Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Vi takker Ines Mühlhahn for kloning av konstruksjonene for omprogrammering, Paulina Chlebik for viral produksjon, og Magdalena Götz og Judith Fischer-Sternjak for kommentarer til manuskriptet.

Følgende prosedyre følger retningslinjene for dyrepleie fra Helmholtz Zentrum München i samsvar med direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Sørg for å overholde retningslinjene for dyrepleie ved institusjonen der disseksjonen utføres.
1. Fremstilling av disseksjons-, dissosiasjons- og kulturmaterialer
MERK: Klargjør alle dyrkningsreagenser i et biologisk sikkerhetsskap og arbeid med kun autoklavert eller...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

Primære kulturer av murine astrocytter er et bemerkelsesverdig in vitro modellsystem for å studere direkte neuronal omprogrammering. Faktisk, til tross for at de er isolert på et postnatalstadium, uttrykker celler typiske astrocyttmarkører29, beholder uttrykket av mønstergener 28,29, og opprettholder kapasiteten til å spre seg, lik in vivo astrocytter i en sammenlignbar alder38. Etter MACS-me...

Pattedyrets sentralnervesystem (CNS) er svært komplekst, og består av hundrevis av forskjellige celletyper, inkludert et stort antall forskjellige nevronale subtyper 1,2,3,4,5,6. I motsetning til andre organer eller vev 7,8,9 har pattedyrets CNS en svært begrenset regenerativ kapasitet; nevrontap etter traumatisk hjerneskade eller nevrodegenerasjon er irreversibel og resulterer ofte i motoriske og kognitive underskudd10. Med sikte på å redde hjernefunksjoner, er forskjellige strategier for å erstatte tapte nevroner under intens undersøkelse11. Blant dem fremstår direkte omprogrammering av somatiske celler til funksjonelle nevroner som en lovende terapeutisk tilnærming12. Direkte omprogrammering, eller transdifferensiering, er prosessen med å konvertere en differensiert celletype til en ny identitet uten å passere gjennom en mellomliggende proliferativ eller pluripotent tilstand 13,14,15,16. Banebrytende ved identifisering av MyoD1 som en faktor som er tilstrekkelig til å konvertere fibroblaster til muskelceller17,18, har denne metoden blitt brukt til å omprogrammere flere celletyper til funksjonelle nevroner 19,20,21.
Astrocytter, den mest tallrike makroglia i CNS22,23, er en spesielt lovende celletype for direkte neuronal omprogrammering av flere grunner. For det første er de bredt og jevnt fordelt over CNS, noe som gir en rikelig i loco kilde for nye nevroner. For det andre er astrocytter og nevroner utviklingsmessig nært beslektet, da de deler en felles forfader under embryonal utvikling, de radiale gliacellene24. Den felles embryonale opprinnelsen til de to celletypene ser ut til å lette nevronkonvertering sammenlignet med omprogrammering av celler fra forskjellige kimlag19,21. Videre opprettholdes mønsterinformasjon arvet av astrocytter gjennom deres radiale glia-opprinnelse også i voksne astrocytter 25,26,27, og ser ut til å bidra til generering av regionalt passende nevronale subtyper 28,29,30. Derfor er undersøkelse og forståelse av konvertering av astrocytter til nevroner en viktig del av å oppnå det fulle potensialet i denne teknikken for cellebaserte erstatningsstrategier.
Omdannelsen av in vitro-dyrkede astrocytter til nevroner har ført til flere gjennombrudd innen direkte nevronal omprogrammering, inkludert: i) identifisering av transkripsjonsfaktorer som er tilstrekkelige til å generere nevroner fra astrocytter 15,19,31, ii) oppløsningen av molekylære mekanismer utløst av forskjellige omprogrammeringsfaktorer i samme cellulære kontekst 32 , og iii) fremheve virkningen av utviklingsopprinnelsen til astrocytter på å indusere forskjellige nevronale subtyper 28,29,33. Videre unravelled in vitro direkte konvertering av astrocytter flere store hindringer som begrenser direkte neuronal omprogrammering34,35, for eksempel økt reaktiv oksygenart (ROS) produksjon34 og forskjeller mellom mitokondriell proteom av astrocytter og nevroner35. Derfor støtter disse observasjonene sterkt bruken av primære kulturer av astrocytter som en modell for direkte neuronal omprogrammering for å undersøke flere grunnleggende spørsmål i biologi12, relatert til vedlikehold av celleidentitet, veisperringer som forhindrer celleskjebneendringer, samt metabolismens rolle i omprogrammering.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å isolere astrocytter fra mus i postnatal (P) alder med svært høy renhet, som vist ved å isolere astrocytter fra murine ryggmargen29. Vi tilbyr også protokoller for å omprogrammere astrocytter til nevroner via viral transduksjon eller DNA-plasmidtransfeksjon. Omprogrammerte celler kan analyseres 7 dager etter transduksjon (7 DPT) for å vurdere ulike aspekter, for eksempel omprogrammeringseffektivitet og nevronmorfologi, eller kan opprettholdes i kultur i flere uker, for å vurdere modningen over tid. Det er viktig at denne protokollen ikke er spesifikk for ryggmargs astrocytter og kan lett brukes til å isolere astrocytter fra forskjellige andre hjernegrupper, inkludert kortikal grå substans, midthjerne og cerebellum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

Direkte neuronal omprogrammering er en kraftig tilnærming for å generere funksjonelle nevroner fra forskjellige startcellepopulasjoner uten å passere gjennom multipotente mellomprodukter. Denne teknikken har ikke bare store løfter innen sykdomsmodellering, da det gjør det mulig å konvertere for eksempel fibroblaster for pasienter som lider av nevrodegenerative sykdommer til nevroner, men representerer også et lovende alternativ for cellebaserte erstatningsterapier. I denne sammenheng var et stort vitenskapelig gjennombrudd demonstrasjonen av at differensierte ikke-nevrale celler i sentralnervesystemet, som astrocytter, kunne omdannes til funksjonelle nevroner in vitro. Siden da har in vitro direkte omprogrammering av astrocytter i nevroner gitt betydelig innsikt i de molekylære mekanismene som ligger til grunn for tvungen identitetskonvertering og hindringene som forhindrer effektiv omprogrammering. Resultater fra in vitro-eksperimenter utført i forskjellige laboratorier er imidlertid vanskelige å sammenligne på grunn av forskjeller i metodene som brukes til å isolere, dyrke og omprogrammere astrocytter. Her beskriver vi en detaljert protokoll for pålitelig å isolere og dyrke astrocytter med høy renhet fra forskjellige regioner i sentralnervesystemet hos mus i postnatal alder via magnetisk cellesortering. Videre gir vi protokoller for å omprogrammere dyrkede astrocytter til nevroner via viral transduksjon eller DNA-transfeksjon. Denne strømlinjeformede og standardiserte protokollen kan brukes til å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for vedlikehold av celleidentitet, etablering av en ny nevronidentitet, samt generering av spesifikke nevronale subtyper og deres funksjonelle egenskaper.

Primære kulturer av astrocytter når vanligvis 80% -90% samløp mellom 7 og 10 dager etter MAC-sortering og plating (figur 1B). Vanligvis gir en enkelt T25 kulturkolbe rundt 1-1,5 x 106 celler, noe som er tilstrekkelig for 20-30 deksler ved såing av celler med en tetthet på 5-5,5 x 104 celler per brønn. Dagen etter plating dekker cellene vanligvis 50% -60% av dekslipoverflaten (figur 1C). På dette stadiet består kulturer nesten uteluk...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å generere høyt berikede kulturer av astrocytter avledet fra forskjellige regioner i sentralnervesystemet hos postnatale mus og deres direkte konvertering til funksjonelle nevroner ved tvungen uttrykk for transkripsjonsfaktorer.

Isolering og direkte neuronal omprogrammering av mus astrocytter

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Astrocytter er en interessant autogen populasjon å målrette mot direkte neuronal programmering. Denne protokollen gir en pålitelig teknikk for å isolere kulturastrocytter med høy renhet fra forskjellige regioner eller sentralnervesystemet. Denne protokollen er utformet og optimalisert for å undersøke astrocytters evne til å bli omprogrammert til funksjonelle nevroner uten forvirrende faktorer som forskjeller i astrocytter renhet av ulike oppstart befolkningen.Demonstrere prosedyren vil bli gjort av Bob Hersbach, Postdoc i laboratoriet, og Tatiana Simon en teknisk assistanse i vårt laboratorium. For å begynne, legg overkroppen til en avlivet mus i en 35 millimeter petriskål og hold den på is. Åpne huden med saks og fjern ryggvirvelen med liten saks.Deretter trekker du ut ryggmargen og legger den i en disseksjonsbuffer på is. Under et stereotaktisk disseksjonsmikroskop med to ganger forstørrelse, fjern meningene fra de isolerte ryggmargene ved hjelp av tang og overført dissekert og rengjort ryggmargsvev til et C-rør. Tilsett 50 mikroliter enzym P fra nevralvevets dissosiasjonssett og 30 mikroliter tidligere tilberedt enzymblanding til hvert C-rør.Inverter C-rørene og legg dem på en oppvarmet dissosiert slik at alt vev samles i rørets lokk. Elude celler ved å fjerne kolonnen fra separatoren og legge til 800 mikroliter astrocyttkulturmedium og skyve celler ut av kolonnen med det medfølgende stempelet. Plateceller i de tidligere tilberedte kulturkolber ved å tilsette 4,2 milliliter astrocyttkulturmedium supplert med 10 nanogram per milliliter EGF og bFGF.Det er ikke nødvendig å belegge kulturkolber for astrocytter isolert fra andre hjernegrupper, men det gir et bedre substrat for astrocytter isolert fra ryggmargen. Kultur cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Utfør astrocyttseter under et biologisk sikkerhetsskap med sikkerhetsnivå en og forbered 24 brønnplater med Poly-D-Lysinbelagte glassdeksel som beskrevet i tekstmanuskriptet.For plating, isoler seks ryggmarger fra P2 mus gir rundt 1 million celler. Aspirate media fra T-12.5 kultur kolber som inneholder de kultiverte astrocytter og vaske en gang med 1x PBS. Løsne astrocytter fra kulturkolben ved å tilsette 0,5 milliliter 0,05% trypsin EDTA og inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter.Trykk forsiktig på siden av kolben for å frigjøre celler fra kulturkolbens overflate og kontroller løsrivelse under et lysfeltmikroskop ved hjelp av en 10 ganger forstørrelse. Stopp trypsinazation med 2,5 milliliter astrocyttkulturmedium og samle cellesuspensjon i 15 milliliter rør. Sentrifuge ved 300 RCF i fem minutter ved fire grader Celsius.Aspirer supernatant og send celler på nytt i en milliliter astrocyttkulturmedium. Beregn cellekonsentrasjon ved hjelp av et hemocytometer eller et automatisert celletellingssystem. Basert på antall celler, fortynn cellesuspensjonen med fersk astrocyttmedium supplert med EGF og bFGF ved 10 nanogram per milliliter per faktor.Tilsett 500 mikroliter av cellesuspensjonen til hver brønn i de tidligere tilberedte 24 brønnplatene og kulturcellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Forbered neuronal differensieringsmedium ved å legge til en milliliter B27 supplement til 49 milliliter grunnleggende kulturmedium. Etter 24 til 48 timer, avhengig av om celler har blitt transdusert eller transfisert, erstatt astrocyttmedium med ett milliliter nevrondifferensieringsmedium per brønn.Kultur cellene ved 37 grader Celsius med 9% karbondioksid. For å øke omprogrammeringseffektiviteten, suppler det nevronale differensieringsmediet med forskolin og dorsomorfin til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 30 mikromolar og en mikromolar når astrocyttmediet erstattes med differensieringsmediet. Når du velger å behandle celler med forskolin og dorsomorphin gi en andre dose av dorsomorphin to dager etter den første behandlingen.Legg denne andre behandlingen direkte til kulturmediet. Primære kulturer av astrocytter nådde 80 til 90% sammenløp mellom syv til 10 dager etter magnetisk assistert cellesortering og plating. Dagen etter plating dekket cellene vanligvis 50 til 60% av dekselets glideflate.Kulturer besto hovedsakelig av astrocytter på dette stadiet, mens andre celletyper som nevroeksplosjoner var nesten fraværende. Syv dager etter transduksjon eller transfeksjon var induserte nevronceller klart atskilt fra astrocytter. Nevroncellen soma var mindre enn ikke-programmerte Astrocytter hadde lange prosesser og var positiv for nevronmarkør, beta tre tubulin og negativ for astrocyttmarkør GFAP.Ved 21 dager etter transduksjon eller transfeksjon var mange induserte nevroner i stand til å skyte handlingspotensialer og var positive for den modne nevronmarkøren NeuN og det pansynaptiske proteinet Synaptophysin. Det er viktig å dissekere interesseområdet riktig. Unngå forurensning fra omkringliggende vev.Det må tas hensyn til å fjerne meningene og dorsorotgangliene fra den isolerte ryggmargen. Denne metoden kan brukes til å isolere astrocytter fra forskjellige regioner i sentralnervesystemet, inkludert hjernebarken, dorsal midthjerne og cerebellum. I fremtiden vil denne teknikken tillate oss å utvide vår kunnskap om regionale astrocytter og deres potensial til å bli omprogrammert til funksjonelle nevroner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Kjønnsforskjeller i Muse Hippokampale Astrocytter etter<em&gt; In-Vitro</em&gt; iskemi

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk Transkraniell elektrisk stimulering og Intracortical opptak i rotter

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analysere størrelse, form og retningen av nettverk av kombinert astrocyttene

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo Direct omprogrammering av Resident gliacellene Cells til Interneurons av Intracerebrale injeksjon av viral vektorer

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisere og analysere intracellulære transport av organeller og andre cargos i astrocytter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markører for å individualisere kortikale mus astrocytter

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal Differensiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

In vitro Modellering for nevrologiske sykdommer ved hjelp av direkte konvertering fra fibroblaster til nevronale stamceller og differensiering til astrocytter

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...