Name: far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃŽÂ²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi takker cytometri og antistofkernefacilitet ved University of Chicago for støtte til flowcytometriinstrumentering. Animal Research Center ved University of Chicago leverede dyreboliger.

Alt beskrevet dyrearbejde blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Chicago.
1. Fremstilling og opbevaring af stamopløsninger
BEMÆRK: Hvis celler skal flowsorteres, skal alle opløsninger fremstilles ved hjælp af sterile teknikker og filtreres gennem en 0,22 μm filteranordning.
<ol><li>Der fremstilles en stamopløsning af DDAO-galactosid ved 5 mg/ml i DMSO. Aliquot ved 50 μL pr. rør (eller ønsket volumen...

<ol>
	<li>Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+escape+from+therapy-induced+senescence+as+a+model+of+disease+recurrence+after+dormancy.">Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy.</a> Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).</li><li>Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+in+cancer+therapy:+friends+or+foes.">Senescent cells in cancer therapy: friends or foes.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).</li><li>Prasanna, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+senescence:+Opportunities+to+improve+anticancer+therapy.">Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).</li><li>Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+and+their+secretory+phenotype+as+targets+for+cancer+therapy.">Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy.</a> Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).</li><li>Ou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer:+from+mechanisms+to+detection.">Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection.</a> Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cellular+senescence.">Hallmarks of cellular senescence.</a> Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).</li><li>Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+senescence+phenotype+of+cancer+cells+treated+with+chemotherapeutic+agents.">Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents.</a> Cells. 8 (12), 1501 (2019).</li><li>Miku&#322;a-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Ksi&#261;&#380;ek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+significance+of+therapy-induced+and+spontaneous+senescence+of+cancer+cells.">Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+senescence-associated+&#946;+galactosidase.">Colorimetric detection of senescence-associated &#946; galactosidase.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Tung, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+&#946;-galactosidase+activity+using+far+red+fluorescent+switch.">In vivo imaging of &#946;-galactosidase activity using far red fluorescent switch.</a> Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Galactosidase+activity+assay+using+far-red-shifted+fluorescent+substrate+DDAOG.">beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG.</a> Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin:+Mechanisms+of+formation+and+increase+with+age.">Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age.</a> APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).</li><li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues.">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li><li>Wang, B., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+define+and+target+cellular+senescence+in+cancer.">The quest to define and target cellular senescence in cancer.</a> Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).</li><li>Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+radiotherapy+targets+macromolecules+through+altering+the+tumor+microenvironment.">Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).</li><li>Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+multicolor+flow+cytometry.">Basic multicolor flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).</li><li>Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cell+depletion+through+targeting+BCL-family+proteins+and+mitochondria.">Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria.</a> Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).</li><li>Kim, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+senescent+cell+surface+targetable+protein+DPP4.">Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4.</a> Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).</li><li>Flor, A. C., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-derived+reactive+aldehydes+link+oxidative+stress+to+cell+senescence.">Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence.</a> Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).</li><li>Jochems, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+SENESCopedia:+A+delineation+of+cancer+cell+senescence.">The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence.</a> Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).</li><li>Fallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+and+liposomal+doxorubicin+induce+senescence+by+enhancing+nuclear+factor+kappa+B+and+mitochondrial+membrane+potential.">Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential.</a> Life Sciences. 232, 116677 (2019).</li><li>Kasper, M., Barth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin+and+its+role+in+inducing+apoptosis+and+senescence+in+lung+cells+-+modulating+effects+of+caveolin-1.">Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1.</a> Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).</li><li>Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+EMT+crosstalk+in+bleomycin-induced+pathogenesis+of+pulmonary+fibrosis-an+in+vitro+analysis.">Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis.</a> Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).</li><li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism,+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence.">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).</li><li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16(INK4a)-luciferase+model.">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li><li>Liu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+exhibiting+strong+p16+(INK4a)+promoter+activation+in+vivo+display+features+of+senescence.">Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).</li><li>Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+senescence+for+the+treatment+of+cancer.">Exploiting senescence for the treatment of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).</li><li>Baek, K. -. H., Ryeom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+oncogene-induced+senescence+in+vivo.">Detection of oncogene-induced senescence in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).</li><li>Gonz&#225;lez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Mu&#241;oz-Esp&#237;n, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

I løbet af det sidste årti eller deromkring er flowcytometri blevet en mere almindelig analyseplatform inden for kræftforskning på grund af den nye popularitet af tumorimmunologi, udviklingen af billigere flowcytometre og forbedringen af delte instrumenteringsfaciliteter på akademiske institutioner. Flerfarvede assays er nu standard, da de fleste nyere instrumenter er udstyret med violette, blågrønne og røde til langt røde optiske arrays. Således vil denne DDAOG-protokol sandsynligvis være kompatibel med en la...

Senescente celler akkumuleres normalt i organismer over år under normal biologisk aldring, men kan også udvikle sig hurtigt i tumorceller som et svar på skader induceret af forskellige kræftbehandlinger, herunder stråling og kemoterapi. Selvom de ikke længere formerer sig, kan terapiinducerede senescent (TIS) tumorceller bidrage til behandlingsresistens og drive gentagelse 1,2,3. Faktorer udskilt af TIS-celler kan forværre tumormalignitet ved at fremme immununddragelse eller metastase 4,5. TIS-celler udvikler komplekse, kontekstspecifikke fænotyper, ændrede metaboliske profiler og unikke immunresponser 6,7,8. Derfor er identifikation og karakterisering af TIS tumorceller induceret af forskellige kræftbehandlingsmetoder et emne af løbende interesse for kræftforskningssamfundet.
Til påvisning af TIS-tumorceller anvendes konventionelle ældningsassays i vid udstrækning, primært baseret på påvisning af øget aktivitet af ældningsmarkørenzymet, den lysosomale beta-galactosidase GLB19. Detektion ved en næsten neutral (snarere end sur) lysosomal pH muliggør specifik påvisning af ældningsassocieret beta-galactosidase (SA-β-Gal)10. Et standard SA-β-Gal-assay, der er blevet brugt i flere årtier, bruger X-Gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), et blåt kromogent beta-galactosidasesubstrat, til at detektere SA-β-Gal i faste celler ved lysmikroskopi11. X-Gal-analysen muliggør kvalitativ visuel bekræftelse af TIS ved hjælp af almindeligt tilgængelige reagenser og laboratorieudstyr. Et grundlæggende transmitteret lysmikroskop er den eneste instrumentering, der kræves for at evaluere tilstedeværelsen af det blå kromogen. X-Gal-farvningsproceduren kan dog mangle følsomhed, hvilket nogle gange kræver mere end 24 timer, før farven udvikler sig. Farvning efterfølges af subjektiv scoring med lav gennemstrømning af individuelle senescente celler baseret på tælling af cellerne, der udviser en vis intensitet af det blå kromogen under et lysmikroskop. Da X-Gal er celle-uigennemtrængelig, kræver dette assay opløsningsmiddelfikserede celler, som ikke kan genvindes til downstream-analyse. Når du arbejder med begrænsede prøver fra dyr eller patienter, kan dette være en stor ulempe.
Forbedrede SA-β-Gal-assays ved anvendelse af cellepermeant, fluorescerende enzymsubstrater, herunder C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranosid, grøn) og DDAOG (9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-en-7-yl) β-D-Galactopyranosid, far-red) har tidligere optrådt i litteraturen12,13,14,15. DDAOG's kemiske sondestruktur og optiske egenskaber er vist i supplerende figur S1. Disse cellepermeanerede sonder tillader analyse af levende (snarere end faste) celler, og fluorescerende snarere end kromogene sonder letter brugen af hurtige fluorescerende analyseplatforme med høj kapacitet, herunder screeningsinstrumenter med højt indhold og flowcytometre. Sortering af flowcytometre muliggør genopretning af berigede populationer af levende senescente celler fra cellekulturer eller tumorer til downstream-analyse (f.eks. Western blotting, ELISA eller 'omics). Fluorescensanalyse giver også et kvantitativt signal, der giver mulighed for mere nøjagtig bestemmelse af procentdelen af senescente celler i en given prøve. Yderligere fluorescerende sonder, herunder levedygtighedssonder og fluorophoremærkede antistoffer, kan let tilføjes til multipleksanalyse af mål ud over SA-β-Gal.
I lighed med DDAOG er C12-FDG en fluorescerende sonde til SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende emission overlapper med iboende cellulær AF, som opstår under ældning på grund af akkumulering af lipofuscinaggregater i celler16. Ved at bruge den langt røde DDAOG-sonde kan grøn cellulær AF bruges som en sekundær parameter til at bekræfte ældning17. Dette forbedrer analysepålideligheden ved at bruge en anden markør ud over SA-β-Gal, som ofte kan være upålidelig som en enkelt markør for ældning18. Da påvisning af endogen AF i senescente celler er en etiketfri tilgang, er det en hurtig og enkel måde at udvide specificiteten af vores DDAOG-baserede assay.
I denne protokol demonstrerer vi brugen af DDAOG og AF som et hurtigt flowcytometriassay med to parametre til identifikation af levedygtige TIS-tumorceller fra in vitro-kulturer eller isoleret fra lægemiddelbehandlede tumorer etableret hos mus (figur 1). Protokollen bruger fluorophorer, der er kompatible med en bred vifte af standard kommercielle flowcytometrianalysatorer og sorterere (tabel 1). Kvantificering af procentdelen af levedygtige senescentceller ved hjælp af standard flowcytometrianalyse er aktiveret. Hvis det ønskes, kan der udføres et valgfrit immunmærkningstrin for at evaluere celleoverfladeantigener af interesse samtidig med ældning. Identificerede senescente celler kan også beriges ved hjælp af standard fluorescensaktiveret cellesorteringsmetode (FACS).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang. En skematisk opsummering af nøglepunkter i DDAOG-analysen. (A) Et TIS-inducerende lægemiddel tilsættes til pattedyrsdyrkede celler eller administreres til tumorbærende mus. Der er derefter tid til at begynde med TIS: for celler, 4 dage efter behandling; for mus, 22 dage i alt, med tre behandlinger hver 5. dag plus 7 dages restitution. Celler høstes, eller tumorer dissocieres i suspension. (B) Prøver behandles med Baf for at justere lysosomal pH til påvisning af SA-β-Gal i 30 min. derefter tilsættes DDAOG-sonde i 60 minutter for at detektere SA-β-Gal. Prøver vaskes 2x i PBS, og der tilsættes kort en levedygtighedsplet (15 min). Eventuelt kan prøver farves med fluorescerende antistoffer i åbne fluorescenskanaler og / eller fastgøres til senere analyse. (C) Prøver analyseres ved hjælp af et standard flowcytometer. Levedygtige celler visualiseres i prikplotter, der viser rød DDAOG (indikerer SA-β-Gal) versus grøn autofluorescens (lipofuscin). En port til bestemmelse af procentdelen af TIS-celler etableres baseret på ubehandlede kontrolprøver (ikke vist). Hvis der anvendes et sorteringscytometer (FACS), kan TIS-celler opsamles og placeres tilbage i kultur til yderligere in vitro-assays eller lyseres og behandles til molekylærbiologiske assays. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = terapiinduceret ældning; FL-Ab = fluorophorekonjugeret antistof; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = ældningsassocieret beta-galactosidase; PBS = fosfatbufferet saltvand; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fluorophore</td>
			<td>Registrerer</td>
			<td>Eks/Em (nm)</td>
			<td>Cytometer laser (nm)</td>
			<td>Cytometerdetektor / båndpasfilter (nm)</td>
		</tr><tr><td>DDAOG</td>
			<td>SA-β-Gal</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>AF</td>
			<td>Lipofuscin</td>
			<td>< 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>CV450</td>
			<td>Levedygtighed</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>PE</td>
			<td>Antistof/overflademarkør</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Fluoroforer og cytometer optiske specifikationer. Cytometerspecifikationer, der anvendes i denne protokol, er angivet for et instrument med i alt 4 lasere og 15 emissionsdetektorer. DDAOG detekteret ved 645/660 nm er formen af sonden spaltet af SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG kan udvise fluorescens på lavt niveau ved 460/610 nm, men fjernes ved vasketrin i protokollen. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescens; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = ældningsassocieret beta-galactosidase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>B40500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Violet 450 AM viability dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65-0854-39</td>
			<td>eBioscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPP4 antibody, PE conjugate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137803</td>
			<td>Clone H194-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: A549 human lung adenocarcinoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: B16-F10 mouse melanoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDAO-Galactoside</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11960-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC 0069-3032-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)</td>
			<td>Sun Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 47335-049-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>12092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega&#160;</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc receptor blocking reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell analyzer)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>LSRFortessa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell sorter)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>FACSAria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BW17737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (without calcium and magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration particles, ultra kit</td>
			<td>SpheroTech</td>
			<td>UCRP-38-2K</td>
			<td>3.5-3.9 &#181;m, 2E6/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride 0.9% (USP)</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>2B1324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data acquisition, &#34;FACSDiva&#34;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact BD for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data analysis, &#34;FlowJo&#34;</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact TreeStar for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry

Cellulær ældning er en tilstand af proliferativ anholdelse induceret af biologisk skade, der normalt opstår over år i aldrende celler, men kan også opstå hurtigt i tumorceller som et svar på skader induceret af forskellige kræftbehandlinger. Tumorcelleældning betragtes generelt som uønsket, da senescente celler bliver resistente over for døden og blokerer tumorremission, mens de forværrer tumormalignitet og behandlingsresistens. Derfor er identifikationen af senescent tumorceller af løbende interesse for kræftforskningsmiljøet. Der findes forskellige ældningsassays, mange baseret på aktiviteten af den velkendte ældningsmarkør, ældningsassocieret beta-galactosidase (SA-β-Gal). 
Typisk udføres SA-β-Gal-analysen ved hjælp af et kromogent substrat (X-Gal) på faste celler med langsom og subjektiv optælling af "blå" senescente celler ved lysmikroskopi. Forbedrede assays ved hjælp af cellepermeant, fluorescerende SA-β-Gal-substrater, herunder C12-FDG (grøn) og DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), har muliggjort analyse af levende celler og tilladt brugen af fluorescerende analyseplatforme med høj kapacitet, herunder flowcytometre. C12-FDG er en veldokumenteret sonde til SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende emission overlapper med iboende cellulær autofluorescens (AF), der opstår under ældning på grund af akkumulering af lipofuscinaggregater. Ved at bruge den langt røde SA-β-Gal-sonde DDAOG kan grøn cellulær autofluorescens bruges som en sekundær parameter til at bekræfte ældning, hvilket tilføjer pålidelighed til analysen. De resterende fluorescenskanaler kan bruges til cellelevedygtighedsfarvning eller valgfri fluorescerende immunmærkning.
Ved hjælp af flowcytometri demonstrerer vi brugen af DDAOG og lipofuscin autofluorescens som et dobbeltparameterassay til identifikation af senescent tumorceller. Kvantificering af procentdelen af levedygtige senescente celler udføres. Hvis det ønskes, kan et valgfrit immunmærkningstrin inkluderes for at evaluere celleoverfladeantigener af interesse. Identificerede senescente celler kan også flowcytometrisk sorteres og indsamles til downstream-analyse. Indsamlede senescente celler kan straks lyseres (f.eks. til immunassays eller 'omics-analyse) eller yderligere dyrkes.

Flere eksperimenter blev udført for at demonstrere sammenligneligheden af DDAOG med X-Gal og C12-FDG til påvisning af ældning af SA-β-Gal. For det første blev X-Gal brugt til at plette senescent B16-F10 melanomceller induceret af ETO (figur 2A). En intens blå farve udviklede sig i en delmængde af ETO-behandlede celler, mens andre celler udviste mindre intens blå farvning. Morfologi blev forstørret i de fleste ETO-behandlede celler. Farvning af ETO-behandlede celler med fl...

Watch this Scientific Journal Video about Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃŽÂ²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

En protokol for fluorescerende, flowcytometrisk kvantificering af senescente kræftceller induceret af kemoterapilægemidler i cellekultur eller i murine tumormodeller præsenteres. Valgfrie procedurer omfatter co-immunostaining, prøvefiksering for at lette analyse af store batch- eller tidspunkter og berigelse af levedygtige senescente celler ved flowcytometrisk sortering.

Far-rød fluorescerende senescens-associeret β-galactosidase sonde til identifikation og berigelse af senescent tumorceller ved flow cytometri

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Vores multi-parameter flowcytometriprotokol muliggør hurtig og forbedret påvisning af terapiinduceret ældning i tumorceller, hvilket er en betingelse for løbende undersøgelse inden for kræftbiologi og terapi. Vores flowcytometri ældningsassay er hurtigere end eksisterende mikroskopibaserede assays. Vi bruger to markører i stedet for kun en til at identificere senescente celler, hvilket forbedrer analysepålideligheden.Celler kan farves sammen med fluorescerende antistoffer for at detektere yderligere mål af interesse. Flowcytometrisortering kan bruges til at berige populationer af senescente celler til downstream-analyse. Analysen kan detektere senescente celler i dyrkede kræftcellelinjer eller i hele tumorprøver efter blid dissociation.Før du forsøger denne teknik, er det vigtigt at være bekendt med de generelle driftsprocedurer for det flowcytometer, der anvendes. Se teksten for anbefalede flowcytometerspecifikationer. En dag før ældning af induktion af lægemidler, høst kræftcellelinjekulturen med 0,25% trypsin EDTA.Placer cellerne ved 37 grader Celsius i fem minutter for at aktivere trypsin, og løsn cellemonolaget. Når monolaget er synligt løsrevet, neutraliseres trypsin ved at tilføje et lige stort volumen komplet kulturmedium. Overfør cellesuspensionen til et sterilt konisk rør.Tæl cellerne ved hjælp af standard hæmocytometermetoden, og registrer celler pr. Milliliter. Pladeceller på en gang 10 til den tredje til 10 gange 10 til den tredje celler pr. Kvadratcentimeter i en standard seks-brønds plastkulturplade. Inkuber pladen natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og fugtighed.Den næste dag behandles cellerne med det ældningsfremkaldende middel af interesse, såsom etoposid. Derefter inkuberes i fire dage for at tillade begyndelsen af ældning. Undersøg cellerne dagligt under et lysmikroskop for forventede morfologiændringer.Efter begyndelsen af ældning høstes cellerne ved at tilføje trypsin EDTA i fem minutter ved 37 grader Celsius. Når cellerne dissocieres i suspension, neutraliseres trypsin med et lige stort volumen komplet medium. Overfør hvert hul med cellesuspension til et 1,7 milliliter mikrocentrifugerør.Tæl cellerne igen, og aliquot et lige antal celler pr. prøve i et nyt sæt rør. Centrifuge rørene i fem minutter ved 1.000 g ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Først justeres den lysosomale pH i dyrkede celleprøver ved at tilsætte en opløsning af en mikromolær bafilomycin A i DMEM til cellepelleten i en koncentration på en gange 10 til de sjette celler pr. milliliter og pipette til blanding.Inkuberes i 30 minutter ved 37 grader Celsius på en rotator ved en langsom hastighed. For at plette for ældningsassocieret beta-galactosidase tilsættes DDAOG-stamopløsning ved 10 mikrogram pr. milliliter til prøverne uden vask. Anbring på en rotator i 60 minutter beskyttet mod direkte lys.Centrifuger som før rørene, fjerner supernatanten og vasker pelleten med en milliliter iskold 0,5% BSA i PBS. Tilsæt derefter 300 mikroliter fortyndet Calcein Violet 450 AM-opløsning til de vaskede cellepiller. Inkuber i 15 minutter på is i mørket.Overfør celleprøverne til flowcytometriinstrumentkompatible rør. I dataindsamlingssoftwaren skal du åbne et violet kanalhistogram og et langt rødt kanal versus grønt kanalpunktplot. Start cytometerdataindsamling ved en lav indtagshastighed, og placer de positive kontrolprøver, der er farvet med DDAOG, på indsugningsporten.Begynd at erhverve prøvedata. Juster kanalspændingerne, så mere end 90% af begivenhederne er indeholdt i hvert plot. Når alle indstillinger er optimale, skal du registrere 10.000 hændelser pr. eksempel.Placer kontrolprøverne kun for køretøjer, der er farvet med DDAOG, på indsugningsporten. Start dataindsamling og registrer 10.000 hændelser pr. Prøve. Se efter en stigning i autofluorescens eller AF og DDAO-galactosidsignal versus positiv kontrol.Gem eksempeldataene i fcs-filformat, og eksporter filerne til en arbejdsstationscomputer, der er udstyret med flowcytometrianalysesoftware. Brug software til cytometridataanalyse til at indlæse fcs-datafilerne for alle erhvervede prøver. For at gate levedygtige celler skal du først dobbeltklikke på prøvedataene for kontrolelementet kun for at åbne dets datavindue.Visualiser dataene som et violet kanalhistogram. De levedygtige celler, der er farvet, farvet af CV 450, er baseret på deres lysere fluorescens end de døde celler. Tegn en port ved hjælp af værktøjet Single Gate Histogram for kun at inkludere levedygtige celler.Navngiv porten levedygtig. Træk derefter levedygtig port til de andre celleprøver fra eksempellayoutvinduet for at anvende porten ensartet. Åbn vinduet Layout.I vinduet Layout skal du visualisere alle eksempler som violette kanalhistogrammer. Kontrollér, at levedygtig cellegating er passende på tværs af prøver. Hvis ikke, skal du justere efter behov.For at gate senescente celler skal du derefter dobbeltklikke på de gated levedygtige celledata for den eneste køretøjskontrol for at åbne sit datavindue. Visualiser derefter dataene som et prikplot for den langt røde kanal versus den grønne kanal. Tegn en port ved hjælp af rektangel gating-værktøjet til at inkludere mindre end 5% af DDAO-positive og AF-positive celler fra øverste højre kvadrant.Navngiv porten som Senescent. Træk derefter Senescent-porten til den levedygtige delmængde af alle prøver fra eksempellayoutvinduet for at anvende porten ensartet. I vinduet Layout skal du trække og slippe alle levedygtige cellestyrede delmængder.Visualiser alle levedygtige prøver som langt røde versus grønne kanalpunktplot, og observer resultaterne. Sørg for, at den senescente port er synlig på alle plots, og at porten til betjeningsanordningerne kun for køretøjet udviser mindre end 5 % senescente celler. Analysen er nu afsluttet.Data kan nu eksporteres efter ønske i grafisk format og tabelformat. Sammenlignet med ubehandlede celler udviste senescent B16-F10 melanomceller induceret af etoposid forstørret morfologi og blå farvning på grund af spaltning af X-gal ved forhøjet ældningsassocieret beta-galactosidase. Farvning af etoposidbehandlede celler med fluorescerende C12FDG eller DDAOG viste sammenlignelige farvningsmønstre og intensitetsvariationer til X-gal.Imidlertid viste cellulær autofluorescens overlapning med grøn C12FDG-emission at akkumulere i ufarvede senescente celler. I modsætning hertil var autofluorescens typisk ubetydelig i DDAOG's langt røde emissionsområde. Opsætning af flowcytometerdata for scatterplots, fem-peak kommercielle regnbuefluorescerende kalibreringsmikrosfærer og enkeltkanals fluorescensdata fra farvede celler vises her.DDAOG-flowcytometer-aldringsassaydata for B16-F10-melanomceller viste, at terapiinduceret ældning eller TIS induceret af etoposid forekom i 35% af levedygtige celler, og det senolytiske middel ABT-263 eliminerede næsten TIS-celler. I A549 lungekræftceller reducerede bleomycin-induceret TIS i 66% af levedygtige celler og ABT-263 procentdelen til 15. ABT-263 alene var ikke giftigt for ubehandlede prolifererende celler.I et antistof-co-farvningsassay viste et histogram af PE-kanaldata, at 42% af etoposidbehandlede celler var positive for ældningsmarkøren DPPP4-positive. Endvidere viste visualisering med todimensionelle prikplot, at 44% af etoposidbehandlede celler var dobbelt positive for DDAOG og DPP4 versus 4% af cellerne kun med køretøjer. Fiksering af DDAOG-farvede celler blev derefter evalueret.Sammenlignet med ikke-fikserede kontrolprøver udviste faste prøver en lidt højere baggrund i ubehandlede celler med en højere procentdel af celler, der scorede som senescent i BLM-behandlede celler. Denne effekt blev også observeret i faste prøver, der blev opbevaret natten over, og i en uge ved fire grader Celsius. Flowcytometrisortering og validering af berigede senescente cellepopulationer ved hjælp af morfologi og proliferationsmarkører vises.Sorterede senescente celler viste forstørret morfologi, som forventet, visualiseret ved farvning af actin med fluorescerende phalloidin. En reduktion i signalet for spredningsmarkør Ki67 blev også observeret ved immunfluorescerende farvning. Endelig blev kvantificering af ældning i tumorer behandlet med kemoterapilægemidler vurderet.X-gal farvning i væv var relativt svag, men blå farvning var tydelig i tumorer behandlet med doxorubicin eller pegyleret liposomal doxorubicin, især i tumorer, der også scorede positivt for ældning ved DDAO-galactosidstrømsassay. Som forventet udviste tumorer, der kun er saltvand, ubetydelig ældning. Her, som med enhver levende celleanalyse, skal protokoltrinnene udføres effektivt, men forsigtigt.Langvarige farvningsprocedurer eller inkubationer ud over de nævnte tidspunkter bør undgås. Hvis senescente celler er flow cytometrisk sorteret, kan de placeres tilbage i kultur til immunoassays eller lyseres og behandles til omics-analyse, herunder transkriptomik eller proteomics. Denne teknik har gjort det muligt for vores laboratorium og andre at identificere nye træk ved senescent tumorceller, herunder kvantificering af DNA-skader, proteinekspression og ændringer i stofskiftet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow flowcytometri-baserede stof Screening System til identifikation af små molekyler, der fremmer Celledifferentiering glioblastom stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunofænotypning af Orthotopic Homograft (Syngeneic) af Murine primære KPC pancreas duktalt adenokarcinom ved flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Berigelse og karakterisering af Tumor immun- og ikke-immune Microenvironments i etablerede subkutane Murine tumorer

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flowcytometri med fluorescerende celle stregkodesystem for enkelt celle signalering analyse og biomarkør opdagelse

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisning af Protease aktivitet af fluorescerende peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Celle cyklus-specifik måling af γH2AX og apoptose efter genotoksisk stress ved flow cytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Automatiseret dissektionsprotokol til tumorberigelse i væv med lavt tumorindhold

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...