Name: far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃŽÂ²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

אנו מודים למתקן ליבת הציטומטריה והנוגדנים באוניברסיטת שיקגו על התמיכה במכשור ציטומטריה של זרימה. המרכז לחקר בעלי חיים באוניברסיטת שיקגו סיפק דיור לבעלי חיים.

כל עבודות בעלי החיים המתוארות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת שיקגו.
1. הכנה ואחסון של פתרונות מלאי
הערה: אם התאים ימוינו בזרימה, יש להכין את כל הפתרונות בטכניקות סטריליות ולסנן אותם דרך התקן מסנן של 0.22 מיקרומטר.
<ol><li...

<ol>
	<li>Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+escape+from+therapy-induced+senescence+as+a+model+of+disease+recurrence+after+dormancy.">Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy.</a> Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).</li><li>Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+in+cancer+therapy:+friends+or+foes.">Senescent cells in cancer therapy: friends or foes.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).</li><li>Prasanna, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+senescence:+Opportunities+to+improve+anticancer+therapy.">Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).</li><li>Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+and+their+secretory+phenotype+as+targets+for+cancer+therapy.">Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy.</a> Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).</li><li>Ou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer:+from+mechanisms+to+detection.">Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection.</a> Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cellular+senescence.">Hallmarks of cellular senescence.</a> Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).</li><li>Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+senescence+phenotype+of+cancer+cells+treated+with+chemotherapeutic+agents.">Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents.</a> Cells. 8 (12), 1501 (2019).</li><li>Miku&#322;a-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Ksi&#261;&#380;ek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+significance+of+therapy-induced+and+spontaneous+senescence+of+cancer+cells.">Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+senescence-associated+&#946;+galactosidase.">Colorimetric detection of senescence-associated &#946; galactosidase.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Tung, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+&#946;-galactosidase+activity+using+far+red+fluorescent+switch.">In vivo imaging of &#946;-galactosidase activity using far red fluorescent switch.</a> Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Galactosidase+activity+assay+using+far-red-shifted+fluorescent+substrate+DDAOG.">beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG.</a> Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin:+Mechanisms+of+formation+and+increase+with+age.">Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age.</a> APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).</li><li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues.">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li><li>Wang, B., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+define+and+target+cellular+senescence+in+cancer.">The quest to define and target cellular senescence in cancer.</a> Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).</li><li>Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+radiotherapy+targets+macromolecules+through+altering+the+tumor+microenvironment.">Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).</li><li>Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+multicolor+flow+cytometry.">Basic multicolor flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).</li><li>Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cell+depletion+through+targeting+BCL-family+proteins+and+mitochondria.">Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria.</a> Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).</li><li>Kim, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+senescent+cell+surface+targetable+protein+DPP4.">Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4.</a> Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).</li><li>Flor, A. C., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-derived+reactive+aldehydes+link+oxidative+stress+to+cell+senescence.">Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence.</a> Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).</li><li>Jochems, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+SENESCopedia:+A+delineation+of+cancer+cell+senescence.">The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence.</a> Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).</li><li>Fallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+and+liposomal+doxorubicin+induce+senescence+by+enhancing+nuclear+factor+kappa+B+and+mitochondrial+membrane+potential.">Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential.</a> Life Sciences. 232, 116677 (2019).</li><li>Kasper, M., Barth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin+and+its+role+in+inducing+apoptosis+and+senescence+in+lung+cells+-+modulating+effects+of+caveolin-1.">Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1.</a> Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).</li><li>Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+EMT+crosstalk+in+bleomycin-induced+pathogenesis+of+pulmonary+fibrosis-an+in+vitro+analysis.">Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis.</a> Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).</li><li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism,+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence.">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).</li><li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16(INK4a)-luciferase+model.">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li><li>Liu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+exhibiting+strong+p16+(INK4a)+promoter+activation+in+vivo+display+features+of+senescence.">Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).</li><li>Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+senescence+for+the+treatment+of+cancer.">Exploiting senescence for the treatment of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).</li><li>Baek, K. -. H., Ryeom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+oncogene-induced+senescence+in+vivo.">Detection of oncogene-induced senescence in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).</li><li>Gonz&#225;lez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Mu&#241;oz-Esp&#237;n, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

במהלך העשור האחרון לערך, ציטומטריה של זרימה הפכה לפלטפורמת בדיקה נפוצה יותר בחקר הסרטן בשל הפופולריות המתפתחת של אימונולוגיה של גידולים, פיתוח ציטומטרים של זרימה בעלות נמוכה יותר ושיפור מתקני מכשור משותפים במוסדות אקדמיים. בדיקות צבעוניות הן כעת סטנדרטיות, מכיוון שרוב המכשירים החדשים מ?...

תאים סנסנטיים בדרך כלל מצטברים באורגניזמים במשך שנים במהלך הזדקנות ביולוגית רגילה, אך עשויים גם להתפתח במהירות בתאי הגידול כתגובה לנזק הנגרם על ידי טיפולים שונים בסרטן, כולל הקרנות וכימותרפיה. למרות שאינם מתרבים עוד, תאי גידול סנסנטיים (TIS) הנגרמים על ידי טיפול עשויים לתרום לעמידות לטיפול ולהניע הישנותשל 1,2,3. גורמים המופרשים על ידי תאי TIS יכולים להחמיר את ממאירות הגידול על ידי קידום התחמקות חיסונית או גרורות 4,5. תאי TIS מפתחים פנוטיפים מורכבים וספציפיים להקשר, פרופילים מטבוליים משתנים ותגובות חיסוניות ייחודיות 6,7,8. לכן, זיהוי ואפיון של תאי גידול מסוג TIS המושרים על ידי גישות שונות לטיפול בסרטן הוא נושא שמעניין באופן שוטף את קהילת חקר הסרטן.
כדי לזהות תאים סרטניים מסוג TIS, נעשה שימוש נרחב במבחני סנסנציה קונבנציונליים, המבוססים בעיקר על גילוי פעילות מוגברת של אנזים סמן הסנסנציה, הבטא-גלקטוזידאז הליזוזומלי GLB19. זיהוי ב-pH ליזוזומלי כמעט נייטרלי (ולא חומצי) מאפשר זיהוי ספציפי של בטא-גלקטוזידאז (SA-β-Gal) הקשור לסנסנציה10. בדיקת SA-β-Gal סטנדרטית שנמצאת בשימוש כבר כמה עשורים משתמשת ב-X-Gal (5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוסייד), מצע בטא-גלקטוזידאז כרומוגני כחול, כדי לזהות SA-β-Gal בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופיית אור11. בדיקת X-Gal מאפשרת אישור חזותי איכותי של TIS תוך שימוש בריאגנטים ובציוד מעבדה זמינים בדרך כלל. מיקרוסקופ אור בסיסי המועבר הוא המכשור היחיד הנדרש להערכת נוכחותו של הכרומוגן הכחול. עם זאת, הליך צביעת X-Gal עלול להיות חסר רגישות, ולעתים נדרשות יותר מ-24 שעות להתפתחות צבע. לאחר מכן מכתים ניקוד סובייקטיבי בעל תפוקה נמוכה של תאים סנסנטיים בודדים בהתבסס על ספירת התאים המציגים רמה מסוימת של עוצמה של הכרומוגן הכחול תחת מיקרוסקופ אור. מכיוון ש-X-Gal הוא אטום לתאים, בדיקה זו דורשת תאים קבועים בממס, שלא ניתן לשחזר לצורך ניתוח במורד הזרם. כאשר עובדים עם דגימות מוגבלות מבעלי חיים או מחולים, זה יכול להיות חיסרון גדול.
מבחני SA-β-Gal משופרים המשתמשים בסובסטרטים של אנזימים פלואורסצנטיים חדירים לתאים, כולל C 12-FDG (5-דודקנוילאמינופלואורסצין Di-β-D-גלקטופירנוזיד, ירוק) ו-DDAOG (9H-(1,3-דיכלורו-9,9-דימתיל-אקרידין-2-אחד-7-yl) β-D-גלקטופירנוסייד, אדום רחוק) הופיעו בעבר בספרות12,13,14,15. מבנה הגשושית הכימית והמאפיינים האופטיים של DDAOG מוצגים באיור משלים S1. גשושיות אלה, המיועדות לתאים, מאפשרות ניתוח של תאים חיים (ולא קבועים), וגשושיות פלואורסצנטיות ולא כרומוגניות מאפשרות שימוש בפלטפורמות ניתוח פלואורסצנטיות מהירות בתפוקה גבוהה, כולל מכשירי סינון בעלי תוכן גבוה וציטומטרים של זרימה. מיון ציטומטרים של זרימה מאפשר התאוששות של אוכלוסיות מועשרות של תאים חיים מתרביות תאים או גידולים לניתוח במורד הזרם (למשל, כתם מערבי, ELISA או 'אומיקה'). ניתוח פלואורסצנטי מספק גם אות כמותי, המאפשר קביעה מדויקת יותר של אחוז התאים הסנסנטיים בתוך דגימה נתונה. ניתן להוסיף בקלות בדיקות פלואורסצנטיות נוספות, כולל בדיקות כדאיות ונוגדנים המסומנים בפלואורופור, לניתוח מרובב של מטרות מעבר ל-SA-β-Gal.
בדומה ל-DDAOG, C12-FDG היא בדיקה פלואורסצנטית עבור SA-β-Gal, אך פליטת הפלואורסצנט הירוקה שלה חופפת למיקוד אוטומטי תאי פנימי, המתעורר במהלך סנסנציה עקב הצטברות של אגרגטים ליפופוסצין בתאים16. על ידי שימוש בגשושית DDAOG בצבע אדום רחוק, ניתן להשתמש במיקוד אוטומטי תאי ירוק כפרמטר משני לאישור סנסנציה17. זה משפר את אמינות הבדיקה על ידי שימוש בסמן שני בנוסף ל- SA-β-Gal, שלעתים קרובות יכול להיות לא אמין כסמן יחיד עבור senescence18. מכיוון שזיהוי של AF אנדוגני בתאים סנסנטיים הוא גישה נטולת תוויות, זוהי דרך מהירה ופשוטה להרחיב את הספציפיות של הבדיקה מבוססת ה- DDAOG שלנו.
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש ב-DDAOG וב-AF כבדיקת ציטומטריה מהירה של זרימה דו-פרמטרית לזיהוי תאי גידול TIS בני קיימא מתרביות מבחנה או מבודדים מגידולים שטופלו בתרופות שהוקמו בעכברים (איור 1). הפרוטוקול משתמש בפלואורופורים התואמים למגוון רחב של מנתחי וממיינים סטנדרטיים של ציטומטריה של זרימה מסחרית (טבלה 1). כמות של אחוז התאים הסנסוניים בני קיימא באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה סטנדרטית מופעלת. אם תרצה, ניתן לבצע שלב חיסוני אופציונלי כדי להעריך אנטיגנים בעלי עניין על פני התא במקביל לסנסנציה. ניתן גם להעשיר תאים סנסנטיים מזוהים באמצעות מתודולוגיית מיון תאים פלואורסצנטית סטנדרטית (FACS).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה ניסיונית. סכמטי המסכם נקודות מפתח של מבחן DDAOG. (A) תרופה הגורמת ל-TIS מתווספת לתאים בתרבית של יונקים או ניתנת לעכברים נושאי גידול. לאחר מכן הזמן מותר להופעת TIS: לתאים, 4 ימים לאחר הטיפול; עבור עכברים, 22 ימים בסך הכל, עם שלושה טיפולים כל 5 ימים ועוד 7 ימי התאוששות. תאים נקצרים או גידולים מנותקים לתוך ההשעיה. (B) דגימות מטופלות ב-Baf כדי להתאים את ה-pH הליזוזומלי לזיהוי SA-β-Gal למשך 30 דקות; לאחר מכן, גשושית DDAOG מתווספת למשך 60 דקות כדי לזהות SA-β-Gal. דגימות נשטפות 2x ב- PBS, וכתם כדאיות מתווסף לזמן קצר (15 דקות). לחלופין, ניתן להכתים דגימות בנוגדנים פלואורסצנטיים בתעלות פלואורסצנטיות פתוחות ו/או לתקן אותן לצורך ניתוח מאוחר יותר. (C) דגימות מנותחות באמצעות ציטומטר זרימה סטנדרטי. תאים בני קיימא מוצגים באופן חזותי בחלקות נקודות המציגות DDAOG אדום (המציין SA-β-Gal) לעומת אוטופלואורסצנציה ירוקה (lipofuscin). שער לקביעת אחוז תאי ה- TIS נקבע על סמך דגימות בקרה לא מטופלות (לא מוצגות). אם נעשה שימוש בציטומטר מיון (FACS), ניתן לאסוף תאי TIS ולהחזירם לתרבית לצורך בדיקות נוספות במבחנה או לשכב ולעבד אותם למבחני ביולוגיה מולקולרית. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; TIS = סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול; FL-Ab = נוגדן מצומד פלואורופור; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה; PBS = מלח חצוב פוספט; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פלואורופור</td>
			<td>מזהה</td>
			<td>Ex/Em (ננומטר)</td>
			<td>לייזר ציטומטר (ננומטר)</td>
			<td>גלאי ציטומטר / מסנן פס פס (nm)</td>
		</tr><tr><td>DDAOG</td>
			<td>SA-β-גל</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>מיקוד אוטומטי</td>
			<td>ליפופוסקין</td>
			<td>< 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>CV450</td>
			<td>כדאיות</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>PE</td>
			<td>נוגדן/סמן פני השטח</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מפרטים אופטיים של פלואורופורים וציטומטר. מפרטי ציטומטר המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים עבור מכשיר עם סך של 4 לייזרים ו -15 גלאי פליטה. DDAOG שזוהה ב-645/660 ננומטר הוא הצורה של הגשושית שנבקעה על ידי SA-β-Gal1. DDAOG לא יציב יכול להפגין פלואורסצנטיות ברמה נמוכה ב-460/610 ננומטר, אך הוא מוסר על ידי שלבי שטיפה בפרוטוקול. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; AF = אוטופלואורסצנציה; PE = פיקואריתרין; SA-β-Gal = בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>B40500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Violet 450 AM viability dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65-0854-39</td>
			<td>eBioscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPP4 antibody, PE conjugate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137803</td>
			<td>Clone H194-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: A549 human lung adenocarcinoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: B16-F10 mouse melanoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDAO-Galactoside</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11960-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC 0069-3032-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)</td>
			<td>Sun Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 47335-049-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>12092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega&#160;</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc receptor blocking reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell analyzer)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>LSRFortessa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell sorter)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>FACSAria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BW17737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (without calcium and magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration particles, ultra kit</td>
			<td>SpheroTech</td>
			<td>UCRP-38-2K</td>
			<td>3.5-3.9 &#181;m, 2E6/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride 0.9% (USP)</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>2B1324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data acquisition, &#34;FACSDiva&#34;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact BD for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data analysis, &#34;FlowJo&#34;</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact TreeStar for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry

סנסנציה תאית היא מצב של מעצר שגשוג הנגרם על ידי נזק ביולוגי שבדרך כלל מצטבר לאורך שנים בתאים מזדקנים, אך עשוי להופיע במהירות גם בתאי הגידול כתגובה לנזק הנגרם על ידי טיפולים שונים בסרטן. סנסנציה של תאי גידול נחשבת בדרך כלל לבלתי רצויה, שכן תאים סנסנטיים הופכים עמידים למוות וחוסמים את הפוגה של הגידול תוך החרפת ממאירות הגידול ועמידות לטיפול. לכן, זיהוי של תאים סרטניים סנסנטיים הוא עניין מתמשך לקהילת חקר הסרטן. קיימים מבחני סנסנציה שונים, רבים מהם מבוססים על פעילותו של סמן הסנסנציה הידוע, בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-Gal). 
בדרך כלל, בדיקת SA-β-Gal מבוצעת באמצעות מצע כרומוגני (X-Gal) על תאים קבועים, עם ספירה איטית וסובייקטיבית של תאים סנסנטיים "כחולים" על ידי מיקרוסקופיית אור. בדיקות משופרות המשתמשות במצעי SA-β-Gal פלואורסצנטיים החודשים לתאים, כולל C12-FDG (ירוק) ו-DDAO-Galactoside (DDAOG; אדום-רחוק), אפשרו ניתוח של תאים חיים ואפשרו שימוש בפלטפורמות ניתוח פלואורסצנטיות בתפוקה גבוהה, כולל ציטומטרים של זרימה. C12-FDG היא בדיקה מתועדת היטב עבור SA-β-Gal, אך פליטת הפלואורסצנט הירוקה שלה חופפת לאוטופלואורסצנציה תאית פנימית (AF) המתעוררת במהלך סנסנציה עקב הצטברות של אגרגטים ליפופוסצין. על ידי שימוש בגשושית SA-β-Gal האדומה הרחוקה DDAOG, ניתן להשתמש ב-autofluorescence של תאים ירוקים כפרמטר משני כדי לאשר את הסנסנציה, ולהוסיף אמינות לבדיקה. ניתן להשתמש בתעלות הפלואורסצנטיות הנותרות לצורך צביעת כדאיות התאים או לתיוג חיסוני פלואורסצנטי אופציונלי.
באמצעות ציטומטריה של זרימה, אנו מדגימים את השימוש ב- DDAOG וב- lipofuscin autofluorescence כבדיקה דו-פרמטרית לזיהוי תאי גידול סנסנטיים. כמות של אחוז התאים senescent קיימא מבוצעת. אם תרצה, ניתן לכלול שלב אופציונלי של תיוג חיסוני כדי להעריך אנטיגנים מעניינים על פני התא. תאים סנסנטיים מזוהים יכולים גם להיות ממוינים בצורה ציטומטרית ונאספים לניתוח במורד הזרם. תאים סנסנטיים שנאספו יכולים להיות שוכבים באופן מיידי (למשל, לצורך בדיקות חיסוניות או 'ניתוח אומיקה') או בתרבית נוספת.

מספר ניסויים בוצעו כדי להדגים את יכולת ההשוואה של DDAOG ל-X-Gal ו-C12-FDG לזיהוי סנסנציה על ידי SA-β-Gal. ראשית, X-Gal שימש להכתמת תאי מלנומה מסוג B16-F10 המושרים על-ידי ETO (איור 2A). צבע כחול עז התפתח בתת-קבוצה של תאים שטופלו ב-ETO, בעוד שתאים אחרים הפגינו פחות כתמים כחולים עזים. המורפולוגיה...

Watch this Scientific Journal Video about Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃŽÂ²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

פרוטוקול לכימות ציטומטרי פלואורסצנטי, זרימה של תאים סרטניים סנסנטיים המושרים על ידי תרופות כימותרפיות בתרבית תאים או במודלים של גידולי מורין. הליכים אופציונליים כוללים co-immunostaining, קיבוע דגימה כדי להקל על אצווה גדולה או ניתוח נקודת זמן, והעשרה של תאים senescent קיימא על ידי מיון ציטומטרי זרימה.

בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

פרוטוקול הציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים שלנו מאפשר זיהוי מהיר ומשופר של סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול בתאי הגידול, המהווה תנאי למחקר מתמשך בביולוגיה ובטיפול בסרטן. בדיקת הציטומטריה של הזרימה שלנו מהירה יותר מבדיקות קיימות המבוססות על מיקרוסקופיה. אנו משתמשים בשני סמנים, במקום רק אחד, כדי לזהות תאים סנסנטיים, ובכך לשפר את אמינות הבדיקה.תאים יכולים להיות מוכתמים יחד עם נוגדנים פלואורסצנטיים כדי לזהות מטרות נוספות של עניין. ניתן להשתמש במיון ציטומטריה של זרימה כדי להעשיר אוכלוסיות של תאים סנסנטיים לצורך ניתוח במורד הזרם. הבדיקה יכולה לזהות תאים סנסנטיים בקווי תאים סרטניים בתרבית, או בדגימות גידול שלמות לאחר דיסוציאציה עדינה.לפני שתנסה טכניקה זו, חשוב להכיר את נהלי ההפעלה הכלליים של ציטומטר הזרימה המשמש. אנא עיין בטקסט לקבלת מפרטים מומלצים של ציטומטר זרימה. יום אחד לפני השראת הסנסנציה על ידי תרופות, קצרו את תרבית קו התאים הסרטניים עם 0.25% טריפסין EDTA.מניחים את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להפעיל טריפסין, ומנתקים את התא מונולייר. כאשר המונולאייר התנתק באופן נראה לעין, נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבות שלם. העבר את ההשעיה התאית לצינור חרוטי סטרילי.לספור את התאים בשיטת ההמוציטומטר הסטנדרטית, ולרשום תאים למיליליטר. תאי צלחת באחת כפול 10 עד השלישי עד 10 פעמים 10 עד השלישי לתאים לסנטימטר מרובע בצלחת תרבית פלסטיק סטנדרטית של שש בארות. יש לדגום את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולחות.למחרת, לטפל בתאים עם סוכן מעורר סנסנציה של עניין, כגון etoposide. לאחר מכן לדגור במשך ארבעה ימים כדי לאפשר את הופעת senescence. בחנו את התאים מדי יום תחת מיקרוסקופ אור כדי לאתר את השינויים המורפולוגיים הצפויים.לאחר תחילת הסנסנציה, קצור את התאים על ידי הוספת טריפסין EDTA במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מנותקים לתוך ההשעיה, לנטרל טריפסין עם נפח שווה של מדיום שלם. העבר כל באר של תרחיף התא לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר.ספרו את התאים שוב והכניסו מספר שווה של תאים לכל דגימה לקבוצה חדשה של צינורות. צנטריפוגה את הצינורות במשך חמש דקות ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. ראשית, התאם את ה- pH הליזוזומלי של דגימות תאים בתרבית על ידי הוספת תמיסה של בפילומיצין מיקרומולרי אחד ב- DMEM לכדור התא בריכוז של פעם אחת 10 לתאים השישיים למיליליטר, ופיפטה לערבוב.דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על סיבוב במהירות איטית. לאחר מכן, כדי להכתים את הבטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה, הוסיפו תמיסת מלאי DDAOG ב-10 מיקרוגרם למיליליטר לדגימות ללא שטיפה. מניחים על מסובב במשך 60 דקות מוגן מפני אור ישיר.כמו קודם, צנטריפוגה את הצינורות, להסיר את supernatant, ולשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של קרח קר 0.5% BSA ב PBS. לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת Calcein Violet 450 AM מדוללת לכדורי התא השטופים. לדגור במשך 15 דקות על קרח בחושך.העבר את דגימות התאים לצינורות תואמי מכשיר ציטומטריה זורמים. בתוכנת רכישת הנתונים, פתח היסטוגרמה של ערוץ סגול וערוץ אדום רחוק לעומת עלילת נקודה של ערוץ ירוק. התחל איסוף נתוני ציטומטר במהירות כניסה נמוכה והנח את דגימות הבקרה החיוביות המוכתמות ב- DDAOG על יציאת הכניסה.התחל לרכוש נתונים לדוגמה. התאם את מתחי הערוץ כך שיותר מ -90% מהאירועים כלולים בכל עלילה. כאשר כל ההגדרות הן אופטימליות, הקלט 10, 000 אירועים לכל מדגם.הניחו את דגימות הבקרה לרכב בלבד מוכתמות ב-DDAOG על פתח הכניסה. התחל רכישת נתונים ותעד 10, 000 אירועים לכל מדגם. חפש עלייה ב-autofluorescence, או AF, ואות DDAO-גלקטוזיד לעומת שליטה חיובית.שמור את הנתונים לדוגמה בתבנית קובץ fcs וייצא את הקבצים למחשב תחנת עבודה המצויד בתוכנת ניתוח ציטומטריה של זרימה. באמצעות תוכנת ניתוח נתונים ציטומטריה, טען את קבצי הנתונים של fcs עבור כל הדוגמאות שנרכשו. ראשית, כדי לשער תאים בני קיימא, לחץ פעמיים על נתוני הדגימה עבור פקד הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלו.הצג את הנתונים באופן חזותי כהיסטוגרמה של ערוץ סגול. התאים בני הקיימא המוכתמים, המוכתמים על ידי CV 450, מבוססים על הפלואורסצנטיות הבהירה יותר שלהם מאשר התאים המתים. צייר שער באמצעות הכלי היסטוגרמה שער יחיד כדי לכלול תאים בני קיימא בלבד.תן שם לשער קיימא. לאחר מכן גררו את שער ה-קיימא אל דגימות התאים האחרות מחלון פריסת הדגימה כדי להחיל את השער באופן אחיד. פתח את החלון פריסה.בחלון 'פריסה', הצג באופן חזותי את כל הדוגמאות כהיסטוגרמות של ערוץ סגול. ודא שסידור תאים בר-קיימא מתאים לדגימות שונות. אם לא, התאם לפי הצורך.לאחר מכן, כדי לשער תאים סנסנטיים, לחץ פעמיים על נתוני התאים המגודרים עבור הבקרה לרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלו. לאחר מכן הצג את הנתונים באופן חזותי כמתווה נקודה עבור הערוץ האדום הרחוק לעומת הערוץ הירוק. ציירו שער באמצעות הכלי Rectangle Gating כדי לכלול פחות מ-5% מהתאים החיוביים ל-DDAO ותאים חיוביים ל-AF מהרביע הימני העליון.תן לשער את השם Senescent. לאחר מכן גררו את שער Senescent אל תת-הערכה בת הקיימא של כל הדגימות מחלון הפריסה לדוגמה כדי להחיל את השער באופן אחיד. לתוך החלון פריסה, גרור ושחרר את כל קבוצות המשנה המגודרות בתאים.הצג באופן חזותי את כל הדגימות הקיימות כנקודות ערוץ אדומות רחוקות לעומת ירוקות, והתבונן בתוצאות. ודא שהשער הסנסנטי גלוי בכל המגרשים ושהשער לפקדים לרכב בלבד מציג פחות מ-5% תאים סנסנטיים. הניתוח הושלם כעת.כעת ניתן לייצא נתונים לפי הצורך בתבנית גרפית וטבלה. בהשוואה לתאים שלא טופלו, תאי מלנומה B16-F10 סנסנטיים המושרים על ידי אטופוסיד הציגו מורפולוגיה מוגדלת וכתמים כחולים עקב ביקוע של X-gal על ידי בטא-גלקטוזידאז גבוה הקשור לסנסנציה. צביעה של תאים שטופלו באטופוזיד עם C12FDG פלואורסצנטי, או DDAOG הדגימה דפוסי צביעה דומים ושינויי עוצמה ל-X-gal.עם זאת, הודגם כי פליטת C12FDG תאית חופפת לפליטת C12FDG ירוקה מצטברת בתאים סנסנטיים לא מוכתמים. לעומת זאת, אוטופלואורסצנציה הייתה בדרך כלל זניחה בטווח הפליטה האדום-רחוק של DDAOG. כאן מוצגים מיקרו-ספירות של נתוני ציטומטר זרימה עבור חלקות פיזור, מיקרו-כדורים של כיול פלואורסצנטי מסחרי של חמישה פסגות קשת ונתוני פלואורסצנציה חד-ערוציים מתאים מוכתמים.נתוני בדיקת ציטומטר זרימה DDAOG עבור תאי מלנומה B16-F10 הראו כי סנסנס המושרה על ידי טיפול, או TIS, המושרה על ידי אטופוסיד התרחשה ב -35% מהתאים בני קיימא, והסוכן הסנוליטי ABT-263 כמעט חיסל תאי טיס. בתאי סרטן ריאה A549, TIS המושרה על ידי בלומיצין ב-66% מהתאים בני קיימא ו-ABT-263 הפחיתו את האחוז ל-15. ABT-263 לבדו לא היה רעיל לתאים מתרבים שלא טופלו.בבדיקת צביעת נוגדנים, היסטוגרמה של נתוני ערוץ PE הראתה כי 42% מהתאים שטופלו באטופוסיד היו חיוביים עבור סמן הסנסנציה DPPP4-חיובי. יתר על כן, הדמיה עם עלילות נקודה דו-ממדיות הצביעה על כך ש-44% מהתאים שטופלו באטופוסיד היו חיוביים פי שניים עבור DDAOG ו-DPP4 לעומת 4% מתאי הרכב בלבד. קיבוע של תאים מוכתמים DDAOG הוערך הבא.בהשוואה לדגימות בקרה לא מתוקנות, דגימות קבועות הציגו רקע מעט גבוה יותר בתאים לא מטופלים עם אחוז גבוה יותר של תאים בעלי ניקוד כסנסנטי בתאים שטופלו ב-BLM. השפעה זו נצפתה גם בדגימות קבועות שאוחסנו בן לילה, ובמשך שבוע אחד בארבע מעלות צלזיוס. מיון ציטומטריה של זרימה ואימות של אוכלוסיות תאים סנסנטיים מועשרים על ידי מורפולוגיה וסמני התפשטות מוצגים.תאים סנסנטיים ממוינים הציגו מורפולוגיה מוגדלת, כצפוי, שהומחשה על ידי צביעת אקטין בפלואורסצנט פלואידין. ירידה באות עבור סמן התפשטות Ki67 נצפתה גם על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית. לבסוף, הוערך כימות של סנסנציה בגידולים שטופלו בתרופות כימותרפיות.צביעת X-gal ברקמות הייתה חלשה יחסית, אך כתמים כחולים ניכרו בגידולים שטופלו בדוקסורוביצין, או דוקסורוביצין ליפוזומלי פגיאלי, במיוחד בגידולים שגם קיבלו ציון חיובי לסנסנציה על ידי בדיקת זרימה DDAO-גלקטוזיד. כצפוי, גידולים מלוחים בלבד הפגינו זניחות זניחה. כאן, כמו בכל בדיקת תא חי, שלבי הפרוטוקול צריכים להתבצע ביעילות, אך בעדינות.יש להימנע מהליכי צביעה ממושכים, או דגירה מעבר לזמנים שהוזכרו. אם תאים סנסנטיים ממוינים בצורה ציטומטרית של זרימה, ניתן להחזיר אותם לתרבית לצורך בדיקות חיסוניות, או לשכב, ולעבד אותם לניתוח אומיקה, כולל תעתיק, או פרוטאומיקה. טכניקה זו אפשרה למעבדה שלנו ולאחרים לזהות תכונות חדשות של תאי גידול סנסנטיים, כולל כימות של נזק לדנ"א, ביטוי חלבונים ושינויים בחילוף החומרים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...