהודגם על ידי בידוד אסטרוציטים מחוט השדרה של מורין29. אנו גם מספקים פרוטוקולים לתכנות מחדש של אסטרוציטים לנוירונים באמצעות התמרה נגיפית או טרנספקציה של פלסמיד דנ"א. ניתן לנתח תאים מתוכנתים מחדש לאחר 7 ימים לאחר ההעתקה (7 DPT) כדי להעריך היבטים שונים, כגון יעילות תכנות מחדש ומורפולוגיה עצבית, או שניתן לשמור עליהם בתרבית במשך מספר שבועות, כדי להעריך את ההתבגרות שלהם לאורך זמן. חשוב לציין שפרוטוקול זה אינו ספציפי לאסטרוציטים של חוט השדרה וניתן ליישם אותו בקלות כדי לבודד אסטרוציטים מאזורים שונים אחרים במוח, כולל החומר האפור בקליפת המוח, המוח האמצעי והמוח הקטן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

תכנות מחדש ישיר של תאי העצב הוא גישה רבת עוצמה ליצירת נוירונים פונקציונליים מאוכלוסיות שונות של תאי מתחילים מבלי לעבור דרך מתווכים רב-תכליתיים. טכניקה זו לא רק טומנת בחובה הבטחות גדולות בתחום מודל המחלות, שכן היא מאפשרת להמיר, למשל, פיברובלסטים לחולים הסובלים ממחלות נוירודגנרטיביות לנוירונים, אלא גם מייצגת אלטרנטיבה מבטיחה לטיפולים חלופיים מבוססי תאים. בהקשר זה, פריצת דרך מדעית משמעותית הייתה ההדגמה כי תאים לא עצביים מובחנות בתוך מערכת העצבים המרכזית, כגון אסטרוציטים, יכולים להיות מומרים לנוירונים פונקציונליים במבחנה. מאז, תכנות מחדש ישיר במבחנה של אסטרוציטים לנוירונים סיפק תובנות משמעותיות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המרת זהות כפויה והמכשולים המונעים תכנות מחדש יעיל. עם זאת, קשה להשוות בין תוצאות מניסויים במבחנה שבוצעו במעבדות שונות בשל הבדלים בשיטות המשמשות לבידוד, תרבית ותכנות מחדש של אסטרוציטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד אמין ולתרבית של אסטרוציטים עם טוהר גבוה מאזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים בגילאים שלאחר הלידה באמצעות מיון תאים מגנטיים. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים לתכנות מחדש של אסטרוציטים בתרבית לתאי עצב באמצעות התמרה נגיפית או טרנספקציה של דנ"א. פרוטוקול יעיל וסטנדרטי זה יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תחזוקת זהות התא, את קביעת הזהות העצבית החדשה, כמו גם את יצירתם של תת-סוגים עצביים ספציפיים ואת תכונותיהם התפקודיות.

תרבויות ראשוניות של אסטרוציטים מגיעות בדרך כלל למפגש של 80%-90% בין 7 ל-10 ימים לאחר מיון וציפוי MAC (איור 1B). באופן כללי, בקבוקון תרבית T25 יחיד מניב סביב 1-1.5 x 106 תאים, מה שמספיק ל-20-30 כיסויים בעת זריעת תאים בצפיפות של 5-5.5 x 104 תאים לכל באר. יום לאחר הציפוי, התאים מכסים בדרך כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות מועשרות מאוד של אסטרוציטים שמקורם באזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים לאחר הלידה ואת המרתם הישירה לנוירונים פונקציונליים על ידי ביטוי כפוי של גורמי שעתוק.

בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

אסטרוציטים הם אוכלוסייה אוטוגנית מעניינת שיש לכוון אליה לתכנות עצבי ישיר. פרוטוקול זה מספק טכניקה אמינה לבידוד אסטרוציטים תרבותיים בעלי טוהר גבוה מאזור שונה או ממערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתוכנן וממוטב כדי לחקור את יכולתם של אסטרוציטים להיות מתוכנתים מחדש לנוירונים פונקציונליים ללא גורמים מבלבלים כגון הבדלים בטוהר האסטרוציטים של אוכלוסיות סטארט-אפ שונות.הדגמת ההליך תיעשה על ידי בוב הרשבאך, פוסט-דוקטורנט במעבדה, וטטיאנה סיימון סיוע טכני במעבדה שלנו. כדי להתחיל, מניחים את פלג גופו העליון של עכבר מורדם בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ ושומרים אותו על קרח. פתח את העור עם מספריים והסר את החוליה עם מספריים קטנים.לאחר מכן לחלץ את חוט השדרה ומניחים אותו בחיץ דיסקציה על קרח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאוטקטי עם הגדלה של פי שניים, הסר את קרומי המוח מחוט השדרה המבודד באמצעות מלקחיים והעביר רקמת חוט שדרה שנכרתה ונוקתה לצינור C. הוסף 50 מיקרוליטרים של אנזים P מתוך ערכת הדיסוציאציה של רקמות עצביות ו-30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים שהוכנה בעבר לכל צינור C.הפוך את צינורות C והנח אותם על מחומם מנותק להבטיח כי כל הרקמה נאספת במכסה של הצינור. לחמוק מתאים על ידי הסרת העמודה מהמפריד הוספת 800 מיקרוליטרים של תרבית אסטרוציטים מדיום ודחיפת תאים אל מחוץ לעמודה עם הבוכנה הכלולה. תאי צלחת בבקבוקוני התרבית שהוכנו בעבר על ידי הוספת 4.2 מיליליטר של תרבית אסטרוציטים בינונית בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של EGF ו- bFGF.אין צורך לצפות את צלוחיות התרבית עבור אסטרוציטים המבודדים מאזורי מוח אחרים, אך הוא מספק מצע טוב יותר לאסטרוציטים המבודדים מחוט השדרה. תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. בצע ישיבת אסטרוציטים מתחת לארון בטיחות ביולוגי עם רמת בטיחות אחת והכן 24 לוחות באר עם כיסויי זכוכית מצופים Poly-D-Lysine כמתואר בכתב היד של הטקסט.עבור ציפוי, לבודד שישה חוטי עמוד שדרה מעכברי P2 מניב כמיליון תאים. שאפו מדיה מבקבוקי התרבית T-12.5 המכילים את האסטרוציטים המתורבתים ושטפו פעם אחת עם PBS אחד. נתקו את האסטרוציטים מבקבוק התרבית על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.הקש בעדינות על צד הבקבוקון כדי לשחרר תאים ממשטח בקבוק התרבית ובדוק ניתוק תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות הגדלה של פי 10. להפסיק טריפסינאזציה עם 2.5 מיליליטר של תרבית אסטרוציטים בינוני ולאסוף השעיית תאים בצינורות 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב-300 RCF למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.שאפו תאים סופרנאטנטים ושלחו מחדש במיליליטר אחד של מדיום תרבית אסטרוציטים. חשב את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר או מערכת ספירת תאים אוטומטית. בהתבסס על מספר התאים, דילל את תרחיף התא עם מדיום אסטרוציטים טרי בתוספת EGF ו- bFGF ב 10 ננוגרם למיליליטר לכל גורם.הוסף 500 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של 24 צלחות באר מוכנות מראש ותאי תרבית ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הכן מדיום התמיינות עצבית על ידי הוספת תוסף B27 מיליליטר אחד ל -49 מיליליטר של מדיום תרבות בסיסי. לאחר 24 עד 48 שעות, תלוי אם התאים התמרו או עברו טרנספקציה, החלף את מדיום האסטרוציטים במדיום התמיינות עצבית של מיליליטר אחד לכל באר.תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% פחמן דו חמצני. כדי להגביר את יעילות התכנות מחדש, השלימו את מדיום ההתמיינות העצבית עם פורסקולין ודורסומורפין לריכוז סופי של 30 מיקרומולאר ומיקרומולר אחד בהתאמה בעת החלפת תווך האסטרוציטים במדיום ההתמיינות. כאשר בוחרים לטפל בתאים עם פורסקולין ודורסומורפין מספקים מנה שנייה של דורסומורפין יומיים לאחר הטיפול הראשוני.הוסף את הטיפול השני ישירות למדיום התרבית. תרביות ראשוניות של אסטרוציטים הגיעו למפגש של 80% עד 90% בין שבעה לעשרה ימים לאחר מיון וציפוי תאים בסיוע מגנטי. יום לאחר הציפוי, התאים כיסו בדרך כלל 50% עד 60% ממשטח הכיסוי.תרביות כללו בעיקר אסטרוציטים בשלב זה, בעוד שסוגי תאים אחרים כגון פיצוצים עצביים נעדרו כמעט לחלוטין. בשבעה ימים לאחר ההתמרה או הטרנספקציה, ניתן היה להבחין בבירור בין תאי עצב מושרים לבין אסטרוציטים. הסומא התאית העצבית הייתה קטנה יותר מאשר אסטרוציטים שלא תוכנתו היו בעלי תהליכים ארוכים והייתה חיובית עבור סמן עצבי, בטא שלוש טובולין, ושלילית עבור סמן אסטרוציטים GFAP.ב-21 ימים לאחר ההתמרה או הטרנספקציה, תאי עצב מושרים רבים היו מסוגלים לירות פוטנציאל פעולה והיו חיוביים עבור הסמן העצבי הבוגר NeuN והחלבון הפאן-סינפטי Synaptophysin. זה חיוני כדי לנתח כראוי את האזור של עניין. הימנעות מזיהום מהרקמה הסובבת.יש להקפיד על הסרת קרום המוח וגרעיני שורש דורסו מחוט השדרה המבודד. שיטה זו יכולה לשמש לבידוד אסטרוציטים מאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית, כולל קליפת המוח, המוח האמצעי הגבי והמוח הקטן. בעתיד, טכניקה זו תאפשר לנו להרחיב את הידע שלנו על אסטרוציטים אזוריים ועל הפוטנציאל שלהם להיות מתוכנתים מחדש לנוירונים פונקציונליים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר<em&gt; In-Vitro</em&gt; איסכמיה

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...