Name: isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Vi vill tacka Ines Mühlhahn för kloning av konstruktionerna för omprogrammering, Paulina Chlebik för viral produktion och Magdalena Götz och Judith Fischer-Sternjak för kommentarer till manuskriptet.

Följande förfarande följer riktlinjerna för djuromsorg från Helmholtz Zentrum München i enlighet med direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Se till att följa riktlinjerna för djurvård från den institution där dissektion utförs.
1. Beredning av dissektion, dissociation och odlingsmaterial
OBS: Förbered alla odlingsreagenser i ett biologiskt säkerhetsskåp och arbeta med endast autoklaverad eller st...

<ol>
	<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing.">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex.">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li><li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord:+a+time+and+a+place.">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system.">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).</li><li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types.">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 101-108 (2020).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+therapy:+previous+achievements+and+challenges+ahead.">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).</li><li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming.">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li><li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches.">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li><li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT/enhancer+binding+protein+alpha+(C/EBP(alpha))-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation.">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li><li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells.">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq.">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia.">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons.">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons,+glia,+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex.">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution.">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).</li><li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain.">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li><li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4.">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).</li><li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming.">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2.">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).</li><li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex.">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li><li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+generate+neurons:+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6.">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li><li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes.">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion.">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming.">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion.">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state.">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming.">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4a/Arf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation.">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody.">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li></ol>

Primära kulturer av murina astrocyter är ett anmärkningsvärt in vitro-modellsystem för att studera direkt neuronal omprogrammering. Faktum är att trots att de isoleras i ett postnatalt stadium uttrycker celler typiska astrocytmarkörer29, behåller uttrycket av mönstringsgener 28,29 och upprätthåller förmågan att föröka sig, liknande in vivo-astrocyter vid en jämförbar ålder38. Efte...

Däggdjurets centrala nervsystem (CNS) är mycket komplext och består av hundratals olika celltyper, inklusive ett stort antal olika neuronala subtyper 1,2,3,4,5,6. Till skillnad från andra organ eller vävnader 7,8,9 har däggdjurets CNS en mycket begränsad regenerativ kapacitet; neuronal förlust efter traumatisk hjärnskada eller neurodegeneration är irreversibel och resulterar ofta i motoriska och kognitiva underskott10. I syfte att rädda hjärnfunktioner är olika strategier för att ersätta förlorade nervceller under intensiv utredning11. Bland dem framträder direkt omprogrammering av somatiska celler till funktionella neuroner som ett lovande terapeutiskt tillvägagångssätt12. Direkt omprogrammering, eller transdifferentiering, är processen att konvertera en differentierad celltyp till en ny identitet utan att passera genom ett mellanliggande proliferativt eller pluripotent tillstånd 13,14,15,16. Banbrytande genom identifieringen av MyoD1 som en faktor som är tillräcklig för att omvandla fibroblaster till muskelceller17,18, har denna metod framgångsrikt tillämpats för att omprogrammera flera celltyper till funktionella neuroner 19,20,21.
Astrocyter, den vanligaste makroglian i CNS22,23, är en särskilt lovande celltyp för direkt neuronal omprogrammering av flera skäl. För det första är de brett och jämnt fördelade över CNS, vilket ger en riklig loco-källa för nya neuroner. För det andra är astrocyter och neuroner utvecklingsmässigt nära besläktade, eftersom de delar en gemensam förfader under embryonal utveckling, de radiella glialcellerna24. Det gemensamma embryonala ursprunget för de två celltyperna verkar underlätta neuronal omvandling jämfört med omprogrammering av celler från olika bakterielager19,21. Dessutom upprätthålls mönstringsinformation som ärvts av astrocyter genom deras radiella glia-ursprung också i vuxna astrocyter 25,26,27 och verkar bidra till genereringen av regionalt lämpliga neuronala subtyper 28,29,30. Därför är undersökning och förståelse av omvandlingen av astrocyter till neuroner en viktig del av att uppnå den fulla potentialen för denna teknik för cellbaserade ersättningsstrategier.
Omvandlingen av in vitro-odlade astrocyter till neuroner har lett till flera genombrott inom området direkt neuronal omprogrammering, inklusive: i) identifiering av transkriptionsfaktorer som är tillräckliga för att generera neuroner från astrocyter 15,19,31, ii) upplösning av molekylära mekanismer som utlöses av olika omprogrammeringsfaktorer i samma cellulära sammanhang 32 , och iii) belysa effekten av astrocyternas utvecklingsmässiga ursprung på inducering av olika neuronala subtyper 28,29,33. Dessutom avslöjade direkt omvandling av astrocyter in vitro flera stora hinder som begränsar direkt neuronal omprogrammering34,35, såsom ökad produktion av reaktiva syrearter (ROS)34 och skillnader mellan mitokondriellt proteom av astrocyter och neuroner35. Därför stöder dessa observationer starkt användningen av primära kulturer av astrocyter som en modell för direkt neuronal omprogrammering för att undersöka flera grundläggande frågor i biologi12, relaterade till cellidentitetsunderhåll, vägspärrar som förhindrar cell ödesförändringar, samt metabolismens roll i omprogrammering.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att isolera astrocyter från möss vid postnatal (P) ålder med mycket hög renhet, vilket demonstreras genom att isolera astrocyter från den murina ryggmärgen29. Vi tillhandahåller också protokoll för att omprogrammera astrocyter till nervceller via viral transduktion eller DNA-plasmidtransfektion. Omprogrammerade celler kan analyseras vid 7 dagar efter transduktion (7 DPT) för att bedöma olika aspekter, såsom omprogrammeringseffektivitet och neuronal morfologi, eller kan bibehållas i odling i flera veckor för att bedöma deras mognad över tid. Viktigt är att detta protokoll inte är specifikt för ryggmärgsastrocyter och kan lätt appliceras för att isolera astrocyter från olika andra hjärnregioner, inklusive kortikal grå substans, mellanhjärna och cerebellum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG1 Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse IgG1 Biotin</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG2b Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>Cat# 18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (Transfection reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainer 70&#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Seperator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (&#946;III-tub)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM &#8211; GlutaMAX (serum-reduced medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Sox9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa 405</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# S32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes

Direkt neuronal omprogrammering är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att generera funktionella neuroner från olika startcellpopulationer utan att passera genom multipotenta intermediärer. Denna teknik har inte bara stora löften inom sjukdomsmodellering, eftersom det gör det möjligt att konvertera till exempel fibroblaster för patienter som lider av neurodegenerativa sjukdomar till neuroner, men representerar också ett lovande alternativ för cellbaserade ersättningsterapier. I detta sammanhang var ett stort vetenskapligt genombrott demonstrationen att differentierade icke-neurala celler i centrala nervsystemet, såsom astrocyter, kunde omvandlas till funktionella neuroner in vitro. Sedan dess har direkt omprogrammering av astrocyter in vitro till nervceller gett betydande insikter om de molekylära mekanismerna bakom tvångsidentitetsomvandling och de hinder som förhindrar effektiv omprogrammering. Resultat från in vitro-experiment utförda i olika laboratorier är dock svåra att jämföra på grund av skillnader i de metoder som används för att isolera, odla och omprogrammera astrocyter. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att på ett tillförlitligt sätt isolera och odla astrocyter med hög renhet från olika regioner i centrala nervsystemet hos möss vid postnatala åldrar via magnetisk cellsortering. Dessutom tillhandahåller vi protokoll för att omprogrammera odlade astrocyter till nervceller via viral transduktion eller DNA-transfektion. Detta strömlinjeformade och standardiserade protokoll kan användas för att undersöka de molekylära mekanismerna som ligger till grund för underhåll av cellidentitet, upprättandet av en ny neuronal identitet, samt genereringen av specifika neuronala subtyper och deras funktionella egenskaper.

Primära kulturer av astrocyter når vanligtvis 80% -90% sammanflöde mellan 7 och 10 dagar efter MAC-sortering och plätering (figur 1B). I allmänhet ger en enda T25-odlingskolv cirka 1-1,5 x 106 celler, vilket är tillräckligt för 20-30 täckglas vid sådd av celler med en densitet av 5-5,5 x 104 celler per brunn. Dagen efter plätering täcker celler vanligtvis 50% -60% av täckglasytan (figur 1C). I detta skede består kulturer näst...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes at JoVE.com

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att generera högt berikade kulturer av astrocyter härledda från olika regioner i centrala nervsystemet hos postnatala möss och deras direkta omvandling till funktionella neuroner genom tvångsuttryck av transkriptionsfaktorer.

Isolering och direkt neuronal omprogrammering av musastrocyter

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Astrocyter är en intressant autogen population att rikta in sig på för direkt neuronal programmering. Detta protokoll ger en pålitlig teknik för att isolera odlingsastrocyter med hög renhet från olika regioner eller centrala nervsystemet. Detta protokoll är utformat och optimerat för att undersöka astrocyternas förmåga att omprogrammeras till funktionella neuroner utan förvirrande faktorer som skillnader i astrocyterrenhet hos olika startpopulationer.Demonstrera proceduren kommer att göras av Bob Hersbach, postdoktor i labbet, och Tatiana Simon en teknisk hjälp i vårt laboratorium. För att börja, placera torso på en avlivad mus i en 35 millimeter petriskål och håll den på is. Öppna huden med sax och ta bort ryggkotan med liten sax.Extrahera sedan ryggmärgen och placera den i en dissektionsbuffert på is. Under ett stereotaktiskt dissektionsmikroskop med två gånger förstoring, ta bort hjärnhinnorna från de isolerade ryggmärgarna med pincett och överförde dissekerad och rengjord ryggmärgsvävnad till ett C-rör. Tillsätt 50 mikroliter enzym P från neuralvävnadsdissociationssatsen och 30 mikroliter tidigare beredd enzymblandning till varje C-rör.Vänd C-rören och placera dem på en uppvärmd dissocierad så att all vävnad samlas i rörets lock. Elude celler genom att ta bort kolonnen från separatorn och lägga till 800 mikroliter astrocytodlingsmedium och skjuta celler ut ur kolonnen med den medföljande kolven. Plåtceller i de tidigare beredda odlingskolvarna genom tillsats av 4,2 ml astrocytodlingsmedium kompletterat med 10 nanogram per milliliter EGF och bFGF.Det är inte nödvändigt att belägga odlingskolvarna för astrocyter isolerade från andra hjärnregioner men det ger ett bättre substrat för astrocyter isolerade från ryggmärgen. Odla cellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Utför astrocytplatser under ett biologiskt säkerhetsskåp med en säkerhetsnivå ett och förbered 24 brunnsplattor med Poly-D-lysinbelagda glasöverdrag som beskrivs i textmanuskriptet.För plätering, isolera sex ryggmärgar från P2-möss ger cirka 1 miljon celler. Aspirera media från T-12.5-odlingskolvarna som innehåller de odlade astrocyterna och tvätta en gång med 1x PBS. Lossa astrocyterna från odlingskolven genom att tillsätta 0,5 ml 0,05% trypsin EDTA och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter.Knacka försiktigt på sidan av kolven för att frigöra celler från odlingskolvens yta och kontrollera lossningen under ett ljusfältmikroskop med en förstoring på 10 gånger. Stoppa trypsinazation med 2,5 ml astrocytodlingsmedium och samla cellsuspension i 15 ml rör. Centrifugera vid 300 RCF i fem minuter vid fyra grader Celsius.Aspirera supernatant och skicka celler i en milliliter astrocytodlingsmedium. Beräkna cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer eller ett automatiserat cellräkningssystem. Baserat på antalet celler, späd cellsuspensionen med färskt astrocytmedium kompletterat med EGF och bFGF vid 10 nanogram per milliliter per faktor.Tillsätt 500 mikroliter av cellsuspensionen till varje brunn i de tidigare beredda 24 brunnsplattorna och odlingscellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Förbered neuronalt differentieringsmedium genom att tillsätta en milliliter B27-tillskott till 49 ml basiskt odlingsmedium. Efter 24 till 48 timmar, beroende på om celler har transducerats eller transfekterats, ersätt astrocytmedium med ett milliliter neuronalt differentieringsmedium per brunn.Odla cellerna vid 37 grader Celsius med 9% koldioxid. För att öka omprogrammeringseffektiviteten, komplettera det neuronala differentieringsmediet med forskolin och dorsomorfin till en slutlig koncentration av 30 mikromolar respektive en mikromolar när astrocytmediet ersätts med differentieringsmediet. När man väljer att behandla celler med forskolin och dorsomorfin ge en andra dos dorsomorfin två dagar efter den första behandlingen.Lägg till denna andra behandling direkt till odlingsmediet. Primära kulturer av astrocyter nådde 80 till 90% sammanflöde mellan sju och 10 dagar efter magnetisk assisterad cellsortering och plätering. Dagen efter plätering täckte cellerna vanligtvis 50 till 60% av täckets glidyta.Kulturer bestod huvudsakligen av astrocyter i detta skede, medan andra celltyper som neuroblaster var praktiskt taget frånvarande. Vid sju dagar efter transduktion eller transfektion kunde inducerade neuronala celler tydligt särskiljas från astrocyter. Den neuronala cellsomen var mindre än oprogrammerade astrocyter hade långa processer och var positiv för neuronal markör, beta tre tubulin och negativ för astrocytmarkör GFAP.Vid 21 dagar efter transduktion eller transfektion kunde många inducerade neuroner skjuta åtgärdspotentialer och var positiva för den mogna neuronala markören NeuN och det pansynaptiska proteinet Synaptophysin. Det är viktigt att ordentligt dissekera den intressanta regionen. Undvik kontaminering från omgivande vävnad.Försiktighet måste vidtas för att ta bort hjärnhinnorna och dorsorotganglierna från den isolerade ryggmärgen. Denna metod kan användas för att isolera astrocyter från olika regioner i centrala nervsystemet inklusive hjärnbarken, dorsal midbrain och cerebellum. I framtiden kommer denna teknik att göra det möjligt för oss att utöka vår kunskap om regionala astrocyter och deras potential att omprogrammeras till funktionella neuroner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolering och odling av Mus Kortikala Astrocyter

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Könsskillnader i Mouse Hippocampus Astrocyter efter<em&gt; In-vitro</em&gt; Ischemi

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk transkraniell elektrisk stimulering och Intracortical inspelning hos råttor

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analysera den storlek, form och riktningen av nätverk av kopplade astrocyter

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo direkt omprogrammering av bosatta gliaceller i interneuroner genom intracerebral injektion av virala vektorer

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisera och analysera intracellulär transport av organeller och andra laster i astrocyter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

I Utero Electroporation av multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markörer för att individualisera närmus astrocyter

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering från mus embryonala stamceller in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

In vitro-modellering för neurologiska sjukdomar med direkt omvandling från fibroblaster till neuronala stamceller och differentiering till astrocyter

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...