Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

우리는 재 프로그래밍을위한 구조를 복제 한 Ines Mühlhahn, 바이러스 생산을위한 Paulina Chlebik, 원고에 대한 의견에 대한 Magdalena Götz와 Judith Fischer-Sternjak에게 감사드립니다.

다음 절차는 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침 2010/63/EU에 따라 헬름홀츠 젠트럼 뮌헨의 동물 관리 지침을 따릅니다. 해부가 수행되는 기관의 동물 관리 지침을 준수하십시오.
1. 해부, 해리 및 배양 재료의 준비
참고: 생물학적 안전 캐비닛 내의 모든 배양 시약을 준비하고 오토클레이브 또는 멸균 장비만 사용하여 작업하십시오...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

뮤린 성상세포의 일차 배양은 직접적인 뉴런 재프로그래밍을 연구하는 놀라운 시험관내 모델 시스템이다. 실제로, 출생 후 단계에서 단리되었음에도 불구하고, 세포는 전형적인 성상세포 마커(29)를 발현하고, 패터닝 유전자(28,29)의 발현을 유지하며,38세에 생체내 성상세포와 유사하게 증식하는 능력을 유지한다.<sup class=...

포유동물 중추신경계(CNS)는 매우 복잡하며, 방대한 수의 상이한 뉴런 아형 1,2,3,4,5,6을 포함하는 수백 개의 상이한 세포 유형들로 구성된다. 다른 기관 또는 조직 7,8,9와는 달리, 포유동물 CNS는 매우 제한된 재생 능력을 갖는다; 외상성 뇌 손상 또는 신경 변성에 따른 신경 세포 손실은 돌이킬 수 없으며 종종 운동 및인지 결핍을 초래합니다10. 뇌 기능을 구하기 위해 잃어버린 뉴런을 대체하기위한 다양한 전략이 집중적 인 조사를 받고 있습니다11. 그 중에서도, 체세포를 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 것은 유망한 치료 접근법12로 부상하고 있다. 직접 재프로그래밍 또는 전분화는 하나의 분화된 세포 유형을 중간 증식성 또는 다능성 상태13,14,15,16을 거치지 않고 새로운 동일성으로 전환시키는 과정이다. 섬유아세포를 근육세포(17,18)로 전환시키기에 충분한 인자로서 MyoD1의 확인에 의해 개척된 이 방법은 여러 세포 유형을 기능적 뉴런(19,20,21)으로 재프로그래밍하는데 성공적으로 적용되었다.
CNS22,23에서 가장 풍부한 거대 아교세포 인 성상 세포는 여러 가지 이유로 직접 신경 재 프로그래밍을위한 특히 유망한 세포 유형입니다. 첫째, 그들은 CNS에 걸쳐 광범위하고 균등하게 분포되어 새로운 뉴런을위한 유전자좌 공급원이 풍부합니다. 둘째, 성상세포와 뉴런은 배아 발달 동안 공통조상인 방사상 신경교세포(24)를 공유하기 때문에 발달적으로 밀접한 관련이 있다. 두 세포 유형의 일반적인 배아 기원은 상이한 배아층19,21로부터의 세포의 재프로그래밍과 비교하여 뉴런 전환을 촉진하는 것으로 보인다. 더욱이, 그들의 방사상 신경교세포 기원을 통해 성상세포에 의해 유전된 패터닝 정보는 성인 성상세포(25,26,27)에서도 유지되며, 지역적으로 적절한 뉴런 아형(28,29,30)의 생성에 기여하는 것으로 보인다. 따라서 성상세포가 뉴런으로 전환되는 것을 조사하고 이해하는 것은 세포 기반 대체 전략에 대한이 기술의 잠재력을 최대한 발휘하는 데 중요한 부분입니다.
시험관내 배양된 성상세포를 뉴런으로 전환시키는 것은 다음을 포함하는 직접적인 뉴런 리프로그래밍 분야에서 몇 가지 돌파구를 가져왔다: i) 성상세포로부터 뉴런을 생성하기에 충분한 전사 인자의 확인15,19,31, ii) 동일한 세포 맥락에서 상이한 리프로그래밍 인자에 의해 촉발된 분자 메커니즘의 풀림(32) iii) 성상세포의 발달 기원이 상이한 뉴런 아류형을 유도하는 것에 미치는 영향을 강조한다28,29,33. 더욱이, 성상세포의 시험관내 직접 전환은 증가된 반응성 산소 종(ROS) 생산(34) 및 성상세포와 뉴런(35)의 미토콘드리아 프로테옴 사이의 차이와 같은 직접적인 뉴런 재프로그래밍(34,35)을 제한하는 몇 가지 주요 장애물을 풀었다. 따라서 이러한 관찰은 세포 정체성 유지, 세포 운명 변화를 막는 장애물 및 재 프로그래밍에서 신진 대사의 역할과 관련된 생물학12의 몇 가지 근본적인 질문을 조사하기 위해 직접 신경 재 프로그래밍을위한 모델로서 성상 세포의 일차 배양을 사용하는 것을 강력히지지합니다.
여기서 우리는 뮤린 척수29로부터 성상세포를 분리함으로써 입증된 바와 같이, 매우 높은 순도로 출생 후 (P) 나이에 마우스로부터 성상세포를 분리하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 바이러스 형질도입 또는 DNA 플라스미드 형질감염을 통해 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공한다. 재프로그램된 세포는 형질도입 후 7일(7 DPT)에서 분석되어 리프로그래밍 효율 및 뉴런 형태학과 같은 다양한 측면을 평가하거나, 수주 동안 배양물에서 유지될 수 있고, 시간에 따른 성숙을 평가할 수 있다. 중요하게도, 이 프로토콜은 척수 성상세포에 특이적이지 않으며, 피질 회색 물질, 중뇌 및 소뇌를 포함한 다양한 다른 뇌 영역으로부터 성상세포를 분리하는데 용이하게 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

직접 뉴런 재 프로그래밍은 다능성 중간체를 통과하지 않고 다른 스타터 세포 집단에서 기능적 뉴런을 생성하는 강력한 접근법입니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환을 앓고있는 환자의 섬유 아세포를 뉴런으로 전환 할 수 있기 때문에 질병 모델링 분야에서 큰 약속을 지닐뿐만 아니라 세포 기반 대체 요법에 대한 유망한 대안을 나타냅니다. 이러한 맥락에서, 주요한 과학적 돌파구는 성상세포와 같은 중추신경계 내에서 분화된 비신경세포가 시험관내에서 기능적 뉴런으로 전환될 수 있다는 것을 입증하는 것이었다. 그 이후로, 성상세포를 뉴런으로 시험관 내에서 직접 재프로그래밍하는 것은 강제 정체성 변환의 기초가 되는 분자 메커니즘과 효율적인 재프로그래밍을 방해하는 장애물에 대한 실질적인 통찰을 제공했다. 그러나, 상이한 실험실에서 수행된 시험관내 실험으로부터의 결과는 성상세포를 분리, 배양 및 재프로그래밍하는데 사용되는 방법의 차이로 인해 비교하기가 어렵다. 여기에서는 자기 세포 분류를 통해 출생 후 생쥐의 중추 신경계의 다른 영역에서 고순도의 성상 세포를 안정적으로 분리하고 배양하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 바이러스 형질도입 또는 DNA 형질감염을 통해 배양된 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공합니다. 이 간소화되고 표준화 된 프로토콜은 세포 동일성 유지의 기초가되는 분자 메커니즘, 새로운 신경 정체성의 확립, 특정 신경 아류형의 생성 및 그 기능적 특성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

성상세포의 일차 배양은 일반적으로 MAC 분류 및 도금 후 7 일에서 10 일 사이에 80 % -90 % 합류율에 도달합니다 (그림 1B). 일반적으로, 단일 T25 배양 플라스크는 약 1-1.5 x 106 세포를 산출하며, 이는 웰 당 5-5.5 x 104 세포의 밀도로 세포를 시딩할 때 20-30 커버슬립에 충분하다. 도금 다음 날, 전지는 일반적으로 커버슬립 표면의 50%-60%를 덮는다(그림 1C...

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Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

성상 세포는 직접적인 신경 프로그래밍을 목표로 삼는 흥미로운 자가 집단입니다. 이 프로토콜은 다른 영역 또는 중추 신경계로부터 고순도로 배양 성상 세포를 분리하는 신뢰할 수있는 기술을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시작 집단의 성상 세포 순도 차이와 같은 교란 요인없이 성상 세포가 기능적 뉴런으로 재 프로그래밍 될 수있는 능력을 조사하도록 설계 및 최적화되었습니다.이 절차를 시연하는 것은 실험실의 박사후 연구원 인 Bob Hersbach와 실험실의 기술 지원 인 Tatiana Simon이 수행합니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 몸통을 35mm 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관하십시오. 가위로 피부를 열고 작은 가위로 척추를 제거하십시오.그런 다음 척수를 추출하여 얼음 위의 해부 완충액에 넣으십시오. 2 배 배율의 정위 해부 현미경에서 집게를 사용하여 분리 된 척수에서 수막을 제거하고 해부 및 청소 된 척수 조직을 C 튜브로 옮겼습니다. 신경 조직 해리 키트에서 50 마이크로 리터의 효소 P와 미리 준비된 30 마이크로 리터의 효소 혼합물을 각 C 튜브에 추가합니다.C 튜브를 뒤집어 가열된 해리 위에 올려 모든 조직이 튜브 뚜껑에 수집되도록 합니다. 800 마이크로리터의 성상세포 배양 배지를 첨가하고 포함된 플런저로 컬럼 밖으로 세포를 밀어내는 분리기로부터 컬럼을 제거하여 세포를 회피시킨다. 플레이트 세포는 이전에 제조된 배양 플라스크에 4.2 밀리리터의 성상세포 배양 배지를 첨가하여 EGF 및 bFGF의 밀리리터당 10 나노그램이 보충되었다.다른 뇌 영역에서 분리된 성상교세포에 대해 배양 플라스크를 코팅할 필요는 없지만 척수에서 분리된 성상세포에 더 나은 기질을 제공합니다. 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 세포를 배양하십시오. 안전 수준이 1인 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 성상세포 안착을 수행하고 텍스트 원고에 설명된 대로 Poly-D-Lysine 코팅 유리 커버 슬립이 있는 24웰 플레이트를 준비합니다.도금을 위해 P2 마우스에서 6 개의 척수를 분리하면 약 1 백만 개의 세포가 생성됩니다. 배양된 성상세포를 포함하는 T-12.5 배양 플라스크에서 배지를 흡인하고 1x PBS로 1회 세척합니다. 0.05% 트립신 EDTA 0.5밀리리터를 첨가하여 배양 플라스크에서 성상세포를 분리하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.플라스크의 측면을 부드럽게 두드려 배양 플라스크 표면에서 세포를 방출하고 10배 배율을 사용하여 명시야 현미경으로 분리 상태를 확인합니다. 2.5 밀리리터의 성상 세포 배양 배지로 트립시 나제 화를 중단하고 15 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 수집하십시오. 섭씨 4도에서 5분 동안 300RCF로 원심분리합니다.상청액을 흡인하고 1 밀리리터의 성상 세포 배양 배지에서 세포를 재보냅니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 농도를 계산합니다. 세포 수에 기초하여, EGF 및 bFGF가 보충된 새로운 성상세포 배지로 세포 현탁액을 인자당 밀리리터당 10나노그램으로 희석한다.이전에 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양 세포를 추가합니다. 49 밀리리터의 기본 배양 배지에 1 밀리리터 B27 보충제를 추가하여 신경 분화 배지를 준비하십시오. 24 내지 48 시간 후, 세포가 형질 도입되었는지 또는 형질 주입되었는지에 따라, 성상 세포 배지를 웰 당 1 밀리리터 뉴런 분화 배지로 대체한다.세포를 섭씨 37도에서 9%이산화탄소로 배양합니다. 리프로그래밍 효율을 높이려면 성상세포 배지를 분화 배지로 교체할 때 포스콜린과 도르소모르핀으로 뉴런 분화 배지를 각각 30마이크로몰 및 1마이크로몰의 최종 농도로 보충합니다. 포스콜린 및 도르소모르핀으로 세포를 치료하기로 선택할 때 초기 치료 2일 후에 도르소모르핀의 두 번째 용량을 제공합니다.이 두 번째 처리를 배양 배지에 직접 추가합니다. 성상 세포의 1 차 배양은 자기 보조 세포 분류 및 도금 후 7 일에서 10 일 사이에 80-90 % confluency에 도달했습니다. 도금 다음 날, 셀은 전형적으로 커버 슬립 표면의 50 내지 60%를 덮었다.배양은 주로 이 단계에서 성상교세포로 구성되었지만 신경 모세포와 같은 다른 세포 유형은 사실상 없었습니다. 형질도입 또는 형질감염 후 7일째에, 유도된 뉴런 세포는 성상세포와 명확하게 구별될 수 있었다. 뉴런 세포 소마는 재프로그래밍되지 않은 성상세포보다 작았으며 과정이 길었고 뉴런 마커, 베타 3 튜불린에 대해 양성이었고 성상세포 마커 GFAP에 대해 음성이었습니다.형질도입 또는 형질주입 후 21일째에 많은 유도 뉴런이 활동 전위를 발화할 수 있었고 성숙한 뉴런 마커 NeuN 및 범시냅스 단백질 시냅토피신에 대해 양성이었습니다. 관심 영역을 적절하게 해부하는 것이 필수적입니다. 주변 조직의 오염을 방지합니다.격리 된 척수에서 수막과 등근 신경절을 제거하는 데주의를 기울여야합니다. 이 방법은 대뇌 피질, 등쪽 중뇌 및 소뇌를 포함한 중추 신경계의 다양한 영역에서 성상 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 앞으로이 기술을 통해 우리는 지역 성상 세포에 대한 지식과 기능적 뉴런으로 재 프로그래밍 될 수있는 잠재력을 확장 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

연구

신경과학

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후<em&gt; 인 체외</em&gt; 허혈

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

크기, 모양, 및 결합 된 이다의 네트워크의 방향 분석

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...