Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

リプログラミングのためにコンストラクトをクローンしてくれたInes Mühlhahn、バイラル制作のためにPaulina Chlebik、原稿に対するコメントをしてくれたMagdalena GötzとJudith Fischer-Sternjakに感謝します。

以下の手順は、ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘンの動物ケアガイドラインに従い、科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63/EUに準拠しています。解剖を行う施設の動物愛護ガイドラインを必ず遵守してください。
1. 解剖・解離・培養材料の調製
メモ:生物学的安全キャビネット内のすべての培養試薬を準備し、オー?...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

マウスアストロサイトの初代培養物は、直接ニューロンのリプログラミングを研究するための注目すべきin vitroモデルシステムである。実際、出生後の段階で単離されるにもかかわらず、細胞は典型的なアストロサイトマーカー29を発現し、パターニング遺伝子28、29の発現を保持し、増殖する能力を維持し、同等の年齢におけるインビボ</...

哺乳類の中枢神経系(CNS)は非常に複雑であり、膨大な数の異なるニューロンサブタイプ1、2、3、4、5、6を含む何百もの異なる細胞型からなる。他の器官または組織7、8、9とは異なり、哺乳動物CNSは非常に限られた再生能力を有する。外傷性脳損傷または神経変性に続くニューロン喪失は不可逆的であり、しばしば運動的および認知的欠損をもたらす10。脳機能を救うことを目指して、失われたニューロンを置き換えるためのさまざまな戦略が、激しい調査を受けている11。その中で、体細胞を機能的ニューロンに直接リプログラミングすることは、有望な治療的アプローチとして浮上している12。直接リプログラミング、または分化転換は、中間増殖性または多能性状態を経ることなく、1つの分化した細胞型を新しい同一性に変換するプロセスである13、14、15、16。線維芽細胞を筋細胞に変換するのに十分な因子としてのMyoD1の同定によって先駆的に開発された17,18、この方法は、いくつかの細胞型を機能的ニューロンに再プログラムするために首尾よく適用されてきた19、20、21。
アストロサイトは、CNS22、23において最も豊富なマクログリアであり、いくつかの理由から、直接ニューロンリプログラミングのために特に有望な細胞型である。第一に、それらはCNS全体に広く均等に分布しており、新しいニューロンのための豊富なロコ源を提供する。第2に、アストロサイトとニューロンは、胚発生中に共通の祖先、放射状グリア細胞24を共有するように、発達的に密接に関連している。2つの細胞型の共通の胚起源は、異なる胚葉からの細胞のリプログラミングと比較してニューロン変換を促進するようである19、21。さらに、その放射状グリア起源を介してアストロサイトによって受け継がれるパターニング情報は、成体アストロサイト25、26、27においても維持され、かつ、局所的に適切なニューロンサブタイプ28、29、30の生成に寄与するようである。したがって、アストロサイトのニューロンへの変換を調査および理解することは、細胞ベースの置換戦略のためのこの技術の可能性を最大限に引き出すための重要な部分です。
インビトロ培養アストロサイトのニューロンへの変換は、直接ニューロンリプログラミングの分野において、i)アストロサイトからニューロンを生成するのに十分な転写因子の同定15、19、31、ii)同じ細胞コンテキストにおける異なるリプログラミング因子によって引き起こされる分子機構の解明を含むいくつかのブレークスルーをもたらした32iii)異なるニューロンサブタイプの誘導に対するアストロサイトの発達起源の影響を強調する28、29、33。さらに、アストロサイトのインビトロ直接変換は、活性酸素種(ROS)産生の増加34およびアストロサイトとニューロン35のミトコンドリアプロテオームの違いなど、直接ニューロンリプログラミング34、35を制限するいくつかの主要なハードルを解明した。したがって、これらの観察は、細胞同一性の維持、細胞の運命の変化を防ぐ障害、およびリプログラミングにおける代謝の役割に関連する生物学12におけるいくつかの基本的な問題を調査するための直接ニューロンリプログラミングのモデルとしてのアストロサイトの初代培養の使用を強く支持する。
ここでは、マウス脊髄29からアストロサイトを単離することによって実証されるように、出生後(P)年齢のマウスから非常に高い純度でアストロサイトを単離するための詳細なプロトコルを提示する。また、ウイルス形質導入またはDNAプラスミドトランスフェクション を介して アストロサイトをニューロンに再プログラムするためのプロトコルも提供しています。リプログラミングされた細胞は、形質導入後7日間(7DPT)で分析して、リプログラミング効率やニューロン形態などのさまざまな側面を評価するか、または数週間培養中に維持して経時的な成熟を評価することができます。重要なことに、このプロトコルは脊髄アストロサイトに特異的ではなく、皮質灰白質、中脳、小脳を含む様々な他の脳領域からアストロサイトを単離するために容易に適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

直接ニューロンリプログラミングは、多能性中間体を介さずに異なるスターター細胞集団から機能的ニューロンを生成する強力なアプローチです。この技術は、例えば、神経変性疾患に罹患している患者の線維芽細胞をニューロンに変換することを可能にするため、疾患モデリングの分野で大きな可能性を秘めているだけでなく、細胞ベースの補充療法の有望な代替手段でもある。この文脈において、主要な科学的ブレークスルーは、アストロサイトなどの中枢神経系内の分化した非神経細胞が、 インビトロで機能的ニューロンに変換できることの実証であった。それ以来、アストロサイトのニューロンへの インビトロ 直接リプログラミングは、強制的な同一性変換の根底にある分子メカニズムと、効率的なリプログラミングを妨げるハードルに関する実質的な洞察を提供してきました。しかし、異なるラボで行われた in vitro実験の結果は、アストロサイトの単離、培養、および再プログラムに使用される方法の違いにより、比較が困難です。ここでは、出生後のマウスの中枢神経系の異なる領域から、磁気細胞選別 を介して 高純度のアストロサイトを確実に単離・培養するための詳細なプロトコールについて述べる。さらに、培養したアストロサイトをウイルス形質導入またはDNAトランスフェクション を介して ニューロンに再プログラムするプロトコルも提供しています。この合理化され標準化されたプロトコルは、細胞同一性の維持、新しいニューロン同一性の確立、ならびに特定のニューロンサブタイプの生成およびそれらの機能的特性の根底にある分子メカニズムを調査するために使用することができる。

アストロサイトの初代培養物は、典型的には、MACソーティングおよびプレーティング後7〜10日の間に80%〜90%のコンフルエンシーに達する(図1B)。一般に、単一のT25培養フラスコは約1〜1.5 x106 細胞を生成し、これはウェルあたり5〜5.5 x104 細胞の密度で細胞を播種する場合、20〜30カバースリップに十分である。めっきの翌日、細胞は通常、カバースリップ?...

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Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

ここでは、出生後マウスの中枢神経系のさまざまな領域に由来するアストロサイトの高度に濃縮された培養物を生成し、転写因子の強制発現によって機能的ニューロンに直接変換するための詳細なプロトコルについて説明します。

マウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

アストロサイトは、直接的なニューロンプログラミングの対象となる興味深い自生集団です。このプロトコルは、異なる領域または中枢神経系から高純度の培養アストロサイトを単離するための信頼できる技術を提供します。このプロトコルは、異なるスタートアップ集団のアストロサイトの純度の違いなどの交絡因子なしに、アストロサイトが機能ニューロンに再プログラムされる能力を調査するように設計および最適化されています。手順のデモンストレーションは、研究室のポスドクであるボブ・ハースバッハと、私たちの研究室の技術支援であるタチアナ・サイモンによって行われます。まず、安楽死させたマウスの胴体を35ミリメートルのペトリ皿に入れ、氷の上に置きます。ハサミで皮膚を開き、小さなハサミで椎骨を取り除きます。次に、脊髄を抽出し、氷上の解剖バッファーに入れます。倍率2倍の定位解剖顕微鏡で、鉗子を用いて単離した脊髄から髄膜を除去し、解剖して洗浄した脊髄組織をCチューブに移した。神経組織解離キットから50マイクロリットルの酵素Pと、事前に調製した酵素ミックス30マイクロリットルを各Cチューブに加えます。Cチューブを反転させ、加熱された解離した上に置き、すべての組織がチューブの蓋に集められるようにします。800マイクロリットルのアストロサイト培養培地を添加してカラムをセパレータから取り外し、付属のプランジャーで細胞をカラムから押し出すことにより、細胞を逃がします。予め調製した培養フラスコ中の平板細胞に、1ミリリットル当たり10ナノグラムのEGFおよびbFGFを添加した4.2ミリリットルのアストロサイト培養培地を添加する。他の脳領域から単離された星状細胞のために培養フラスコをコーティングする必要はありませんが、脊髄から単離された星状細胞のためのより良い基質を提供します。摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞を培養します。安全レベル1の生物学的安全キャビネットの下でアストロサイトの着座を行い、テキスト原稿に記載されているように、Poly-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップで24ウェルプレートを準備します。プレーティングのために、P2マウスから6つの脊髄を単離すると、約100万個の細胞が得られます。培養したアストロサイトを含むT-12.5培養フラスコから培地を吸引し、1x PBSで1回洗浄します。0.5ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを加えてアストロサイトを培養フラスコから剥離し、摂氏37度で5分間インキュベートします。フラスコの側面を軽くたたいて培養フラスコ表面から細胞を放出し、倍率10倍の明視野顕微鏡で剥離を確認します。2.5ミリリットルの星状細胞培養液でトリプシン化を停止し、15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を採取します。摂氏4度で5分間300RCFで遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルのアストロサイト培養液に細胞を再送する。血球計算盤または自動細胞計数システムを使用して細胞濃度を計算します。細胞数に基づいて、EGFおよびbFGFを添加した新鮮な星状細胞培地で細胞懸濁液を1因子当たり1ミリリットル当たり10ナノグラムで希釈する。500マイクロリットルの細胞懸濁液を、予め調製した24ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cおよび5%二酸化炭素で細胞を培養する。49ミリリットルの塩基性培養培地に1ミリリットルのB27サプリメントを加えて、神経分化培地を調製します。24〜48時間後、細胞が形質導入されたか形質導入されたかに応じて、アストロサイト培地を1ウェルあたり1ミリリットルのニューロン分化培地と交換します。9%二酸化炭素で摂氏37度で細胞を培養します。再プログラミング効率を高めるには、アストロサイト培地を分化培地に置き換えるときに、ニューロン分化培地にフォルスコリンとドルソモルフィンをそれぞれ最終濃度30マイクロモルと1マイクロモルまで補充します。細胞をフォルスコリンとドルソモルフィンで処理することを選択した場合は、最初の治療の2日後に2回目の投与のドルソモルフィンを提供します。この2番目の処理を培地に直接加えます。アストロサイトの初代培養は、磁気支援細胞ソーティングおよびプレーティング後7〜10日で80〜90%のコンフルエンシーに達しました。メッキの翌日、セルは通常、カバースリップ表面の50〜60%を覆っていました。この段階では、培養物は主に星状細胞で構成されていましたが、神経芽細胞などの他の細胞型は事実上存在しませんでした。形質導入またはトランスフェクションの7日後に、誘導された神経細胞は星状細胞と明確に区別できました。ニューロン細胞ソーマは、再プログラムされていないアストロサイトよりも小さく、長い突起があり、ニューロンマーカー、ベータ3チューブリン、アストロサイトマーカーGFAPに対して陰性でした。形質導入またはトランスフェクション後21日目に、多くの誘導ニューロンは活動電位を発火させることができ、成熟ニューロンマーカーNeuNおよび汎シナプスタンパク質シナプトフィジンに対して陽性であった。関心領域を適切に分析することが不可欠です。周囲の組織からの汚染を避けます。髄膜と背根神経節を孤立した脊髄から取り除くように注意する必要があります。この方法は、大脳皮質、背側中脳、小脳など、中枢神経系のさまざまな領域から星状細胞を分離するために使用できます。将来的には、この技術により、局所アストロサイトとその機能ニューロンへの再プログラムの可能性に関する知識を広げることができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

マウス海馬アストロサイトにおける性差後<em&gt;インビトロ</em&gt;虚血

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...