Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81960180) ، ومؤسسة تراث زينكي ، ومؤسسة شارلوت وتيستو كيرستان ، ومركز يونان الطبي السريري لأمراض العيون (ZX2019-02-01). نشكر البروفيسور Longbao Lv (معهد علم الحيوان ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، كونمينغ ، الصين) لمشاركة مقل عيون القرد المستخدمة في هذه الدراسة.

تمت مراجعة الدراسة على الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات التابعة لمعهد علم الحيوان ، والأكاديمية الصينية للعلوم (IACUC-PE-2022-06-002) ، ومراجعة أخلاقيات الحيوان وبروتوكول الحيوان بجامعة يونان (YNU20220149).
1. تحضير نباتات الشبكية
<ol><li>احصل على مقل عيون ا?...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

يشير النقل الضوئي البصري إلى العملية البيولوجية التي يتم من خلالها تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية بواسطة خلايا مستقبلات ضوئية داخل شبكية العين. الخلايا المستقبلة للضوء هي خلايا عصبية مستقطبة قادرة على الانتقال الضوئي، وهناك نوعان مختلفان من المستقبلات الضوئية تسمى القضبان ...

يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي وينتج عن طفرات في مجموعة واسعة من الجينات المسببة للأمراض1. النتيجة النهائية ل RD هي فقدان البصر وفي الغالبية العظمى من الحالات لا يزال المرض غير قابل للعلاج حتى يومنا هذا. لذلك ، من المهم دراسة الآليات الخلوية التي تؤدي إلى موت المستقبلات الضوئية باستخدام نماذج تمثل بأمانة حالة المرض البشري. هنا ، تعتبر النماذج القائمة على الرئيسيات ذات أهمية خاصة بسبب قربها من البشر. والجدير بالذكر أن مثل هذه النماذج قد تعزز تطوير التدخلات العلاجية المناسبة التي يمكن أن توقف أو تؤخر موت الخلايا المستقبلة للضوء.
أظهرت الأبحاث السابقة حول آليات موت الخلايا في RD أن انخفاض أو فقدان نشاط فسفوديستراز 6 (PDE6) الناجم عن طفرات الجينات المسببة ل RD يؤدي إلى انخفاض التحلل المائي لأحادي فوسفات الغوانوزين الدوري (cGMP) 2,3. cGMP هو ناهض محدد للقنوات الأيونية ذات البوابات النوكليوتيدات الدورية (CNGCs) في الأجزاء الخارجية للقضيب (ROSs) وهو أيضا جزيء رئيسي مسؤول عن تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية في خلايا مستقبلات الضوءالفقارية 4. يؤدي التحلل المائي المنخفض cGMP إلى تراكم cGMP في ROSs ، مما يؤدي إلى فتح CNGCs 5. وبالتالي ، يتم تنشيط مسارات النقل الضوئي ، مما يؤدي إلى زيادة تركيزات الكاتيون في الخلايا المستقبلة للضوء. تفرض هذه العملية عبئا أيضيا على المستقبلات الضوئية ، والتي عند الإفراط في تنشيطها ، على سبيل المثال ، بسبب الطفرات في PDE6 ، قد تسبب موت الخلايا.
أظهرت العديد من الدراسات أن التراكم المفرط الكبير ل cGMP في المستقبلات الضوئية لنماذج الفئران ذات الطفرات الجينية RD المختلفة قد يتسبب في تنشيط بروتين كيناز المعتمد على cGMP (PKG) 3,6. هذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في الخلايا الميتة الإيجابية TUNEL وترقق تدريجي لطبقة الخلايا المستقبلة للضوء. تشير الدراسات السابقة إلى أن فرط نشاط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP هو شرط ضروري وكاف لتحريض موت الخلايا المستقبلة للضوء 2,5. أظهرت الدراسات التي أجريت على نماذج مختلفة من الفئران من RD أيضا أن تنشيط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP في المستقبلات الضوئية ، يؤدي إلى الإفراط في تنشيط المستجيبات النهائية مثل بوليميراز بوليميراز بولي ADP - ريبوز 1 (PARP1) ، هيستون ديسيتيلاز (HDAC) ، وكالبين2،7،8،9. وهذا يعني وجود ارتباطات سببية بين هذه البروتينات المستهدفة المختلفة وموت الخلايا المستقبلة للضوء.
ومع ذلك ، استندت الأبحاث السابقة حول علم الأمراض وعلم السموم والعلاج من RD بشكل أساسي على نماذج الفئران ل RD10،11،12. ومع ذلك ، لا تزال هناك صعوبات هائلة في الترجمة السريرية لهذه النتائج. ويرجع ذلك إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية الكبيرة بين الفئران والبشر ، خاصة فيما يتعلق ببنية الشبكية. في المقابل ، تشترك الرئيسيات غير البشرية (NHPs) أيضا في درجة عالية من التشابه مع البشر فيما يتعلق بالخصائص الوراثية والأنماط الفسيولوجية وتنظيم العوامل البيئية. على سبيل المثال ، تم التحقيق في العلاج البصري الوراثي كوسيلة لاستعادة نشاط الشبكية في نموذج NHP13. أظهر لينغام وزملاؤه أن خلايا سلائف مستقبلات الشبكية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات على مستوى ممارسات التصنيع الجيدة قد تنقذ تلف مستقبلات الضوء المخروطية في NHP14. لذلك ، تعد نماذج NHP مهمة لاستكشاف التسبب في RD وتطوير طرق علاج فعالة. على وجه الخصوص ، يمكن أن تلعب نماذج NHP من RD ، التي تظهر آليات مسببة للأمراض مماثلة لتلك الموجودة في البشر ، دورا حاسما في الدراسات المتعلقة بتطوير وتحليل علم الأدوية السمية في الجسم الحي للعقاقير الجديدة.
نظرا لدورة الحياة الطويلة ، والمستوى العالي من الصعوبات التقنية ، والتكلفة العالية التي ينطوي عليها إنشاء نماذج الرئيسيات في الجسم الحي ، أنشأنا نموذجا للرئيسيات غير البشرية في المختبر (NHP) باستخدام مزارع شبكية المكاك المزروعة. أولا ، تم اختيار المكاك من النوع البري الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية ، والتي تضمنت مجمع شبكية العين RPE-choroid. ثم تمت معالجة النباتات الخارجية بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast (100 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر ، و 400 ميكرومتر) للحث على مسار إشارات cGMP-PKG. تم تحديد موت الخلايا المستقبلة للضوء وتحليلها باستخدام مقايسة TUNEL ، وتم التحقق من تراكم cGMP في النباتات الخارجية عن طريق التألق المناعي. نظرا لدرجة التشابه العالية فيما يتعلق بتوزيع الخلايا ومورفولوجيتها ، وسمك طبقة الشبكية ، والخصائص الفسيولوجية الأخرى لشبكية العين بين القرود والبشر ، فإن إنشاء مسار إشارات cGMP-PKG في نموذج الشبكية في المختبر قد يسهل البحث المستقبلي حول التسبب في RD وكذلك الدراسات في تطوير وعلم الأدوية السمية للعقاقير الجديدة لعلاج RD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي. يؤدي الإفراط في تنشيط مسار بروتين كيناز (PKG) المعتمد على الغوانوزين الدوري (cGMP) في الخلايا المستقبلة للضوء إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء ، خاصة في النماذج التي تؤوي طفرات فوسفوديستراز 6b (PDE6b). استخدمت الدراسات السابقة على RD بشكل أساسي نماذج الفئران مثل الفئران rd1 أو rd10 . بالنظر إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية بين الفئران والبشر ، من المهم أن نفهم إلى أي مدى يمكن مقارنة شبكية العين من الرئيسيات والقوارض. تشترك المكاك في مستوى عال من التشابه الجيني مع البشر. لذلك ، تم اختيار المكاك من النوع البري (الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات) للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية التي تضمنت مركب ظهارة الشبكية والشبكية (RPE) - المشيمية. تمت معالجة هذه النباتات بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast للحث على مسار إشارات cGMP-PKG ومحاكاة التسبب في RD. تم التحقق لاحقا من تراكم cGMP وموت الخلايا في نباتات شبكية الرئيسيات باستخدام التألق المناعي ومقايسة TUNEL. قد يعمل نموذج شبكية العين الرئيسيات الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة على الدراسات ذات الصلة والفعالة في آليات RD المعتمدة على cGMP-PKG ، وكذلك لتطوير مناهج العلاج المستقبلية.

في هذه الدراسة ، تم إجراء زراعة شبكية المكاك باستخدام نباتات تحتوي على مركب شبكية العين RPE-choroid (الشكل 1 ، الشكل التكميلي S1). بالمقارنة مع الثقافة المختبرية لخلايا الشبكية التي تستخدم شبكية العين بدون RPE المرفقة والمشيمية ، فإن ثقافتنا المزروعة تسهل بقاء الخلا?...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

تم استزراع نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من المكاك البرية في المختبر. تم تحفيز تنكس الشبكية ومسار إشارات cGMP-PKG باستخدام مثبط PDE6 zaprinast. تم التحقق من تراكم cGMP في النباتات بتركيزات مختلفة من zaprinast باستخدام التألق المناعي.

مزارع زراعة الشبكية ذات النمط العضوي من المكاك

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

نموذج الشبكية الرئيسيات الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة نقدم التحقيق في الآلية الشاملة والتطوير العلاجي لتدهور الشبكية المعتمد على cGMP-PKG. يحتفظ نموذج الرئيسيات غير البشري الفردي هذا بتأكيد أنسجة الشبكية والتفاعلات بين الخلايا مما يتيح محاكاة أفضل للظروف في الجسم الحي. كما أنه يقلل من استخدام الحيوانات ويقصر المدة التجريبية.توفير نهج تجريبي للتحكم في تطور الشبكية أو تنكسها. البدء في إعداد نباتات الشبكية عن طريق غسل مقل العيون المعزولة من المكاك البرية مع 10 ملليلتر من 5 ٪ بوفيدون اليود لمدة 30 ثانية. لتجنب التلوث البكتيري ، اغمس مقل العيون في محلول 5٪ من البنسلين ستربتومايسين PBS لمدة دقيقة واحدة قبل الحضانة في 10 ملليلتر من R16 المتوسط لمدة خمس دقائق.ثم اغمر مقل العيون في 10 ملليلتر من محلول البروتين Ace-K المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية وحضنه لمدة دقيقتين. قم بإجراء الحضانة التالية في 10 ملليلتر من واحد إلى واحد R16 بالإضافة إلى محلول مصل بقري الجنين لمدة خمس دقائق. أعط غسلا نهائيا في 10 ملليلتر من R16 الطازج.بمجرد الانتهاء من ذلك ، افصل الصلبة والقرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي. ثم قطع شبكية العين من أربعة جوانب مع ملاقط ومقص. بعد ذلك ، استخدم شفرة شجرة دقيقة سعة أربعة ملليلتر لقطع نبات الشبكية عند 1.5 ملم من الجانب الأنفي ، وأربعة ملليمترات من الجانب الصدغي واثنين ملليمتر من الجانبين العلوي والسفلي لرأس العصب البصري.ثم باستخدام شفرة دقيقة لشجرة ستة ملليمترات ، قطعت الجانب المركزي من نبات الشبكية الذي يحتوي على القرص البصري والبقعة. باستخدام ماصة عريضة ، اسحب الشبكية التي تحتوي على شبكية العين والمشيمية وضعها في منتصف الحشوة مع وضع جانب مستقبلات الضوء لأعلى. اغمر شبكية العين بالكامل في ملليلتر واحد من الوسط الكامل على اللوحة أسفل الغشاء.قم بزراعة نباتات الشبكية وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب. إعطاء العلاج المناسب لتركيز الدواء للنباتات لمدة أربعة أيام. استخدم ما لا يقل عن ثلاثة نباتات لكل حالة علاجية واستخدم النباتات بدون الدواء كعنصر تحكم إيجابي.للتثبيت والتقسيم بالتبريد ، عالج نباتات الشبكية بمليلتر واحد من الألدهيد البارفورم لمدة 45 دقيقة. بعد شطف قصير مع ملليلتر واحد من PBS احتضان متسلسل النباتات في 10 ٪ السكروز لمدة 10 دقائق ، 20 ٪ السكروز لمدة 20 دقيقة ، و 30 ٪ السكروز لمدة 30 دقيقة. قطع نباتات الشبكية بشكل موحد مع أربعة أرباع في المحيط وستة ملليمترات في المركز.ثم انقل نباتات الشبكية إلى صندوق من الصفيح يبلغ حوالي 1.5 × 1.5 × 1.5 سم مع وسيط تضمين مركب درجة حرارة القطع الأمثل الذي يغطي الزرع. على الفور ، قم بتجميد أقسام الأنسجة في النيتروجين السائل ووضعها في ثلاجة 20 درجة للتخزين. بعد ذلك ، قم بقص الآجار إلى كتلة صغيرة تحتوي على عينة الأنسجة.قسم الكتل إلى كتل 10 ميكرومتر وضع الأقسام على شرائح مجهر الالتصاق باستخدام فرشاة ناعمة. ثم جفف المقاطع لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية وقم بتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. بالنسبة لتلطيخ أحادي فوسفات الغوانوزين الدوري أو cGMP ، ارسم حلقة كارهة للماء حول أقسام الشبكية المجففة باستخدام قلم مانع للسائل وقم بتغطية العينات.اغمر الشرائح في 200 ميكرولتر من 0.3٪ PBS و Triton-X100 أو PBST لمدة 10 دقائق متبوعا بمعالجة لمدة ساعة واحدة في 200 ميكرولتر من محلول الحجب في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن شريحة العينة طوال الليل باستخدام 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المحضر في محلول الحجب عند أربع درجات مئوية وشطفه ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. احتضان الشريحة في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.بعد ثلاث غسلات من PBS لمدة 10 دقائق ، قم بتغطية العينات بوسط تركيب مضاد للتلاشي يحتوي على DAPI وتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير. جفف الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وارسم حلقة حاجز طاردة للماء حول عينة أنسجة الشبكية باستخدام قلم مانع للسائل. بعد الحضانة مع 40 ملليلتر من PBS لمدة 15 دقيقة ، عالج الأقسام ب 42 ملليلتر من 0.05 مولي tris-buffer أو TBS عند 37 درجة مئوية.نضح TBS ، واحتضان العينات بستة ميكرولتر من البروتيناز K لمدة خمس دقائق وغسل الشرائح ثلاث مرات مع PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما. تعريض الشرائح إلى 40 ملليلتر من محلول حمض الخليك الإيثانول في شابلن. قم بتغطيتها بورقة شفافة واحتضانها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة خمس دقائق.اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بتعريض الشرائح إلى 200 إلى 300 ميكرولتر من محلول الحجب أو 1٪ BSA واحتضانها في غرفة الرطوبة لمدة ساعة واحدة. عند حوالي 130 ميكرولتر من محلول TMR الأحمر لكل شريحة وبعد ساعة واحدة ، أعط غسلتين من 200 ميكرولتر من PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما.ضع شرائح الغطاء التي تحتوي على قطرة أو قطرتين من وسط التثبيت المضاد للتلاشي مع DAPI فوق العينات واحتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير. بعد تلطيخ متسلسل مع النفق و cGMP المضي قدما في المجهر الضوء والتألق عن طريق ضبط معلمات الكاميرا. التقط صورا لأربعة حقول من كل قسم باستخدام البرنامج بكاميرا رقمية بتكبير 20x.احصل على صور تمثيلية من المناطق المركزية لشبكية العين باستخدام DAPI و EGFP و TMR مع مسح z-stack وفاصل زمني قدره ميكرومتر واحد واختياري عند 1.251 ميكرومتر. في نباتات الشبكية المعالجة بتركيزات مختلفة من مثبطات PDE6 Zaprinast ، زاد عدد الخلايا الإيجابية النفقية و cGMP بقوة في الطبقة النووية الخارجية مقارنة بالمجموعة الضابطة. تشير النسبة العالية من الخلايا الإيجابية النفقية إلى أن الزيادة في نشاط cGMP قد تعزز تنكس خلايا الشبكية الناجم عن العش قبل العش ويلعب تراكم cGMP دورا في تنكس المستقبلات الضوئية.يجب أن يتم إعداد Explant في أقرب وقت ممكن. Op الحيوانات مبعثر الخمسات وأي تراكم لأنه يحسن بقاء الخلية ويعزز حالة الألياف من سلسلة المكدس السائب. إلى أقصى حد مرئي يجب تنظيف الجسم الزجاجي بالمنشطات.تجنب ملامسة طبقات الألياف العصبية في شبكية العين عند نقل نباتات الشبكية لمنع إصابة الخلايا الميكانيكية. يرجى ملاحظة أنه لإصدار نقل سلس لنباتات الشبكية إلى حشوات الثقافة ، يمكن نقع الحيوان الأليف مسبقا في شيء لإبقائه رطبا قبل نقل أنسجة الشبكية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنفيذ العملية برمتها في جو الستيرويد لتجنب التلوث أثناء العملية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

يزدرع الثقافات العصبية من<em&gt; القيطم المورق</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

التحقيق التجديد الوظيفي في الحبل الشوكي عضوي النمط المشارك الثقافات نمت على صفائف متعدد القطب

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...