Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), Zinke Heritage Foundation og Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Vi takker professor Longbao Lv (Institut for Zoologi, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Kina) for at dele de abeøjeæbler, der blev brugt i denne undersøgelse.

Dyreforsøget blev gennemgået og godkendt af Ethics Review Committee of Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002) og dyreetisk gennemgang og dyreprotokol fra Yunnan University (YNU20220149).
1. Fremstilling af retinale eksplanter
<ol><li>Få primatøjekugler fra vildtype makaker i alderen 1 til 3 år, opbevares i vævsopbevaringsopløsning og transporteres på is inden for 3 timer efter enukleation, efter at aberne blev ofret eller efter natur...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

Visuel fototransduktion refererer til den biologiske proces, hvorved lyssignaler omdannes til elektriske signaler af fotoreceptorceller i øjets nethinden. Fotoreceptorceller er polariserede neuroner, der er i stand til fototransduktion, og der er to forskellige typer fotoreceptorer kaldet stænger og kegler efter formerne på deres ydre segmenter. Stænger er ansvarlige for det skotopiske syn, og kegler er ansvarlige for fotopisk og høj skarphedssyn. Arvelig RD vedrører neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved pr...

Arvelig retinal degeneration (RD) er karakteriseret ved progressiv fotoreceptorcelledød og er forårsaget af mutationer i en lang række patogene gener1. Slutresultatet af RD er synstab, og i langt de fleste tilfælde forbliver sygdommen uhelbredelig den dag i dag. Derfor er det vigtigt at studere de cellulære mekanismer, der fører til fotoreceptordød ved hjælp af modeller, der trofast repræsenterer den menneskelige sygdomstilstand. Her er primatbaserede modeller af særlig interesse på grund af deres nærhed til mennesker. Sådanne modeller kan især fremme udviklingen af passende terapeutiske indgreb, der kan standse eller forsinke fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning i mekanismerne for celledød i RD har vist, at faldet eller tabet af phosphodiesterase 6 (PDE6) aktivitet forårsaget af RD-udløsende genmutationer fører til reduceret hydrolyse af cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP)2,3. cGMP er en specifik agonist af de cykliske nukleotid-gated ionkanaler (CNGC'er) i stangens ydre segmenter (ROS'er) og er også et nøglemolekyle, der er ansvarlig for omdannelsen af lyssignaler til elektriske signaler i hvirveldyrs fotoreceptorceller4. Reduceret cGMP-hydrolyse forårsager akkumulering af cGMP i ROS'er, hvilket fører til åbning af CNGC'er 5. Følgelig aktiveres fototransduktionsvejene, hvilket resulterer i en stigning i kationkoncentrationer i fotoreceptorceller. Denne proces pålægger fotoreceptorer en metabolisk byrde, som, når de overaktiveres, for eksempel af mutationer i PDE6, kan forårsage celledød.
Mange undersøgelser har vist, at en signifikant overakkumulering af cGMP i fotoreceptorer i musemodeller med forskellige RD-genmutationer kan forårsage aktivering af cGMP-afhængig proteinkinase (PKG)3,6. Dette fører til en betydelig stigning i døende, TUNEL-positive celler og en gradvis udtynding af fotoreceptorcellelaget. Tidligere undersøgelser tyder på, at PKG-overaktivering forårsaget af forhøjede cGMP-niveauer er en nødvendig og tilstrækkelig betingelse for induktion af fotoreceptorcelledød 2,5. Undersøgelser af forskellige musemodeller af RD har også vist, at PKG-aktivering induceret af forhøjede cGMP-niveauer i fotoreceptorer fører til overaktivering af downstream-effektorer såsom poly-ADP-ribosepolymerase 1 (PARP1), histon-deacetylase (HDAC) og calpain 2,7,8,9. Dette indebærer årsagssammenhænge mellem disse forskellige målproteiner og fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning i patologi, toksikofarmakologi og terapi af RD var imidlertid hovedsageligt baseret på musemodeller for RD10,11,12. Ikke desto mindre er der stadig enorme vanskeligheder med den kliniske oversættelse af disse resultater. Dette skyldes de betydelige genetiske og fysiologiske forskelle mellem mus og mennesker, især med hensyn til nethindestrukturen. I modsætning hertil deler ikke-menneskelige primater (NHP'er) også en høj grad af lighed med mennesker med hensyn til genetiske egenskaber, fysiologiske mønstre og miljøfaktorregulering. For eksempel blev optogenetisk terapi undersøgt som et middel til at genoprette retinal aktivitet i en NHP model13. Lingam og kolleger demonstrerede, at god fremstillingspraksis-grade human-induceret pluripotent stamcelle-afledte retinale fotoreceptor precursor celler kan redde keglefotoreceptorskader i NHP14. Derfor er NHP-modeller vigtige for udforskningen af RD-patogenese og udviklingen af effektive behandlingsmetoder. Især NHP-modeller af RD, der udviser patogene mekanismer svarende til dem hos mennesker, kunne spille en kritisk rolle i undersøgelser af udviklingen og in vivo toksikofarmakologisk analyse af nye lægemidler.
I betragtning af den lange livscyklus, det høje niveau af tekniske vanskeligheder og de høje omkostninger, der er forbundet med at etablere in vivo-primatmodeller, etablerede vi en in vitro non-human primat (NHP) model ved hjælp af kulturer af udplantet makaknethinden. For det første blev vildtype makaker i alderen 1-3 år udvalgt til in vitro-kultur af retinale eksplanter, som omfattede retina-RPE-choroid-komplekset. Explants blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM) for at inducere cGMP-PKG-signalvejen. Fotoreceptorcelledød blev kvantificeret og analyseret ved hjælp af TUNEL-assayet, og cGMP-akkumulering i eksplantater blev verificeret via immunofluorescens. I betragtning af den høje grad af lighed med hensyn til cellefordeling og morfologi, retinal lagtykkelse og andre fysiologiske egenskaber ved nethinden mellem aber og mennesker kan etableringen af cGMP-PKG-signalvejen i in vitro retinalmodellen lette fremtidig forskning i patogenesen af RD samt undersøgelser af udvikling og toksikofarmakologi af nye lægemidler til RD-behandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

Arvelig retinal degeneration (RD) er karakteriseret ved progressiv fotoreceptorcelledød. Overaktivering af den cykliske guanosinmonophosphat (cGMP)-afhængige proteinkinase (PKG) vej i fotoreceptorceller forårsager fotoreceptorcelledød, især i modeller, der huser phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutationer. Tidligere undersøgelser af RD har hovedsageligt brugt murine modeller såsom rd1 eller rd10 mus. I betragtning af de genetiske og fysiologiske forskelle mellem mus og mennesker er det vigtigt at forstå, i hvilket omfang nethinden hos primater og gnavere er sammenlignelige. Makaker deler et højt niveau af genetisk lighed med mennesker. Derfor blev vildtypemakaker (i alderen 1-3 år) udvalgt til in vitro-kulturen af retinale eksplanter, der omfattede retina-retinal pigmentepitel (RPE)-choroidkomplekset. Disse eksplantater blev behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast for at inducere cGMP-PKG-signalvejen og simulere RD-patogenese. cGMP-akkumulering og celledød i primater retinale eksplantater blev efterfølgende verificeret ved hjælp af immunofluorescens og TUNEL-assayet. Den primat-retinale model, der er etableret i denne undersøgelse, kan tjene til relevante og effektive undersøgelser af mekanismerne bag cGMP-PKG-afhængig RD samt til udvikling af fremtidige behandlingsmetoder.

I denne undersøgelse blev Macaque monkey retinal explant-kultur udført ved hjælp af explants indeholdende retina-RPE-choroid-komplekset (figur 1, supplerende figur S1). Sammenlignet med in vitro-kulturen af retinale celler ved hjælp af nethinden uden den vedhæftede RPE og choroid, letter vores eksplantatkultur bedre celleoverlevelse og forlænger følgelig fotoreceptorcellernes overlevelse.
Vi brugte forskellige koncentrationer af PD...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Retinale eksplanter opnået fra vildtype makaker blev dyrket in vitro. Retinal degeneration og cGMP-PKG-signalvejen blev induceret under anvendelse af PDE6-hæmmeren zaprinast. cGMP-akkumulering i eksplantaterne ved forskellige zaprinastkoncentrationer blev verificeret ved anvendelse af immunfluorescens.

Organotypiske retinale eksplantatkulturer fra Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Den primate retinale model, der er etableret i denne undersøgelse, tilbyder vi undersøgelsen af den omfattende mekanisme og den terapeutiske udvikling af cGMP-PKG-afhængig retinal forringelse. Denne individuelle ikke-menneskelige primatmodel reserverer retinal vævsbekræftelse og intercellulære interaktioner, hvilket muliggør bedre simulering af in vivo-forhold. Det reducerer også brugen af dyr, og det forkorter forsøgsvarigheden.Tilvejebringelse af en kontroleksperimentel tilgang til undersøgelse af retinal udvikling eller degeneration. Begynd forberedelsen af retinale eksplanter ved at vaske øjenkuglerne isoleret fra vilde macaques med 10 ml 5% povidon jod i 30 sekunder. For at undgå bakteriel kontaminering dyppes øjenkuglerne i en 5% penicillin streptomycin PBS-opløsning i et minut før inkubation i 10 ml R16-medium i fem minutter.Derefter nedsænkes øjenkuglerne i 10 ml protein Ace-K-opløsning, der er forvarmet til 37 grader Celsius og inkuberes i to minutter. Udfør næste inkubation i 10 ml af en til en R16 plus føtal bovin serumopløsning i fem minutter. Giv en endelig vask i 10 ml frisk R16.Når du er færdig, adskilles sclera, hornhinde, iris, linse og glaslegeme. Skær derefter nethinden fra fire sider med pincet og saks. Brug derefter et fint blad på fire milliliter træ til at skære retinal eksplant på en 1,5 millimeter fra næsesiden, fire millimeter fra den tidlige side og en to millimeter fra de overlegne og ringere sider af synsnervehovedet.Brug derefter et seks millimeter træ fint blad til at skære den centrale side af retinal eksplantat indeholdende optisk skive og makula. Brug en bred pipette til at trække nethinden, der indeholder nethinden og choroiden, og placere den midt i indsatsen med fotoreceptorsiden opad. Nedsænk nethinden helt i en milliliter af det komplette medium på pladen under membranen.Dyrk retinale eksplanter og placer dem i en 37 grader Celsius inkubator med befugtet 5% kuldioxid. Giv den passende lægemiddelkoncentrationsbehandling til eksplanter i fire dage. Brug mindst tre explants pr. Behandlingsbetingelse og brug explants uden lægemidlet som en positiv kontrol.Til fastgørelse og kryo-sektionering behandles retinale eksplanter med en milliliter paraformaldehyd i 45 minutter. Efter en kort skylning med en milliliter PBS inkuberes eksplantaterne serielt i 10% saccharose i 10 minutter, 20% saccharose i 20 minutter og 30% saccharose i 30 minutter. Skær retinale eksplanter ensartet med fire kvadranter i periferien og seks millimeter i midten.Overfør derefter retinale eksplanter til en tinkasse på ca. 1,5 x 1,5 x 1,5 centimeter med en optimal skæretemperaturforbindelse, der indlejrer medium, der dækker eksplantatet. Frys straks vævssektionerne i flydende nitrogen og læg dem i et 20 graders køleskab til opbevaring. Trim derefter agaren i en lille blok, der indeholder vævsprøven.Skær blokkene i 10 mikrometer blokke og placer sektionerne på vedhæftningsmikroskopglas ved hjælp af en blød børste. Tør derefter sektionerne i 45 minutter ved 40 grader Celsius og opbevar dem ved minus 80 grader Celsius indtil brug. Til cyklisk guanosinmonophosphat eller cGMP-farvning tegnes en hydrofob ring omkring de tørrede retinale sektioner med en væskeblokkerpen og dækker prøverne.Dyp diasene i 200 mikroliter 0,3% PBS og Triton-X100 eller PBST i 10 minutter efterfulgt af en times behandling i 200 mikroliter blokerende opløsning ved stuetemperatur. Derefter inkuberes prøveobjektglasset natten over med de 200 mikroliter primært antistof, der er fremstillet i blokeringsopløsningen ved fire grader Celsius, og skylles tre gange med PBS i 10 minutter. Inkuber diaset i 200 mikroliter sekundært antistof i en time ved stuetemperatur.Efter tre vaske PBS i 10 minutter dækkes prøverne med et antifade monteringsmedium indeholdende DAPI og opbevares ved fire grader Celsius i mindst 30 minutter før billeddannelse. Tør objektglasset ved stuetemperatur i 15 minutter, og tegn en vandafvisende barrierering rundt om nethindevævsprøven med en væskeblokkerpen. Efter inkubation med 40 ml PBS i 15 minutter behandles sektionerne med 42 ml 0,05 molær trisbuffer eller TBS ved 37 grader Celsius.Opsug TBS, inkuber prøverne med seks mikroliter proteinase K i fem minutter og vask dias tre gange med PBS i fem minutter hver. Udsæt diasene for 40 ml ethanoleddikesyreopløsning i chaplin. Dæk det med et gennemsigtigt ark og inkuber ved minus 20 grader Celsius i fem minutter.Vask diasene tre gange med TBS i fem minutter hver gang. Udsæt diasene for 200 til 300 mikroliter blokeringsopløsning eller 1% BSA og inkuber dem i et fugtighedskammer i en time. Ved ca. 130 mikroliter TMR rød opløsning pr. dias og efter en time gives to vaske på 200 mikroliter PBS i fem minutter hver.Placer dækglas indeholdende en til to dråber antifade monteringsmedium med DAPI over prøverne, og inkuber diasene ved fire grader Celsius i mindst 30 minutter før billeddannelse. Efter sekventiel farvning med tunnel og cGMP fortsæt til lys- og fluorescensmikroskopi ved at justere kameraparametrene. Tag billederne af fire felter fra hvert afsnit ved hjælp af softwaren med et digitalt kamera ved 20x forstørrelse.Få repræsentative billeder fra de centrale områder af nethinden ved hjælp af DAPI, EGFP og TMR med z-stack-scanning og et interval på en mikrometer og valgfrit ved 1.251 mikrometer. I retinale eksplantater behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmerne Zaprinast var antallet af tunnel- og cGMP-positive celler stærkt øget i det ydre nukleare lag sammenlignet med kontrolgruppen. Den høje andel af tunnelpositive celler antydede, at stigningen i cGMP-aktivitet kan forbedre den pre nest-inducerede retinale celledegeneration, og cGMP-akkumulering spiller en rolle i fotoreceptordegeneration.Explant forberedelse skal udføres så hurtigt som muligt. Op animal scatter fives og enhver ophobning, fordi det forbedrer celleoverlevelsen og forbedrer status for fiber i bulk stack serier. I videst muligt omfang bør glaslegemet rengøres med steroider.Undgå at kontakte retinale nervefiberlag, når du overfører retinale eksplanter for at forhindre mekanisk celleskade. Vær opmærksom på, at for at udstede en jævn overførsel af retinale eksplanter til kulturindsatser kan kæledyret gennemblødes i noget for at holde det fugtigt, før det overføres nethindevæv. Derudover skal hele processen udføres i steroidatmosfæren for at undgå forurening under processen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neurale eksplantatkulturer fra<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypiske skivekulturer at studere oligodendrocyt Dynamics og myelinering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Undersøgelse Funktionel Regenerering i Organotypiske Spinal Cord Co-kulturer dyrket på Multi-elektrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...