Name: far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃŽÂ²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

シカゴ大学のサイトメトリーおよび抗体コアファシリティには、フローサイトメトリー機器のサポートに感謝します。シカゴ大学の動物研究センターは動物の住居を提供しました。

記載されているすべての動物実験は、シカゴ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.原液の調製と保管
注:細胞をフローソーティングする場合は、滅菌技術を使用してすべての溶液を調製し、0.22 μmフィルター装置でろ過する必要があります。
<ol><li>DDAO-ガラクトシドのストック溶液をDMSO溶液5 mg/mLで調製しま?...

<ol>
	<li>Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+escape+from+therapy-induced+senescence+as+a+model+of+disease+recurrence+after+dormancy.">Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy.</a> Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).</li><li>Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+in+cancer+therapy:+friends+or+foes.">Senescent cells in cancer therapy: friends or foes.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).</li><li>Prasanna, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+senescence:+Opportunities+to+improve+anticancer+therapy.">Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).</li><li>Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells+and+their+secretory+phenotype+as+targets+for+cancer+therapy.">Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy.</a> Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).</li><li>Ou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer:+from+mechanisms+to+detection.">Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection.</a> Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cellular+senescence.">Hallmarks of cellular senescence.</a> Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).</li><li>Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+senescence+phenotype+of+cancer+cells+treated+with+chemotherapeutic+agents.">Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents.</a> Cells. 8 (12), 1501 (2019).</li><li>Miku&#322;a-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Ksi&#261;&#380;ek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+significance+of+therapy-induced+and+spontaneous+senescence+of+cancer+cells.">Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+senescence-associated+&#946;+galactosidase.">Colorimetric detection of senescence-associated &#946; galactosidase.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Tung, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+&#946;-galactosidase+activity+using+far+red+fluorescent+switch.">In vivo imaging of &#946;-galactosidase activity using far red fluorescent switch.</a> Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Galactosidase+activity+assay+using+far-red-shifted+fluorescent+substrate+DDAOG.">beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG.</a> Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin:+Mechanisms+of+formation+and+increase+with+age.">Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age.</a> APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).</li><li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues.">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li><li>Wang, B., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+define+and+target+cellular+senescence+in+cancer.">The quest to define and target cellular senescence in cancer.</a> Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).</li><li>Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+radiotherapy+targets+macromolecules+through+altering+the+tumor+microenvironment.">Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).</li><li>Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+multicolor+flow+cytometry.">Basic multicolor flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).</li><li>Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cell+depletion+through+targeting+BCL-family+proteins+and+mitochondria.">Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria.</a> Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).</li><li>Kim, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+senescent+cell+surface+targetable+protein+DPP4.">Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4.</a> Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).</li><li>Flor, A. C., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-derived+reactive+aldehydes+link+oxidative+stress+to+cell+senescence.">Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence.</a> Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).</li><li>Jochems, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+SENESCopedia:+A+delineation+of+cancer+cell+senescence.">The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence.</a> Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).</li><li>Fallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+and+liposomal+doxorubicin+induce+senescence+by+enhancing+nuclear+factor+kappa+B+and+mitochondrial+membrane+potential.">Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential.</a> Life Sciences. 232, 116677 (2019).</li><li>Kasper, M., Barth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin+and+its+role+in+inducing+apoptosis+and+senescence+in+lung+cells+-+modulating+effects+of+caveolin-1.">Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1.</a> Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).</li><li>Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+EMT+crosstalk+in+bleomycin-induced+pathogenesis+of+pulmonary+fibrosis-an+in+vitro+analysis.">Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis.</a> Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).</li><li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism,+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence.">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).</li><li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16(INK4a)-luciferase+model.">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li><li>Liu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+exhibiting+strong+p16+(INK4a)+promoter+activation+in+vivo+display+features+of+senescence.">Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).</li><li>Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+senescence+for+the+treatment+of+cancer.">Exploiting senescence for the treatment of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).</li><li>Baek, K. -. H., Ryeom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+oncogene-induced+senescence+in+vivo.">Detection of oncogene-induced senescence in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).</li><li>Gonz&#225;lez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Mu&#241;oz-Esp&#237;n, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

過去10年ほどで、フローサイトメトリーは、腫瘍免疫学の人気の高まり、低コストのフローサイトメーターの開発、および学術機関での共有機器施設の改善により、癌研究においてより一般的なアッセイプラットフォームになりました。マルチカラーアッセイは現在標準であり、ほとんどの新しい機器には紫、青緑、赤から遠赤色の光学アレイが装備されています。したがって、このDDAOGプロ...

老化細胞は通常、通常の生物学的老化の間に何年にもわたって生物に蓄積しますが、放射線や化学療法を含むさまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞で急速に発達することもあります。もはや増殖しないが、治療誘発老化(TIS)腫瘍細胞は治療抵抗性に寄与し、再発を引き起こす可能性がある1,2,3。TIS細胞によって分泌される因子は、免疫回避または転移を促進することにより、腫瘍の悪性腫瘍を悪化させる可能性があります4,5。TIS細胞は、複雑な状況特異的な表現型、変化した代謝プロファイル、および独自の免疫応答を発達させます6,7,8。したがって、さまざまな癌治療アプローチによって誘導されるTIS腫瘍細胞の同定と特性評価は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。
TIS腫瘍細胞を検出するために、従来の老化アッセイが広く用いられており、主として老化マーカー酵素であるリソソームβ-ガラクトシダーゼGLB19の活性の増加を検出することに基づいている。(酸性ではなく)中性に近いリソソームpHでの検出により、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)10を特異的に検出できます。数十年にわたって使用されてきた標準的なSA-β-Galアッセイは、青色発色ベータガラクトシダーゼ基質であるX-Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を使用して、光学顕微鏡によって固定細胞中のSA-β-Galを検出します11。X-Galアッセイは、一般的に入手可能な試薬や実験装置を利用してTISを定性的に視覚的に確認することができます。基本的な透過光顕微鏡は、青色色原体の存在を評価するために必要な唯一の機器です。ただし、X-Gal染色手順は感度に欠ける可能性があり、色が発色するまでに24時間以上かかる場合があります。染色に続いて、光学顕微鏡下で青色色原体のある程度の強度を示す細胞をカウントすることに基づいて、個々の老化細胞の低スループットの主観的スコアリングが行われます。X-Galは細胞不透過性であるため、このアッセイには溶媒固定細胞が必要であり、ダウンストリーム分析のために回収することはできません。動物や患者からの限られたサンプルを扱う場合、これは大きな欠点になる可能性があります。
C 12-FDG(5-ドデカノイルアミノフルオレセインジβ-D-ガラクトピラノシド、緑色)およびDDAOG(9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン-7-イル)β-D-ガラクトピラノシド、遠赤色)を含む、細胞透過性の蛍光酵素基質を用いた改良されたSA-β-Galアッセイは、文献12,13,14,15にすでに登場しています。DDAOGの化学プローブの構造と光学特性を補足図S1に示します。これらの細胞透過性プローブは(固定ではなく)生細胞の分析を可能にし、発色プローブではなく蛍光プローブは、ハイコンテントスクリーニング装置やフローサイトメーターなどの高速ハイスループット蛍光分析プラットフォームの使用を容易にします。ソーティングフローサイトメーターを使用すると、細胞培養物や腫瘍から濃縮された老化細胞の集団を回収して、ダウンストリーム分析(ウェスタンブロッティング、ELISA、オミクスなど)を行うことができます。蛍光分析は定量的シグナルも提供し、特定のサンプル内の老化細胞の割合をより正確に決定できるようにします。生存率プローブや蛍光色素標識抗体などの蛍光プローブも容易に追加でき、SA-β-Gal以外のターゲットのマルチプレックス解析が可能です。
DDAOGと同様に、C12-FDGはSA-β-Galの蛍光プローブですが、その緑色の蛍光発光は、細胞16にリポフスチン凝集体が蓄積するために老化中に生じる固有の細胞AFと重なります。遠赤色DDAOGプローブを利用することにより、緑色セルラーAFを老化17を確認するための二次パラメータとして使用できます。これにより、老化18の単一マーカーとして信頼性が低いことが多いSA-β-Galに加えて、2番目のマーカーを使用することでアッセイの信頼性が向上します。老化細胞における内因性AFの検出はラベルフリーのアプローチであるため、DDADOGベースのアッセイの特異性を拡大するための迅速かつ簡単な方法です。
このプロトコルでは、 in vitro 培養から、またはマウスで確立された薬物治療腫瘍から単離された生存可能なTIS腫瘍細胞を同定するための迅速なデュアルパラメータフローサイトメトリーアッセイとしてDDAOGおよびAFを使用する方法を示します(図1)。このプロトコルは、市販の幅広い標準的なフローサイトメトリー分析装置およびソーターと互換性のある蛍光色素を使用しています(表1)。標準的なフローサイトメトリー分析を用いた生細胞の割合の定量が可能です。所望により、任意の免疫標識ステップを実施して、老化と同時に目的の細胞表面抗原を評価してもよい。同定された老化細胞は、標準的な蛍光活性化セルソーティング(FACS)方法論を使用して濃縮することもできます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> 図1:実験ワークフロー。 DDAOGアッセイの要点をまとめた概略図。(A)哺乳類培養細胞にTIS誘導薬を添加するか、担がんマウスに投与する。その後、TISの発症に時間が与えられます:細胞の場合、治療後4日。マウスの場合、合計22日間、5日ごとに3回の治療と7日間の回復。細胞を採取するか、腫瘍を解離して懸濁液にします。(B)サンプルをBafで処理して、SA-β-Galを検出するためにリソソームpHを30分間調整します。次に、DDAOGプローブを60分間追加して、SA-β-Galを検出します。サンプルをPBSで2回洗浄し、生存率染色剤を短時間加えます(15分)。オプションで、サンプルをオープン蛍光チャネルで蛍光抗体で染色したり、後で分析するために固定したりすることができます。(C)サンプルは、標準のフローサイトメーターを使用して分析されます。生細胞は、赤色のDDAOG(SA-β-Galを示す)と緑色の自家蛍光(リポフスチン)を示すドットプロットで視覚化されます。TIS細胞の割合を決定するためのゲートは、未処理の対照試料(図示せず)に基づいて確立される。ソーティングサイトメーター(FACS)を使用する場合、TIS細胞を回収して培養液に戻してin vitro アッセイを行ったり、分子生物学的アッセイのために溶解して処理したりすることができます。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;TIS =治療誘発性老化;FL-Ab = 蛍光色素標識抗体;Baf = バフィロマイシンA1;SA-β-Gal=老化関連β-ガラクトシダーゼ;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;FACS = 蛍光活性化細胞選別。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>フルオロフォア</td>
			<td>検出</td>
			<td>例/エム (ナノメートル)</td>
			<td>サイトメーターレーザー(nm)</td>
			<td>サイトメーター検出器/バンドパスフィルター(nm)</td>
		</tr><tr><td>ダオグ</td>
			<td>サβガル</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>AF</td>
			<td>リポフスチン</td>
			<td>< 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>CV450</td>
			<td>生存 率</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>ペ</td>
			<td>抗体/表面マーカー</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>表1:蛍光色素およびサイトメーターの光学仕様。 このプロトコルで使用されるサイトメーターの仕様は、合計4つのレーザーと15の発光検出器を備えた機器についてリストされています。645/660 nmで検出されたDDAOGは、SA-β-Gal1によって切断されたプローブの形態です。切断されたDDAOGは、460/610 nmで低レベルの蛍光を示す可能性がありますが、プロトコルの洗浄ステップによって除去されます。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;AF =自家蛍光;PE =フィコエリスリン;SA-β-Gal =老化関連β-ガラクトシダーゼ。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>B40500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Violet 450 AM viability dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65-0854-39</td>
			<td>eBioscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPP4 antibody, PE conjugate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137803</td>
			<td>Clone H194-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: A549 human lung adenocarcinoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line: B16-F10 mouse melanoma</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDAO-Galactoside</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11960-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC 0069-3032-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)</td>
			<td>Sun Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 47335-049-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide&#160;</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>12092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega&#160;</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc receptor blocking reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell analyzer)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>LSRFortessa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (cell sorter)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>Various</td>
			<td>FACSAria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BW17737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (without calcium and magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration particles, ultra kit</td>
			<td>SpheroTech</td>
			<td>UCRP-38-2K</td>
			<td>3.5-3.9 &#181;m, 2E6/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride 0.9% (USP)</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>2B1324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data acquisition, &#34;FACSDiva&#34;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact BD for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for cytometer data analysis, &#34;FlowJo&#34;</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Contact TreeStar for license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

far-red fluorescent senescence-associated &#946;-galactosidase probe for identification and enrichment of senescent tumor cells by flow cytometry

細胞老化は、生物学的損傷によって誘発される増殖性停止の状態であり、通常は老化した細胞で何年にもわたって発生しますが、さまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞に急速に現れることもあります。老化細胞は死に抵抗性になり、腫瘍の悪性度と治療抵抗性を悪化させながら腫瘍の寛解をブロックするため、腫瘍細胞の老化は一般的に望ましくないと考えられています。したがって、老化した腫瘍細胞の同定は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。様々な老化アッセイが存在し、その多くは、よく知られている老化マーカーである老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−Gal)の活性に基づいている。 
典型的には、SA-β-Galアッセイは、固定細胞上の発色基質(X-Gal)を用いて行われ、光学顕微鏡による「青色」老化細胞のゆっくりとした主観的な列挙が行われる。C12-FDG(緑色)およびDDAO-ガラクトシド(DDAOG;遠赤色)を含む、細胞透過性の蛍光SA-β-Gal基質を使用した改良されたアッセイにより、生細胞の分析が可能になり、フローサイトメーターを含むハイスループット蛍光分析プラットフォームの使用が可能になりました。C12-FDGはSA-β-Galのプローブとして十分に文書化されていますが、その緑色蛍光発光は、リポフスチン凝集体の蓄積により老化中に生じる固有の細胞自家蛍光(AF)と重複しています。遠赤色のSA-β-GalプローブDDAOGを利用することにより、緑色の細胞自家蛍光を老化を確認するための二次パラメータとして使用でき、アッセイの信頼性が向上します。残りの蛍光チャネルは、細胞生存率染色またはオプションの蛍光免疫標識に使用できます。
フローサイトメトリーを使用して、老化した腫瘍細胞を同定するためのデュアルパラメーターアッセイとしてDDAOGとリポフスチン自家蛍光の使用を実証します。生細胞の割合の定量が行われる。所望により、目的の細胞表面抗原を評価するための任意の免疫標識ステップが含まれていてもよい。同定された老化細胞は、フローサイトメトリーで選別し、ダウンストリーム分析のために収集することもできます。集められた老化細胞は、直ちに溶解(例えば、イムノアッセイまたは'オミクス分析のために)またはさらに培養することができる。

SA-β-Galによる老化の検出について、DDAOGとX-GalおよびC12-FDGの比較可能性を実証するために、いくつかの実験が行われました。まず、X-Galを用いて、ETOにより誘導された老化性B16-F10メラノーマ細胞を染色した(図2A)。ETO処理細胞のサブセットでは濃い青色が発達しましたが、他の細胞はそれほど強くない青色染色を示しました。形態は、ほとんどのETO処理細胞で拡?...

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Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

当社のマルチパラメーターフローサイトメトリープロトコルは、がん生物学および治療において進行中の研究条件である腫瘍細胞における治療誘発老化の迅速かつ改善された検出を可能にします。当社のフローサイトメトリー老化アッセイは、既存の顕微鏡ベースのアッセイよりも迅速です。老化細胞を同定するために、1つではなく2つのマーカーを使用し、アッセイの信頼性を向上させます。細胞を蛍光抗体と共染色して、目的の追加のターゲットを検出することができます。フローサイトメトリーソーティングは、下流分析のために老化細胞の集団を濃縮するために使用できます。このアッセイは、培養がん細胞株、または穏やかな解離後の腫瘍サンプル全体の老化細胞を検出できます。この手法を試す前に、使用するフローサイトメーターの一般的な操作手順に精通していることが重要です。推奨フローサイトメーターの仕様については、本文を参照してください。薬物による老化誘導の前日に、0.25%トリプシンEDTAで癌細胞株培養物を回収する。細胞を摂氏37度で5分間置き、トリプシンを活性化し、細胞単層を剥離します。単層が目に見えて剥離したら、等量の完全培養培地を加えてトリプシンを中和します。細胞懸濁液を滅菌円錐管に移す。標準的な血球計算法を用いて細胞をカウントし、ミリリットル当たりの細胞を記録します。平板細胞は、標準的な6ウェルプラスチック培養プレートで1平方センチメートルあたり10〜3〜10倍で10〜3番目の細胞である。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします二酸化炭素と湿度。翌日、エトポシドなどの目的の老化誘導剤で細胞を処理します。その後、老化の開始を可能にするために4日間インキュベートします。光学顕微鏡で細胞を毎日調べて、予想される形態変化を調べます。老化の開始後、摂氏37度で5分間トリプシンEDTAを加えて細胞を収穫します。細胞が懸濁液に解離したら、等量の完全培地でトリプシンを中和します。細胞懸濁液の各ウェルを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞を再度カウントし、サンプルごとに同数の細胞を新しいチューブセットに分注します。チューブを摂氏4度で1, 000 gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。まず、1ミリリットルあたり10〜6細胞の濃度で細胞ペレットにDMEM中の1マイクロモルのバフィロマイシンAの溶液を添加して培養細胞サンプルのリソソームpHを調整し、ピペットで混合する。ローテーター上で摂氏37度で30分間低速でインキュベートします。次に、老化関連β-ガラクトシダーゼを染色するために、洗浄せずにDDAOGストック溶液を1ミリリットルあたり10マイクログラムでサンプルに加えます。直射日光から保護されたローテーターに60分間置きます。前と同様に、チューブを遠心分離し、上清を除去し、PBS中の1ミリリットルの氷冷0.5%BSAでペレットを洗浄します。次に、300マイクロリットルの希釈カルセインバイオレット450 AM溶液を洗浄したセルペレットに加えます。暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。細胞サンプルをフローサイトメトリー機器対応チューブに移します。データ集録ソフトウェアで、紫チャンネルヒストグラムと遠赤チャンネル対緑チャンネルのドットプロットを開きます。低い吸気速度でサイトメーターのデータ取得を開始し、DDAOGで染色されたポジティブコントロールサンプルを吸気ポートに置きます。サンプルデータの取得を開始します。各プロット内に90%以上のイベントが含まれるようにチャンネル電圧を調整します。すべての設定が最適になったら、サンプルごとに10, 000イベントを記録します。DDAOGで染色された車両専用コントロールサンプルを吸気ポートに置きます。データ収集を開始し、サンプルあたり 10 、 000 イベントを記録します。自家蛍光(AF)およびDDAO-ガラクトシドシグナルの増加をポジティブコントロールと比較して探してください。サンプルデータをfcsファイル形式で保存し、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを備えたワークステーションコンピュータにエクスポートします。サイトメトリーデータ解析ソフトウェアを使用して、取得したすべてのサンプルのfcsデータファイルをロードします。まず、生細胞をゲートするには、車両専用コントロールのサンプルデータをダブルクリックして、そのデータウィンドウを開きます。データをバイオレット チャネル ヒストグラムとして視覚化します。CV 450によって染色された生細胞は、死細胞よりも明るい蛍光に基づいています。シングルゲートヒストグラムツールを使用してゲートを描画し、生細胞のみを含めます。ゲートに実行可能という名前を付けます。次に、Viable ゲートをサンプルレイアウトウィンドウから他のセルサンプルにドラッグして、ゲートを均一に適用します。[レイアウト] ウィンドウを開きます。レイアウトウィンドウで、すべてのサンプルをバイオレットチャンネルヒストグラムとして視覚化します。生細胞ゲーティングがサンプル間で適切であることを確認します。そうでない場合は、必要に応じて調整します。次に、老化細胞をゲートするには、車両専用コントロールのゲートされた生残細胞データをダブルクリックして、そのデータウィンドウを開きます。次に、遠赤チャネルと緑チャネルのドットプロットとしてデータを視覚化します。[矩形ゲーティング] ツールを使用してゲートを描画し、右上の象限から DDAO 陽性セルと AF 陽性セルを 5% 未満含めます。ゲートに「老化」という名前を付けます。次に、老化ゲートをサンプルレイアウトウィンドウからすべてのサンプルの実行可能なサブセットにドラッグして、ゲートを均一に適用します。レイアウトウィンドウに、すべての実行可能なセルゲートサブセットをドラッグアンドドロップします。すべての生存サンプルを遠赤対緑のチャネルドットプロットとして視覚化し、結果を観察します。老化ゲートがすべてのプロットに表示され、車両のみのコントロールのゲートが5%未満の老化セルを示すことを確認します。これで分析は完了です。データは、必要に応じてグラフ形式および表形式でエクスポートできるようになりました。エトポシドによって誘導された老化B16-F10メラノーマ細胞は、未処理細胞と比較して、老化関連β-ガラクトシダーゼの上昇によるX-galの切断により、形態の拡大と青色染色を示しました。エトポシド処理細胞を蛍光C12FDG(DDAOG)で染色したところ、X-galと同等の染色パターンと強度変動が示されました。しかし、緑色のC12FDG発光と重なる細胞自家蛍光は、染色されていない老化細胞に蓄積することが示された。対照的に、自家蛍光は、DDAOGの遠赤色発光範囲では典型的には無視できる程度であった。散布図用のフローサイトメーターデータ収集セットアップ、市販のレインボー蛍光キャリブレーションミクロスフェアの5ピーク、および染色細胞からのシングルチャンネル蛍光データを以下に示します。B16-F10メラノーマ細胞のDDADOGフローサイトメーター老化アッセイデータは、エトポシドによって誘導される治療誘発老化(TIS)が生細胞の35%で発生し、老化細胞除去剤ABT-263がTIS細胞をほぼ排除することを示しました。A549肺癌細胞では、生細胞の66%およびABT-263におけるブレオマイシン誘発TISの割合が15に減少した。ABT-263単独では、未処理の増殖細胞に対して毒性がなかった。抗体共染色アッセイでは、PEチャネルデータのヒストグラムは、エトポシド処理細胞の42%が老化マーカーDPPP4陽性に対して陽性であることを示しました。さらに、2次元ドットプロットによる可視化では、エトポシド処理細胞の44%がDDAOGとDPP4でダブルポジティブであったのに対し、ビヒクルのみの細胞では4%であることが示されました。次にDDAOG染色細胞の固定を評価した。固定されていない対照サンプルと比較して、固定サンプルは未処理細胞でわずかに高いバックグラウンドを示し、BLM処理細胞では老化としてスコアを付ける細胞の割合が高かった。この効果は、一晩、および摂氏4度で1週間保存された固定サンプルでも観察されました。フローサイトメトリーの分類および形態および増殖マーカーによる濃縮老化細胞集団の検証が示されている。選別された老化細胞は、予想通り拡大形態を示し、アクチンを蛍光ファロイジンで染色することによって視覚化した。増殖マーカーKi67のシグナルの減少も免疫蛍光染色によって観察された。最後に、化学療法薬で治療された腫瘍の老化の定量化が評価されました。組織におけるX-gal染色は比較的弱かったが、ドキソルビシンまたはペグ化リポソームドキソルビシンで治療された腫瘍、特にDDAO-ガラクトシドフローアッセイによって老化のスコアが陽性であった腫瘍では、青色染色が明らかであった。予想通り、生理食塩水のみの腫瘍はごくわずかな老化を示した。ここでは、他の生細胞アッセイと同様に、プロトコルステップは効率的かつ穏やかに実行する必要があります。長時間の染色手順、または言及された時間を超えるインキュベーションは避けてください。老化細胞をフローサイトメトリーでソーティングすると、イムノアッセイのために培養液に戻すか、溶解し、トランスクリプトミクスやプロテオミクスなどのオミクス解析のために処理することができます。この技術により、私たちの研究室や他の人々は、DNA損傷、タンパク質発現、代謝の変化の定量化など、老化腫瘍細胞の新しい特徴を特定することができました。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

低腫瘍含量組織における腫瘍濃縮のための自動解剖プロトコル

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...