Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
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Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81960180), de la Fondation du patrimoine Zinke et de la Fondation Charlotte et Tistou Kerstan, Centre médical clinique de la maladie oculaire du Yunnan (ZX2019-02-01). Nous remercions le professeur Longbao Lv (Institut de zoologie, Académie chinoise des sciences, Kunming, Chine) d’avoir partagé les globes oculaires de singe utilisés dans cette étude.

L’étude sur les animaux a été examinée et approuvée par le Comité d’examen éthique de l’Institut de zoologie de l’Académie chinoise des sciences (IACUC-PE-2022-06-002), ainsi que par l’examen de l’éthique animale et le protocole animal de l’Université du Yunnan (YNU20220149).
1. Préparation des explants rétiniens
<ol><li>Obtenir des globes oculaires de primates de macaques de type sauvage, âgés de 1 à 3 ans, stocker dans une solution de stockage ...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

La phototransduction visuelle fait référence au processus biologique par lequel les signaux lumineux sont convertis en signaux électriques par les cellules photoréceptrices dans la rétine de l’œil. Les cellules photoréceptrices sont des neurones polarisés capables de phototransduction, et il existe deux types différents de photorécepteurs appelés bâtonnets et cônes d’après les formes de leurs segments externes. Les bâtonnets sont responsables de la vision scotopique et les cônes sont responsables de l...

La dégénérescence rétinienne héréditaire (DR) est caractérisée par la mort progressive des cellules photoréceptrices et est causée par des mutations dans une grande variété de gènes pathogènes1. Le résultat final de la RD est la perte de vision et dans la grande majorité des cas, la maladie reste incurable à ce jour. Par conséquent, il est important d’étudier les mécanismes cellulaires conduisant à la mort des photorécepteurs en utilisant des modèles qui représentent fidèlement l’état pathologique humain. Ici, les modèles à base de primates sont particulièrement intéressants en raison de leur proximité avec les humains. Notamment, de tels modèles peuvent faire progresser le développement d’interventions thérapeutiques appropriées qui peuvent arrêter ou retarder la mort des cellules photoréceptrices.
Des recherches antérieures sur les mécanismes de la mort cellulaire dans la RD ont démontré que la diminution ou la perte de l’activité de la phosphodiestérase 6 (PDE6) causée par des mutations génétiques déclenchant la RD entraîne une hydrolyse réduite de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc)2,3. cGMP est un agoniste spécifique des canaux ioniques cycliques dépendants des nucléotides (CNGC) dans les segments externes des bâtonnets (ROS) et est également une molécule clé responsable de la conversion des signaux lumineux en signaux électriques dans les cellules photoréceptrices des vertébrés4. L’hydrolyse réduite des GMPc provoque l’accumulation de GMPc dans les ROM, conduisant à l’ouverture des CGNCc 5. Par conséquent, les voies de phototransduction sont activées, ce qui entraîne une augmentation des concentrations de cations dans les cellules photoréceptrices. Ce processus impose une charge métabolique aux photorécepteurs qui, lorsqu’ils sont suractivés, par exemple par des mutations de la PDE6, peuvent provoquer la mort cellulaire.
De nombreuses études ont montré qu’une suraccumulation significative de GMPc dans les photorécepteurs de modèles murins présentant différentes mutations du gène RD peut provoquer l’activation de la protéine kinase dépendante du GMPc (PKG)3,6. Cela conduit à une augmentation substantielle des cellules TUNEL-positives mourantes et à un amincissement progressif de la couche de cellules photoréceptrices. Des études antérieures suggèrent que la suractivation de la PKG causée par des taux élevés de BPFc est une condition nécessaire et suffisante pour l’induction de la mort cellulaire photoréceptrice 2,5. Des études sur différents modèles murins de DR ont également montré que l’activation de la PKG induite par des niveaux élevés de GMPc dans les photorécepteurs entraîne une suractivation des effecteurs en aval tels que la poly-ADP-ribose polymérase 1 (PARP1), l’histone désacétylase (HDAC) et lacalpaïne 2,7,8,9. Cela implique des associations causales entre ces différentes protéines cibles et la mort cellulaire photoréceptrice.
Cependant, les recherches antérieures sur la pathologie, la toxicopharmacologie et la thérapie de la DR étaient principalement basées sur des modèles murins pour DR10,11,12. Néanmoins, d’immenses difficultés subsistent dans la traduction clinique de ces résultats. Cela est dû aux différences génétiques et physiologiques considérables entre les souris et les humains, en particulier en ce qui concerne la structure rétinienne. En revanche, les primates non humains (PNH) partagent également un degré élevé de similitude avec les humains en ce qui concerne les caractéristiques génétiques, les schémas physiologiques et la régulation des facteurs environnementaux. Par exemple, la thérapie optogénétique a été étudiée comme moyen de restaurer l’activité rétinienne dans un modèle de PSN13. Lingam et ses collègues ont démontré que les cellules précurseurs photorétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et de qualité professionnelle peuvent sauver les dommages causés par les photorécepteurs coniques dans le NHP14. Par conséquent, les modèles de PSN sont importants pour l’exploration de la pathogenèse DR et la mise au point de méthodes de traitement efficaces. En particulier, les modèles de DR des PSN, présentant des mécanismes pathogènes semblables à ceux des humains, pourraient jouer un rôle essentiel dans les études sur le développement et l’analyse toxicopharmacologique in vivo de nouveaux médicaments.
Compte tenu du long cycle de vie, du niveau élevé de difficultés techniques et du coût élevé de l’établissement de modèles de primates in vivo, nous avons établi un modèle in vitro de primates non humains (PNH) en utilisant des cultures de rétine de macaque explanté. Tout d’abord, des macaques de type sauvage âgés de 1 à 3 ans ont été sélectionnés pour la culture in vitro d’explants rétiniens, qui comprenaient le complexe rétine-RPE-choroïde. Les explants ont ensuite été traités avec différentes concentrations de zaprinaste, inhibiteur de la PDE6 (100 μM, 200 μM et 400 μM) pour induire la voie de signalisation cGMP-PKG. La mort cellulaire des photorécepteurs a été quantifiée et analysée à l’aide du test TUNEL, et l’accumulation de BPF dans les explants a été vérifiée par immunofluorescence. Compte tenu du degré élevé de similitude en ce qui concerne la distribution cellulaire et la morphologie, l’épaisseur de la couche rétinienne et d’autres caractéristiques physiologiques de la rétine entre les singes et les humains, l’établissement de la voie de signalisation cGMP-PKG dans le modèle rétinien in vitro pourrait faciliter les recherches futures sur la pathogenèse de la DR ainsi que les études sur le développement et la toxicopharmacologie de nouveaux médicaments pour le traitement de la DR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

La dégénérescence rétinienne héréditaire (DR) est caractérisée par la mort progressive des cellules photoréceptrices. La suractivation de la voie cyclique de la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate (GMPc) dans les cellules photoréceptrices provoque la mort des cellules photoréceptrices, en particulier chez les modèles porteurs de mutations de la phosphodiestérase 6b (PDE6b). Des études antérieures sur la DR ont utilisé principalement des modèles murins tels que les souris rd1 ou rd10. Compte tenu des différences génétiques et physiologiques entre les souris et les humains, il est important de comprendre dans quelle mesure les rétines des primates et des rongeurs sont comparables. Les macaques partagent un haut niveau de similitude génétique avec les humains. Par conséquent, des macaques de type sauvage (âgés de 1 à 3 ans) ont été sélectionnés pour la culture in vitro d’explants rétiniens comprenant le complexe épithélium pigmentaire rétinien-rétinien-choroïde. Ces explants ont été traités avec différentes concentrations de zaprinaste, inhibiteur de la PDE6, pour induire la voie de signalisation cGMP-PKG et simuler la pathogenèse de la RD. L’accumulation de GMPc et la mort cellulaire dans les explants rétiniens de primates ont ensuite été vérifiées à l’aide de l’immunofluorescence et du test TUNEL. Le modèle rétinien des primates établi dans cette étude peut servir à des études pertinentes et efficaces sur les mécanismes de la DR dépendante des GMPc-PKG, ainsi qu’au développement d’approches thérapeutiques futures.

Dans cette étude, une culture d’explant rétinienne de singe macaque a été réalisée à l’aide d’explants contenant le complexe rétine-EPR-choroïde (Figure 1, Figure supplémentaire S1). Par rapport à la culture in vitro de cellules rétiniennes utilisant la rétine sans l’EPR et la choroïde attachés, notre culture d’explantation facilite une meilleure survie cellulaire et, par conséquent, prolonge la survie des cellules photoréceptrices.
<p...

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Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Des explants rétiniens obtenus à partir de macaques de type sauvage ont été cultivés in vitro. La dégénérescence rétinienne et la voie de signalisation cGMP-PKG ont été induites à l’aide de l’inhibiteur de la PDE6 zaprinast. L’accumulation de GMPc dans les explants à différentes concentrations de zaprinast a été vérifiée par immunofluorescence.

Cultures organotypiques d’explants rétiniens de singe macaque

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Le modèle rétinien primate établi dans cette étude nous offre l’étude du mécanisme complet et du développement thérapeutique de la détérioration rétinienne dépendante cGMP-PKG. Ce modèle individuel de primate non humain réserve la confirmation des tissus rétiniens et les interactions intercellulaires, ce qui permet une meilleure simulation des conditions in vivo. Il réduit également l’utilisation des animaux et raccourcit la durée expérimentale.Fournir une approche expérimentale de contrôle pour étudier le développement ou la dégénérescence de la rétine. Commencez la préparation des explants rétiniens en lavant les globes oculaires isolés de macaques de type sauvage avec 10 millilitres d’iode à 5% de povidone pendant 30 secondes. Pour éviter la contamination bactérienne, trempez les globes oculaires dans une solution de PBS de streptomycine à 5% de pénicilline pendant une minute avant l’incubation dans 10 millilitres de milieu R16 pendant cinq minutes.Ensuite, plongez les globes oculaires dans 10 millilitres de solution de protéine Ace-K préchauffée à 37 degrés Celsius et incubée pendant deux minutes. Effectuer l’incubation suivante dans 10 millilitres d’une solution de sérum fœtal bovin R16 plus un à un pendant cinq minutes. Donner un lavage final dans 10 millilitres de R16 frais.Une fois cela fait, séparez la sclérotique, la cornée, l’iris, le cristallin et le corps vitré. Ensuite, coupez la rétine de quatre côtés avec une pince à épiler et des ciseaux. Ensuite, utilisez une lame fine de quatre millilitres pour couper l’explant rétinien à 1,5 millimètre du côté nasal, quatre millimètres du côté temporal et deux millimètres des côtés supérieur et inférieur de la tête du nerf optique.Ensuite, à l’aide d’une lame fine d’arbre de six millimètres, coupez le côté central de l’explant rétinien contenant le disque optique et la macula. À l’aide d’une pipette large, tirez l’explant de rétine contenant la rétine et la choroïde et placez-le au milieu de l’insert avec le côté photorécepteur vers le haut. Immergez complètement la rétine dans un millilitre du milieu complet sur la plaque sous la membrane.Cultivez les explants rétiniens et placez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone humidifié à 5%. Donnez le traitement de concentration de médicament approprié aux explants pendant quatre jours. Utilisez au moins trois explants par condition de traitement et utilisez les explants sans le médicament comme témoin positif.Pour la fixation et la cryosection, traiter les explants rétiniens avec un millilitre d’aldéhyde paraforme pendant 45 minutes. Après un bref rinçage avec un millilitre de PBS, incuber en série les explants dans 10% saccharose pendant 10 minutes, 20% saccharose pendant 20 minutes et 30% saccharose pendant 30 minutes. Couper les explants rétiniens uniformément avec quatre quadrants à la périphérie et six millimètres au centre.Ensuite, transférez les explants rétiniens dans une boîte en fer blanc d’environ 1,5 par 1,5 par 1,5 centimètres avec un milieu d’enrobage de composé à température de coupe optimale recouvrant l’explant. Immédiatement, congelez les sections de tissu dans de l’azote liquide et placez-les dans un réfrigérateur à 20 degrés pour les conserver. Ensuite, coupez la gélose en un petit bloc contenant l’échantillon de tissu.Coupez les blocs en blocs de 10 micromètres et placez les sections sur des lames de microscope à adhérence à l’aide d’une brosse douce. Ensuite, séchez les sections pendant 45 minutes à 40 degrés Celsius et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour la coloration cyclique à la guanosine monophosphate ou au GMPc, dessiner un anneau hydrophobe autour des sections rétiniennes séchées avec un stylo bloqueur de liquide et couvrir les échantillons.Plongez les lames dans 200 microlitres de 0,3% PBS et Triton-X100 ou PBST pendant 10 minutes, suivi d’un traitement d’une heure dans 200 microlitres de solution bloquante à température ambiante. Ensuite, incuber la lame d’échantillon pendant la nuit avec les 200 microlitres d’anticorps primaires préparés dans la solution de blocage à quatre degrés Celsius et rincer trois fois avec du PBS pendant 10 minutes. Incuber la lame dans 200 microlitres d’anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante.Après trois lavages de PBS pendant 10 minutes, couvrir les échantillons avec un support de montage antidécoloration contenant du DAPI et conserver à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie. Sécher la lame à température ambiante pendant 15 minutes et dessiner un anneau barrière hydrofuge autour de l’échantillon de tissu rétinien à l’aide d’un stylo bloqueur de liquide. Après incubation avec 40 millilitres de PBS pendant 15 minutes, traiter les sections avec 42 millilitres de 0,05 molaire tris-tampon ou TBS à 37 degrés Celsius.Aspirer le TBS, incuber les échantillons avec six microlitres de protéinase K pendant cinq minutes et laver les lames trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Exposez les lames à 40 millilitres de solution d’acide acétique éthanol dans le chaplin. Couvrez-le d’une feuille transparente et incuber à moins 20 degrés Celsius pendant cinq minutes.Lavez les lames trois fois avec TBS pendant cinq minutes à chaque fois. Exposez les lames à 200 à 300 microlitres de solution bloquante ou 1% BSA et incuberez-les dans une chambre d’humidité pendant une heure. À environ 130 microlitres de solution rouge TMR par lame et après une heure, donner deux lavages de 200 microlitres de PBS pendant cinq minutes chacun.Placez des lames de couvercle contenant une à deux gouttes de support de montage anti-décoloration avec DAPI sur les échantillons et incuber les lames à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie. Après coloration séquentielle avec tunnel et cGMP, passez à la microscopie à lumière et à fluorescence en ajustant les paramètres de la caméra. Capturez les images de quatre champs de chaque section à l’aide du logiciel avec un appareil photo numérique à un grossissement de 20x.Obtenez des images représentatives des zones centrales de la rétine en utilisant DAPI, EGFP et TMR avec balayage z-stack et un intervalle d’un micromètre et facultatif à 1,251 micromètres. Dans les explants rétiniens traités avec différentes concentrations des inhibiteurs de la PDE6 Zaprinast, le nombre de cellules tunnelles et GMPc positives a été fortement augmenté dans la couche nucléaire externe par rapport au groupe témoin. La forte proportion de cellules tunnel-positives suggère que l’augmentation de l’activité cGMP peut améliorer la dégénérescence des cellules rétiniennes induite avant le nid et que l’accumulation de GMPc joue un rôle dans la dégénérescence des photorécepteurs.La préparation explant doit être effectuée dès que possible. Op animal disperse cinq et toute accumulation parce qu’il améliore la survie cellulaire et améliore l’état de la fibre de la série de piles en vrac. Dans la plus grande mesure visible, le vitré doit être nettoyé avec des stéroïdes.Évitez de contacter les couches de fibres nerveuses rétiniennes lors du transfert d’explants rétiniens pour éviter les lésions cellulaires mécaniques. Veuillez prendre note, pour émettre un transfert en douceur des explants rétiniens vers des inserts de culture, l’animal peut être pré-trempé dans quelque chose pour le garder humide avant de transférer les tissus rétiniens. De plus, l’ensemble du processus doit être effectué dans l’atmosphère stéroïde pour éviter la contamination pendant le processus.

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