Name: far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃŽÂ²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

نشكر المرفق الأساسي لقياس الخلايا والأجسام المضادة في جامعة شيكاغو على الدعم في أجهزة قياس التدفق الخلوي. قدم مركز أبحاث الحيوان في جامعة شيكاغو مساكن للحيوانات.

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة شيكاغو.
1. إعداد وتخزين حلول المخزون
ملاحظة: إذا كانت الخلايا سيتم فرزها بالتدفق ، فيجب تحضير جميع المحاليل باستخدام تقنيات معقمة وتصفيتها من خلال ?...

<ol>
	<li>Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+escape+from+therapy-induced+senescence+as+a+model+of+disease+recurrence+after+dormancy.">Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy.</a> Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).</li><li>Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+in+cancer+therapy:+friends+or+foes.">Senescent cells in cancer therapy: friends or foes.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).</li><li>Prasanna, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+senescence:+Opportunities+to+improve+anticancer+therapy.">Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).</li><li>Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+and+their+secretory+phenotype+as+targets+for+cancer+therapy.">Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy.</a> Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).</li><li>Ou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer:+from+mechanisms+to+detection.">Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection.</a> Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cellular+senescence.">Hallmarks of cellular senescence.</a> Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).</li><li>Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+senescence+phenotype+of+cancer+cells+treated+with+chemotherapeutic+agents.">Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents.</a> Cells. 8 (12), 1501 (2019).</li><li>Miku&#322;a-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Ksi&#261;&#380;ek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+significance+of+therapy-induced+and+spontaneous+senescence+of+cancer+cells.">Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+senescence-associated+&#946;+galactosidase.">Colorimetric detection of senescence-associated &#946; galactosidase.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Tung, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+&#946;-galactosidase+activity+using+far+red+fluorescent+switch.">In vivo imaging of &#946;-galactosidase activity using far red fluorescent switch.</a> Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Galactosidase+activity+assay+using+far-red-shifted+fluorescent+substrate+DDAOG.">beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG.</a> Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin:+Mechanisms+of+formation+and+increase+with+age.">Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age.</a> APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).</li><li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues.">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li><li>Wang, B., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+define+and+target+cellular+senescence+in+cancer.">The quest to define and target cellular senescence in cancer.</a> Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).</li><li>Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+radiotherapy+targets+macromolecules+through+altering+the+tumor+microenvironment.">Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).</li><li>Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+multicolor+flow+cytometry.">Basic multicolor flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).</li><li>Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cell+depletion+through+targeting+BCL-family+proteins+and+mitochondria.">Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria.</a> Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).</li><li>Kim, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+senescent+cell+surface+targetable+protein+DPP4.">Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4.</a> Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).</li><li>Flor, A. C., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-derived+reactive+aldehydes+link+oxidative+stress+to+cell+senescence.">Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence.</a> Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).</li><li>Jochems, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+SENESCopedia:+A+delineation+of+cancer+cell+senescence.">The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence.</a> Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).</li><li>Fallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+and+liposomal+doxorubicin+induce+senescence+by+enhancing+nuclear+factor+kappa+B+and+mitochondrial+membrane+potential.">Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential.</a> Life Sciences. 232, 116677 (2019).</li><li>Kasper, M., Barth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin+and+its+role+in+inducing+apoptosis+and+senescence+in+lung+cells+-+modulating+effects+of+caveolin-1.">Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1.</a> Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).</li><li>Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+EMT+crosstalk+in+bleomycin-induced+pathogenesis+of+pulmonary+fibrosis-an+in+vitro+analysis.">Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis.</a> Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).</li><li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism,+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence.">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).</li><li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16(INK4a)-luciferase+model.">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li><li>Liu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+exhibiting+strong+p16+(INK4a)+promoter+activation+in+vivo+display+features+of+senescence.">Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).</li><li>Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+senescence+for+the+treatment+of+cancer.">Exploiting senescence for the treatment of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).</li><li>Baek, K. -. H., Ryeom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+oncogene-induced+senescence+in+vivo.">Detection of oncogene-induced senescence in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).</li><li>Gonz&#225;lez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Mu&#241;oz-Esp&#237;n, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

على مدى العقد الماضي أو نحو ذلك ، أصبح قياس التدفق الخلوي منصة فحص أكثر شيوعا في أبحاث السرطان بسبب الشعبية الناشئة لعلم المناعة السرطاني ، وتطوير مقاييس التدفق الخلوي منخفضة التكلفة ، وتحسين مرافق الأجهزة المشتركة في المؤسسات الأكاديمية. أصبحت المقايسات متعددة الألوان قياسية الآن ، حيث...

تتراكم الخلايا الهرمة عادة في الكائنات الحية على مدى سنوات أثناء الشيخوخة البيولوجية الطبيعية ولكنها قد تتطور أيضا بسرعة في الخلايا السرطانية كرد فعل للضرر الناجم عن علاجات السرطان المختلفة ، بما في ذلك الإشعاع والعلاج الكيميائي. على الرغم من أنها لم تعد تتكاثر ، إلا أن الخلايا السرطانية الهرمة التي يسببها العلاج (TIS) قد تساهم في مقاومة العلاج وتدفع التكرار1،2،3. يمكن أن تؤدي العوامل التي تفرزها خلايا TIS إلى تفاقم الورم الخبيث عن طريق تعزيز التهرب المناعي أو ورم خبيث 4,5. تطور خلايا TIS أنماطا ظاهرية معقدة ومحددة السياق ، وملفات أيضية متغيرة ، واستجابات مناعية فريدة6،7،8. لذلك ، فإن تحديد وتوصيف الخلايا السرطانية TIS التي تسببها مناهج علاج السرطان المختلفة هو موضوع يحظى باهتمام مستمر لمجتمع أبحاث السرطان.
للكشف عن الخلايا السرطانية TIS ، تستخدم فحوصات الشيخوخة التقليدية على نطاق واسع ، وتعتمد بشكل أساسي على اكتشاف النشاط المتزايد لإنزيم علامة الشيخوخة ، بيتا غالاكتوزيداز GLB19 الليزوزومي. يسمح الكشف عند درجة حموضة ليزوزومية شبه محايدة (وليس حمضية) بالكشف المحدد عن بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-Gal)10. يستخدم اختبار SA-β-Gal القياسي الذي تم استخدامه لعدة عقود X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ، وهو ركيزة بيتا غالاكتوزيداز زرقاء كروموجينية ، للكشف عن SA-β-Gal في الخلايا الثابتة عن طريق الفحص المجهريالضوئي 11. يسمح اختبار X-Gal بالتأكيد البصري النوعي لنظام TIS باستخدام الكواشف ومعدات المختبرات المتاحة بشكل شائع. المجهر الضوئي الأساسي المنقول هو الأجهزة الوحيدة المطلوبة لتقييم وجود الكروموجين الأزرق. ومع ذلك ، يمكن أن يفتقر إجراء تلطيخ X-Gal إلى الحساسية ، ويتطلب أحيانا أكثر من 24 ساعة حتى يتطور اللون. يتبع التلوين تسجيل ذاتي منخفض الإنتاجية للخلايا الهرمة الفردية بناء على حساب الخلايا التي تظهر مستوى معينا من شدة الكروموجين الأزرق تحت المجهر الضوئي. نظرا لأن X-Gal غير منفذ للخلية ، فإن هذا الفحص يتطلب خلايا ثابتة بالمذيبات ، والتي لا يمكن استردادها لتحليل المصب. عند العمل مع عينات محدودة من الحيوانات أو المرضى ، يمكن أن يكون هذا عيبا كبيرا.
مقايسات SA-β-Gal المحسنة باستخدام ركائز إنزيم فلورية منفذة للخلايا ، بما في ذلك C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside ، أخضر) و DDAOG (9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد-7-يل) β-D-Galactopyranoside ، أحمر بعيد) ظهرت سابقا في الأدبيات12،13،14،15. يتم عرض هيكل المسبار الكيميائي والخصائص البصرية ل DDAOG في الشكل التكميلي S1. تسمح هذه المجسات الخلوية بتحليل الخلايا الحية (بدلا من الخلايا الثابتة) ، وتسهل المجسات الفلورية بدلا من المجسات الكروموجينية استخدام منصات تحليل الفلورسنت السريعة عالية الإنتاجية ، بما في ذلك أدوات الفحص عالية المحتوى ومقاييس التدفق الخلوي. تمكن مقاييس التدفق الخلوي للفرز من استعادة المجموعات المخصبة من الخلايا الهرمة الحية من مزارع الخلايا أو الأورام لتحليلها في اتجاه مجرى النهر (على سبيل المثال ، النشاف الغربي ، ELISA ، أو "omics"). يوفر تحليل التألق أيضا إشارة كمية ، مما يسمح بتحديد أكثر دقة للنسبة المئوية للخلايا الهرمة داخل عينة معينة. يمكن بسهولة إضافة مجسات فلورية إضافية ، بما في ذلك مجسات الجدوى والأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ، للتحليل المتعدد للأهداف خارج SA-β-Gal.
على غرار DDAOG ، C12-FDG هو مسبار فلوري ل SA-β-Gal ، لكن انبعاثه الفلوري الأخضر يتداخل مع AF الخلوي الجوهري ، والذي ينشأ أثناء الشيخوخة بسبب تراكم مجاميع الليبوفوسين في الخلايا16. من خلال استخدام مسبار DDAOG الأحمر البعيد ، يمكن استخدام التركيز البؤري التلقائي الخلوي الأخضر كمعلمة ثانوية لتأكيد الشيخوخة17. يعمل هذا على تحسين موثوقية الفحص باستخدام علامة ثانية بالإضافة إلى SA-β-Gal ، والتي غالبا ما تكون غير موثوقة كعلامة واحدة للشيخوخة18. نظرا لأن اكتشاف الرجفان الأذيني الداخلي في الخلايا الهرمة هو نهج خال من الملصقات ، فهو طريقة سريعة وبسيطة لتوسيع خصوصية الفحص المستند إلى DDAOG.
في هذا البروتوكول ، نوضح استخدام DDAOG و AF كاختبار سريع لقياس التدفق الخلوي ثنائي المعلمات لتحديد الخلايا السرطانية TIS القابلة للحياة من الثقافات المختبرية أو المعزولة عن الأورام المعالجة بالعقاقير الموجودة في الفئران (الشكل 1). يستخدم البروتوكول الفلوروفورات المتوافقة مع مجموعة واسعة من أجهزة تحليل وفرز التدفق الخلوي التجارية القياسية (الجدول 1). يتم تمكين تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة القابلة للحياة باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي القياسي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إجراء خطوة مناعية اختيارية لتقييم مستضدات سطح الخلية ذات الأهمية بالتزامن مع الشيخوخة. يمكن أيضا إثراء الخلايا الهرمة المحددة باستخدام منهجية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> الشكل 1: سير العمل التجريبي. رسم تخطيطي يلخص النقاط الرئيسية لفحص DDAOG. (أ) يضاف دواء يحفز TIS إلى خلايا الثدييات المستزرعة أو يعطى للفئران الحاملة للورم. ثم يسمح الوقت لبداية TIS: للخلايا ، 4 أيام بعد العلاج. للفئران ، إجمالي 22 يوما ، مع ثلاثة علاجات كل 5 أيام بالإضافة إلى 7 أيام للتعافي. يتم حصاد الخلايا أو فصل الأورام إلى تعليق. (ب) تعامل العينات ب Baf لضبط الأس الهيدروجيني للجسيمات الليزوزومية للكشف عن SA-β-Gal لمدة 30 دقيقة ؛ بعد ذلك ، يتم إضافة مسبار DDAOG لمدة 60 دقيقة للكشف عن SA-β-Gal. يتم غسل العينات 2x في PBS ، ويتم إضافة بقعة صلاحية لفترة وجيزة (15 دقيقة). اختياريا ، يمكن تلطيخ العينات بالأجسام المضادة الفلورية في قنوات مضان مفتوحة و / أو ثابتة لتحليلها لاحقا. (ج) تحلل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي القياسي. يتم تصور الخلايا القابلة للحياة في مخططات نقطية تظهر DDAOG الأحمر (يشير إلى SA-β-Gal) مقابل التألق الذاتي الأخضر (lipofuscin). يتم إنشاء بوابة لتحديد النسبة المئوية لخلايا TIS بناء على عينات التحكم غير المعالجة (غير معروضة). إذا تم استخدام مقياس الفرز الخلوي (FACS) ، فيمكن جمع خلايا TIS ووضعها مرة أخرى في المزرعة لمزيد من المقايسات في المختبر أو تحليلها ومعالجتها لمقايسات البيولوجيا الجزيئية. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ TIS = الشيخوخة الناجمة عن العلاج ؛ FL-Ab = الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور ؛ باف = بافيلوميسين A1 ؛ SA-β-Gal = بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>فلوروفور</td>
			<td>الكشف عن</td>
			<td>السابق/م (نانومتر)</td>
			<td>ليزر مقياس الخلايا (نانومتر)</td>
			<td>كاشف مقياس الخلايا / مرشح تمرير النطاق (نانومتر)</td>
		</tr><tr><td>داوج</td>
			<td>SA-β-Gal</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>أ ف</td>
			<td>ليبوفوسين</td>
			<td>< 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>CV450</td>
			<td>صلاحيه</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>بيه</td>
			<td>الجسم المضاد / علامة السطح</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: المواصفات البصرية للفلوروفورات ومقياس الخلايا. يتم سرد مواصفات مقياس الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول لجهاز يحتوي على ما مجموعه 4 ليزر و 15 كاشفا للانبعاثات. DDAOG المكتشف عند 645/660 نانومتر هو شكل المسبار المشقوق بواسطة SA-β-Gal1. يمكن أن يظهر DDAOG غير المشقوق مضانا منخفض المستوى عند 460/610 نانومتر ولكن يتم إزالته عن طريق خطوات الغسيل في البروتوكول. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ AF = التألق الذاتي ؛ PE = فيكوريثرين ؛ SA-β-Gal = بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>B40500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Violet 450 AM viability dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65-0854-39</td>
			<td>eBioscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPP4 antibody, PE conjugate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137803</td>
			<td>Clone H194-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: A549 human lung adenocarcinoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: B16-F10 mouse melanoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDAO-Galactoside</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11960-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC 0069-3032-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)</td>
			<td>Sun Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 47335-049-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>12092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega&#160;</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc receptor blocking reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell analyzer)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>LSRFortessa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell sorter)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>FACSAria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BW17737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (without calcium and magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration particles, ultra kit</td>
			<td>SpheroTech</td>
			<td>UCRP-38-2K</td>
			<td>3.5-3.9 &#181;m, 2E6/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride 0.9% (USP)</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>2B1324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data acquisition, &#34;FACSDiva&#34;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact BD for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data analysis, &#34;FlowJo&#34;</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact TreeStar for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry

الشيخوخة الخلوية هي حالة من التوقف التكاثري الناجم عن الضرر البيولوجي الذي يتراكم عادة على مدى سنوات في الخلايا المتقدمة في السن ولكنه قد يظهر أيضا بسرعة في الخلايا السرطانية كرد فعل على الضرر الناجم عن علاجات السرطان المختلفة. تعتبر شيخوخة الخلايا السرطانية بشكل عام غير مرغوب فيها ، حيث تصبح الخلايا الهرمة مقاومة للموت وتمنع مغفرة الورم مع تفاقم الورم الخبيث ومقاومة العلاج. لذلك ، فإن تحديد الخلايا السرطانية الهرمة له أهمية مستمرة لمجتمع أبحاث السرطان. توجد فحوصات شيخوخة مختلفة ، يعتمد الكثير منها على نشاط علامة الشيخوخة المعروفة ، بيتا غالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة (SA-β-Gal). 
عادة ، يتم إجراء اختبار SA-β-Gal باستخدام ركيزة كروموجينية (X-Gal) على الخلايا الثابتة ، مع التعداد البطيء والذاتي للخلايا الهرمة "الزرقاء" بواسطة الفحص المجهري الضوئي. وقد مكنت المقايسات المحسنة باستخدام ركائز SA-β-Gal الفلورية نفاذة للخلايا، بما في ذلك C12-FDG (الأخضر) و DDAO-Galactoside (DDAOG؛ الأحمر الأقصى)، من تحليل الخلايا الحية وسمحت باستخدام منصات تحليل الفلورسنت عالية الإنتاجية، بما في ذلك مقاييس التدفق الخلوي. C12-FDG هو مسبار موثق جيدا ل SA-β-Gal ، لكن انبعاثاته الفلورية الخضراء تتداخل مع التألق الذاتي الخلوي الجوهري (AF) الذي ينشأ أثناء الشيخوخة بسبب تراكم مجاميع الليبوفوسين. من خلال استخدام مسبار SA-β-Gal الأحمر البعيد DDAOG ، يمكن استخدام التألق الذاتي الخلوي الأخضر كمعلمة ثانوية لتأكيد الشيخوخة ، مما يضيف موثوقية إلى الفحص. يمكن استخدام قنوات التألق المتبقية لتلطيخ صلاحية الخلية أو وضع العلامات المناعية الفلورية الاختيارية.
باستخدام قياس التدفق الخلوي ، نوضح استخدام التألق الذاتي DDAOG و lipofuscin كاختبار ثنائي المعلمات لتحديد الخلايا السرطانية الهرمة. يتم إجراء تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة القابلة للحياة. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تضمين خطوة مناعية اختيارية لتقييم مستضدات سطح الخلية ذات الأهمية. يمكن أيضا فرز الخلايا الهرمة المحددة وفرزها خلويا وجمعها لتحليلها في اتجاه مجرى النهر. يمكن تحليل الخلايا الهرمة المجمعة على الفور (على سبيل المثال ، للمقايسات المناعية أو "تحليل أوميكس") أو مزيد من الاستزراع.

تم إجراء العديد من التجارب لإثبات قابلية مقارنة DDAOG ب X-Gal و C12-FDG للكشف عن الشيخوخة بواسطة SA-β-Gal. أولا ، تم استخدام X-Gal لتلطيخ خلايا سرطان الجلد B16-F10 الهرمة التي يسببها ETO (الشكل 2 أ). تطور لون أزرق مكثف في مجموعة فرعية من الخلايا المعالجة ب ETO ، بينما أظهرت الخلايا الأخرى تل...

Watch this Scientific Journal Video about Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃŽÂ²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

يتم تقديم بروتوكول للقياس الكمي الفلوري والتدفق الخلوي للخلايا السرطانية الهرمة التي تسببها أدوية العلاج الكيميائي في زراعة الخلايا أو في نماذج أورام الفئران. تشمل الإجراءات الاختيارية التلطيخ المناعي المشترك ، وتثبيت العينات لتسهيل تحليل الدفعة الكبيرة أو النقطة الزمنية ، وإثراء الخلايا الهرمة القابلة للحياة عن طريق الفرز الخلوي للتدفق.

مسبار β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة الفلورية الحمراء البعيدة لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الهرمة عن طريق قياس التدفق الخلوي

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

يتيح بروتوكول قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات الخاص بنا الكشف السريع والمحسن عن الشيخوخة التي يسببها العلاج في الخلايا السرطانية ، وهو شرط للدراسة المستمرة في بيولوجيا السرطان وعلاجه. يعد اختبار شيخوخة قياس التدفق الخلوي لدينا أسرع من المقايسات الحالية القائمة على الفحص المجهري. نستخدم علامتين ، بدلا من علامة واحدة فقط ، لتحديد الخلايا الهرمة ، وتحسين موثوقية الفحص.يمكن تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة الفلورية للكشف عن أهداف إضافية ذات أهمية. يمكن استخدام فرز التدفق الخلوي لإثراء مجموعات الخلايا الهرمة لتحليل المصب. يمكن للفحص اكتشاف الخلايا الهرمة في خطوط الخلايا السرطانية المستزرعة ، أو في عينات الورم الكاملة بعد التفكك اللطيف.قبل محاولة هذه التقنية ، من المهم أن تكون على دراية بإجراءات التشغيل العامة لمقياس التدفق الخلوي المستخدم. يرجى الرجوع إلى النص للحصول على مواصفات مقياس التدفق الخلوي الموصى بها. قبل يوم واحد من تحريض الشيخوخة عن طريق الأدوية ، احصد ثقافة خط الخلايا السرطانية باستخدام 0.25٪ تربسين EDTA.ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتنشيط التربسين ، وافصل الطبقة الأحادية للخلية. عندما تنفصل الطبقة الأحادية بشكل واضح ، قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الاستزراع الكامل. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي معقم.عد الخلايا باستخدام طريقة مقياس الدم القياسية ، وسجل الخلايا لكل ملليلتر. خلايا الصفيحة في واحد في 10 أس ثالث إلى 10 في 10 أس الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع في صفيحة استزراع بلاستيكية قياسية من ستة آبار. احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة.في اليوم التالي ، عالج الخلايا بالعامل المثير للشيخوخة ، مثل إيتوبوسيد. ثم احتضان لمدة أربعة أيام للسماح ببداية الشيخوخة. افحص الخلايا يوميا تحت المجهر الضوئي لمعرفة التغيرات المورفولوجية المتوقعة.بعد بداية الشيخوخة ، احصد الخلايا بإضافة التربسين EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما يتم فصل الخلايا إلى تعليق ، تحييد التربسين بحجم متساو من الوسط الكامل. انقل كل بئر من معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ملليلتر.عد الخلايا مرة أخرى واحصل على عدد متساو من الخلايا لكل عينة في مجموعة جديدة من الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة خمس دقائق عند 1،000 غرام عند أربع درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. أولا ، اضبط الرقم الهيدروجيني الليزوزومي لعينات الخلايا المستزرعة عن طريق إضافة محلول من بافيلوميسين ميكرومولار واحد في DMEM إلى حبيبات الخلية بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر ، وماصة للخلط.احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على الدوار بسرعة بطيئة. ثم لصبغ بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ، أضف محلول مخزون DDAOG بمعدل 10 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى العينات دون غسل. ضعه على دوار لمدة 60 دقيقة محميا من الضوء المباشر.كما كان من قبل ، قم بطرد الأنابيب بالطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية ، وغسل الحبيبات بملليلتر واحد من الثلج البارد 0.5٪ BSA في PBS. ثم أضف 300 ميكرولتر من محلول Calcein Violet 450 AM المخفف إلى كريات الخلايا المغسولة. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.نقل عينات الخلية إلى أنابيب متوافقة مع أداة قياس الخلايا. في برنامج الحصول على البيانات ، افتح مدرج تكراري للقناة البنفسجية وقناة حمراء بعيدة مقابل مخطط نقطة القناة الخضراء. ابدأ في الحصول على بيانات مقياس الخلايا بسرعة سحب منخفضة وضع عينات التحكم الإيجابية الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب.البدء في الحصول على عينة من البيانات. اضبط جهد القناة بحيث يتم احتواء أكثر من 90٪ من الأحداث داخل كل مخطط. عندما تكون جميع الإعدادات مثالية ، سجل 10،000 حدث لكل عينة.ضع عينات التحكم في السيارة فقط الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بدء الحصول على البيانات وتسجيل 10،000 حدث لكل عينة. ابحث عن زيادة في التألق الذاتي ، أو AF ، وإشارة DDAO-galactoside مقابل التحكم الإيجابي.احفظ عينة البيانات بتنسيق ملف fcs ، وقم بتصدير الملفات إلى كمبيوتر محطة عمل مزود ببرنامج تحليل قياس التدفق الخلوي. باستخدام برنامج تحليل بيانات قياس الخلايا ، قم بتحميل ملفات بيانات FCS لجميع العينات التي تم الحصول عليها. أولا ، لبوابة الخلايا القابلة للحياة ، انقر نقرا مزدوجا فوق بيانات العينة للتحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها.تصور البيانات كمدرج تكراري للقناة البنفسجية. تعتمد الخلايا القابلة للحياة الملطخة ، الملطخة ب CV 450 ، على مضانها الأكثر إشراقا من الخلايا الميتة. ارسم بوابة باستخدام أداة الرسم البياني أحادي البوابة لتضمين الخلايا القابلة للحياة فقط.اسم البوابة قابلة للحياة. ثم اسحب البوابة القابلة للتطبيق إلى عينات الخلايا الأخرى من نافذة تخطيط العينة لتطبيق البوابة بشكل موحد. افتح نافذة التخطيط.في نافذة التخطيط، تصور كل العينات كرسوم بيانية للقناة البنفسجية. تحقق من أن بوابات الخلايا القابلة للحياة مناسبة عبر العينات. إذا لم يكن كذلك ، اضبط حسب الحاجة.بعد ذلك ، لبوابة الخلايا الهرمة ، انقر نقرا مزدوجا فوق بيانات الخلية القابلة للتطبيق المسورة للتحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها. ثم تصور البيانات كمخطط نقطي للقناة الحمراء البعيدة مقابل القناة الخضراء. ارسم بوابة باستخدام أداة بوابة المستطيل لتضمين أقل من 5٪ من الخلايا الإيجابية DDAO وإيجابية التركيز البؤري التلقائي من الربع الأيمن العلوي.قم بتسمية البوابة باسم شيخوخة. ثم اسحب بوابة الشيخوخة إلى المجموعة الفرعية القابلة للتطبيق لجميع العينات من نافذة تخطيط العينة لتطبيق البوابة بشكل موحد. في نافذة التخطيط، اسحب جميع المجموعات الفرعية القابلة للتطبيق ذات بوابات الخلايا وأفلتها.تصور جميع العينات القابلة للتطبيق كمخططات نقطية حمراء بعيدة مقابل قناة خضراء ، ولاحظ النتائج. تأكد من أن بوابة الشيخوخة مرئية على جميع قطع الأراضي وأن بوابة عناصر التحكم في السيارة فقط تعرض أقل من 5٪ من الخلايا الهرمة. اكتمل التحليل الآن.يمكن الآن تصدير البيانات حسب الرغبة في شكل رسوم بيانية وجدول. بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة ، أظهرت خلايا سرطان الجلد B16-F10 الهرمة التي يسببها إيتوبوسيد مورفولوجيا متضخمة وتلطيخا أزرق بسبب انشقاق X-gal بواسطة ارتفاع بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة. أظهر تلطيخ الخلايا المعالجة بالإيتوبوسيد باستخدام C12FDG الفلوري ، أو DDAOG أنماط تلطيخ مماثلة واختلافات في الشدة مع X-gal.ومع ذلك ، تبين أن التألق الذاتي الخلوي المتداخل مع انبعاث C12FDG الأخضر يتراكم في الخلايا الهرمة غير الملوثة. في المقابل ، كان التألق الذاتي عادة ضئيلا في نطاق الانبعاثات الأحمر البعيد ل DDAOG. يتم هنا عرض إعداد الحصول على بيانات مقياس التدفق الخلوي لمخططات التشتت ، والكرات المجهرية لمعايرة الفلورسنت التجارية ذات قوس قزح ذات الخمس قمم ، وبيانات التألق أحادية القناة من الخلايا الملطخة.أظهرت بيانات مقايسة شيخوخة مقياس التدفق الخلوي DDAOG لخلايا سرطان الجلد B16-F10 أن الشيخوخة المستحثة بالعلاج ، أو TIS ، التي يسببها إيتوبوسيد حدثت في 35٪ من الخلايا القابلة للحياة ، وأن العامل السينوليتيك ABT-263 قضى تقريبا على خلايا TIS. في خلايا سرطان الرئة A549 ، خفضت TIS التي يسببها بليوميسين في 66٪ من الخلايا القابلة للحياة و ABT-263 النسبة المئوية إلى 15. لم يكن ABT-263 وحده ساما للخلايا المتكاثرة غير المعالجة.في اختبار تلطيخ مشترك للأجسام المضادة ، أظهر الرسم البياني لبيانات قناة PE أن 42٪ من الخلايا المعالجة بالإيتوبوسيد كانت إيجابية لعلامة الشيخوخة DPPP4 إيجابية. علاوة على ذلك ، أشار التصور باستخدام مخططات نقطية ثنائية الأبعاد إلى أن 44٪ من الخلايا المعالجة بالإيتوبوسيد كانت إيجابية مزدوجة ل DDAOG و DPP4 مقابل 4٪ من الخلايا التي تحتوي على مركبة فقط. تم تقييم تثبيت الخلايا الملطخة DDAOG بعد ذلك.بالمقارنة مع عينات التحكم غير الثابتة ، أظهرت العينات الثابتة خلفية أعلى قليلا في الخلايا غير المعالجة مع نسبة أعلى من الخلايا التي سجلت الشيخوخة في الخلايا المعالجة ب BLM. وقد لوحظ هذا التأثير أيضا في العينات الثابتة المخزنة طوال الليل ، ولمدة أسبوع واحد عند أربع درجات مئوية. يتم عرض فرز قياس التدفق الخلوي والتحقق من صحة مجموعات الخلايا الهرمة المخصبة عن طريق التشكل وعلامات الانتشار.أظهرت الخلايا الهرمة التي تم فرزها مورفولوجيا متضخمة ، كما هو متوقع ، تم تصورها عن طريق تلطيخ الأكتين بالقضيب الفلوري. كما لوحظ انخفاض في إشارة علامة الانتشار Ki67 عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي. أخيرا ، تم تقييم القياس الكمي للشيخوخة في الأورام المعالجة بأدوية العلاج الكيميائي.كان تلطيخ X-gal في الأنسجة ضعيفا نسبيا ، لكن التلوين الأزرق كان واضحا في الأورام التي عولجت بدوكسوروبيسين ، أو دوكسوروبيسين الشحمي pegylated ، خاصة في الأورام التي سجلت أيضا نتائج إيجابية للشيخوخة بواسطة مقايسة تدفق DDAO-galactoside. كما هو متوقع ، أظهرت الأورام المالحة فقط شيخوخة ضئيلة. هنا ، كما هو الحال مع أي فحص للخلايا الحية ، يجب تنفيذ خطوات البروتوكول بكفاءة ، ولكن بلطف.يجب تجنب إجراءات التلوين المطولة ، أو الحضانة بعد الأوقات المذكورة. إذا تم فرز الخلايا الهرمة خلويا ، فيمكن وضعها مرة أخرى في مزرعة للمقايسات المناعية ، أو تحليلها ، ومعالجتها لتحليل omics ، بما في ذلك النسخ ، أو البروتينات. مكنت هذه التقنية مختبرنا وغيره من تحديد السمات الجديدة للخلايا السرطانية الهرمة ، بما في ذلك القياس الكمي لتلف الحمض النووي ، والتعبير عن البروتين ، والتغيرات في التمثيل الغذائي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

قياس دورة الخلية محددة من γH2AX والمبرمج بعد الإجهاد السامة الجينية عن طريق قياس التدفق الخلوي

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

بروتوكول التشريح الآلي لإثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...