Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
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Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81960180), der Zinke Heritage Foundation und der Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01) unterstützt. Wir danken Prof. Longbao Lv (Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, China) für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Affenaugäpfel.

Die Tierstudie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (IACUC-PE-2022-06-002) und der Tierethikprüfung und dem Tierprotokoll der Universität Yunnan (YNU20220149) geprüft und genehmigt.
1. Herstellung von Netzhautexplantaten
<ol><li>Die Augäpfel von Primaten werden von Wildtyp-Makaken im Alter von 1 bis 3 Jahren gewonnen, in einer Gewebeaufbewahrungslösung gelagert und innerhalb von 3 Stunden nach der Enuklea...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. 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Visuelle Phototransduktion bezieht sich auf den biologischen Prozess, bei dem Lichtsignale von Photorezeptorzellen in der Netzhaut des Auges in elektrische Signale umgewandelt werden. Photorezeptorzellen sind polarisierte Neuronen, die zur Phototransduktion fähig sind, und es gibt zwei verschiedene Arten von Photorezeptoren, die nach der Form ihrer äußeren Segmente als Stäbchen und Zapfen bezeichnet werden. Stäbchen sind für das skotopische Sehen verantwortlich und Zapfen sind für das photopische und hochscharfe S...

Die hereditäre Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet und wird durch Mutationen in einer Vielzahl von pathogenen Genen verursacht1. Das Endergebnis von RD ist der Verlust des Sehvermögens, und in den allermeisten Fällen ist die Krankheit bis heute nicht behandelbar. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die zum Absterben von Photorezeptoren führen, mit Modellen zu untersuchen, die den menschlichen Krankheitszustand originalgetreu abbilden. Hier sind primatenbasierte Modelle aufgrund ihrer Nähe zum Menschen von besonderem Interesse. Insbesondere können solche Modelle die Entwicklung geeigneter therapeutischer Interventionen vorantreiben, die den Zelltod der Photorezeptoren stoppen oder verzögern können.
Frühere Forschungen zu den Mechanismen des Zelltods bei RD haben gezeigt, dass die Abnahme oder der Verlust der Phosphodiesterase 6 (PDE6)-Aktivität, die durch RD-auslösende Genmutationen verursacht wird, zu einer verminderten Hydrolyse von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP)2,3 führt. cGMP ist ein spezifischer Agonist der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle (CNGCs) in den äußeren Stäbchensegmenten (ROS) und ist auch ein Schlüsselmolekül, das für die Umwandlung von Lichtsignalen in elektrische Signale in Photorezeptorzellen von Wirbeltieren verantwortlich ist4. Eine reduzierte cGMP-Hydrolyse führt zu einer Akkumulation von cGMP in ROS, was zur Öffnung von CNGCs führt 5. Folglich werden die Phototransduktionswege aktiviert, was zu einem Anstieg der Kationenkonzentrationen in den Photorezeptorzellen führt. Dieser Prozess belastet die Photorezeptoren metabolisch, was bei Überaktivierung z.B. durch Mutationen in PDE6 zum Zelltod führen kann.
Viele Studien haben gezeigt, dass eine signifikante Überakkumulation von cGMP in Photorezeptoren von Mausmodellen mit verschiedenen RD-Genmutationen die Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) verursachen kann3,6. Dies führt zu einer deutlichen Zunahme absterbender, TUNEL-positiver Zellen und zu einer allmählichen Ausdünnung der Photorezeptorzellschicht. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die durch erhöhte cGMP-Spiegel verursachte PKG-Überaktivierung eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Induktion des Photorezeptorzelltods ist 2,5. Studien an verschiedenen Mausmodellen von RD haben auch gezeigt, dass die PKG-Aktivierung, die durch erhöhte cGMP-Spiegel in Photorezeptoren induziert wird, zu einer Überaktivierung von nachgeschalteten Effektoren wie Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1 (PARP1), Histon-Deacetylase (HDAC) und Calpain 2,7,8,9 führt. Dies impliziert kausale Zusammenhänge zwischen diesen verschiedenen Zielproteinen und dem Tod von Photorezeptorzellen.
Bisherige Forschungen zur Pathologie, Toxikopharmakologie und Therapie von RD basierten jedoch hauptsächlich auf Mausmodellen für RD10,11,12. Dennoch gibt es nach wie vor immense Schwierigkeiten bei der klinischen Translation dieser Ergebnisse. Dies ist auf die erheblichen genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen zurückzuführen, insbesondere in Bezug auf die Netzhautstruktur. Im Gegensatz dazu weisen nicht-menschliche Primaten (NHPs) auch ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen in Bezug auf genetische Merkmale, physiologische Muster und die Regulation von Umweltfaktoren auf. So wurde beispielsweise die optogenetische Therapie als Mittel zur Wiederherstellung der Netzhautaktivität in einem NHP-Modell untersucht13. Lingam und seine Kollegen zeigten, dass vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen, die aus retinalen Photorezeptor-Vorläuferzellen gewonnen werden, in der guten Herstellungspraxis eine Schädigung des Zapfen-Photorezeptors in NHP14 retten können. Daher sind NHP-Modelle wichtig für die Erforschung der RD-Pathogenese und die Entwicklung effektiver Behandlungsmethoden. Insbesondere NHP-Modelle von RD, die ähnliche pathogene Mechanismen wie beim Menschen aufweisen, könnten eine entscheidende Rolle bei Studien zur Entwicklung und In-vivo-toxikopharmakologischen Analyse neuer Medikamente spielen.
Angesichts des langen Lebenszyklus, der hohen technischen Schwierigkeiten und der hohen Kosten, die mit der Etablierung von In-vivo-Primatenmodellen verbunden sind, haben wir ein in vitro nicht-humanes Primatenmodell (NHP) unter Verwendung von Kulturen explantierter Makaken-Netzhaut etabliert. Zunächst wurden Wildtyp-Makaken im Alter von 1-3 Jahren für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-RPE-Aderhaut-Komplex enthielten. Explantate wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM) behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren. Der Zelltod der Photorezeptoren wurde mit dem TUNEL-Assay quantifiziert und analysiert, und die cGMP-Akkumulation in Explantaten wurde mittels Immunfluoreszenz verifiziert. Angesichts der hohen Ähnlichkeit in Bezug auf Zellverteilung und -morphologie, Netzhautschichtdicke und andere physiologische Eigenschaften der Netzhaut zwischen Affen und Menschen könnte die Etablierung des cGMP-PKG-Signalwegs im In-vitro-Netzhautmodell zukünftige Forschungen zur Pathogenese der RD sowie Studien zur Entwicklung und Toxikopharmakologie neuer Medikamente zur RD-Behandlung erleichtern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

Die erbliche Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet. Eine Überaktivierung des zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP)-abhängigen Proteinkinase-Signalwegs (PKG) in Photorezeptorzellen führt zum Tod von Photorezeptorzellen, insbesondere in Modellen mit Phosphodiesterase 6b (PDE6b)-Mutationen. Frühere Studien zu RD haben hauptsächlich Mausmodelle wie rd1 - oder rd10-Mäuse verwendet. Angesichts der genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen ist es wichtig zu verstehen, inwieweit die Netzhaut von Primaten und Nagetieren vergleichbar ist. Makaken haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen. Daher wurden Wildtyp-Makaken (im Alter von 1-3 Jahren) für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-Retinal-Pigmentepithel (RPE)-Aderhaut-Komplex enthielten. Diese Explantaten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren und die RD-Pathogenese zu simulieren. Die cGMP-Akkumulation und der Zelltod in Netzhautexplantaten von Primaten wurden anschließend mit Hilfe von Immunfluoreszenz und dem TUNEL-Assay verifiziert. Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell kann für relevante und effektive Studien zu den Mechanismen der cGMP-PKG-abhängigen RD sowie für die Entwicklung zukünftiger Behandlungsansätze dienen.

In dieser Studie wurde die Netzhautexplantatkultur von Makakenaffen mit Explantaten durchgeführt, die den Retina-RPE-Aderhautkomplex enthielten (Abbildung 1, ergänzende Abbildung S1). Im Vergleich zur In-vitro-Kultur von Netzhautzellen unter Verwendung der Netzhaut ohne das angehängte RPE und die Aderhaut ermöglicht unsere Explantatkultur ein besseres Überleben der Zellen und verlängert dementsprechend das Überleben der Photorezeptorzellen.
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Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Netzhautexplantate von Wildtyp-Makaken wurden in vitro kultiviert. Die Netzhautdegeneration und der cGMP-PKG-Signalweg wurden mit dem PDE6-Inhibitor Zaprinast induziert. Die cGMP-Akkumulation in den Explantaten bei unterschiedlichen Zapinast-Konzentrationen wurde mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.

Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell bietet die Untersuchung des umfassenden Mechanismus und der therapeutischen Entwicklung der cGMP-PKG-abhängigen Netzhautverschlechterung an. Dieses individuelle nichtmenschliche Primatenmodell reserviert die Bestätigung des Netzhautgewebes und interzelluläre Interaktionen, was eine bessere Simulation von In-vivo-Bedingungen ermöglicht. Es reduziert auch den Tiereinsatz und verkürzt die Versuchsdauer.Bereitstellung eines kontrollexperimentellen Ansatzes zur Untersuchung der Entwicklung oder Degeneration der Netzhaut. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Netzhautexplantate, indem Sie die Augäpfel von Wildtyp-Makaken 30 Sekunden lang mit 10 Millilitern 5%-Povidon-Jod waschen. Um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden, tauchen Sie die Augäpfel eine Minute lang in eine 5%ige Penicillin-Streptomycin-PBS-Lösung, bevor Sie sie fünf Minuten lang in 10 Milliliter R16-Medium inkubieren.Anschließend werden die Augäpfel in 10 Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmte Protein-Ace-K-Lösung getaucht und zwei Minuten lang inkubiert. Führen Sie die nächste Inkubation fünf Minuten lang in 10 Millilitern von eins zu eins R16 plus fötaler Kälberserumlösung durch. Eine letzte Wäsche in 10 Millilitern frischem R16 durchführen.Wenn Sie fertig sind, trennen Sie Sklera, Hornhaut, Iris, Linse und Glaskörper. Schneiden Sie dann die Netzhaut von vier Seiten mit Pinzette und Schere ab. Als nächstes schneiden Sie mit einer vier Milliliter großen Baumfeinen Klinge das Netzhautexplantat in einem Abstand von 1,5 Millimetern von der Nasenseite, vier Millimeter von der Schläfenseite und zwei Millimeter von der oberen und unteren Seite des Sehnervenkopfes ab.Dann schnitt man mit einer sechs Millimeter dicken baumfeinen Klinge die Mittelseite des Netzhautexplantats ab, das die Papille und die Makula enthält. Ziehen Sie mit einer breiten Pipette das Retina-Explantat mit der Netzhaut und der Aderhaut heraus und legen Sie es mit der Photorezeptorseite nach oben in die Mitte des Einsatzes. Tauchen Sie die Netzhaut vollständig in einen Milliliter des gesamten Mediums auf die Platte unter der Membran.Kulturen Sie die Netzhautexplanta und legen Sie sie in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und befeuchtetem 5%igem Kohlendioxid. Geben Sie den Explantaten vier Tage lang die entsprechende Behandlung mit der Wirkstoffkonzentration. Verwenden Sie mindestens drei Explantaten pro Behandlungsbedingung und verwenden Sie die Explantate ohne das Medikament als Positivkontrolle.Zur Fixierung und Kryo-Sektion werden die Netzhautexplanate 45 Minuten lang mit einem Milliliter Paraformaldehyd behandelt. Nach einer kurzen Spülung mit einem Milliliter PBS werden die Explantate nacheinander in 10%iger Saccharose für 10 Minuten, 20%Saccharose für 20 Minuten und 30%30%Saccharose für 30 Minuten inkubiert. Schneiden Sie die Netzhautexplanta gleichmäßig mit vier Quadranten in der Peripherie und sechs Millimetern in der Mitte.Übertragen Sie dann die Netzhautexplanta in eine Blechdose von etwa 1,5 x 1,5 x 1,5 Zentimetern mit einem optimalen Schneidtemperatur-Einbettungsmedium, das das Explantat bedeckt. Frieren Sie die Gewebeschnitte sofort in flüssigem Stickstoff ein und legen Sie sie zur Aufbewahrung in einen 20-Grad-Kühlschrank. Als nächstes schneiden Sie den Agar in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe.Schneiden Sie die Blöcke in 10-Mikrometer-Blöcke und legen Sie die Abschnitte mit einem weichen Pinsel auf Objektträger. Anschließend trocknen Sie die Abschnitte 45 Minuten lang bei 40 Grad Celsius und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Für die zyklische Guanosinmonophosphat- oder cGMP-Färbung ziehen Sie mit einem flüssigen Blocker-Pen einen hydrophoben Ring um die getrockneten Netzhautabschnitte und decken Sie die Proben ab.Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 200 Mikroliter 0,3 % PBS und Triton-X100 oder PBST, gefolgt von einer einstündigen Behandlung in 200 Mikroliter Blocklösung bei Raumtemperatur. Anschließend inkubieren Sie den Objektträger über Nacht mit den 200 Mikrolitern Primärantikörper, die in der Blockierungslösung bei vier Grad Celsius hergestellt wurden, und spülen Sie ihn 10 Minuten lang dreimal mit PBS ab. Inkubieren Sie den Objektträger in 200 Mikrolitern Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur.Nach dreimaligem Waschen von PBS für 10 Minuten bedecken Sie die Proben mit einem DAPI-haltigen Antifade-Eindeckmedium und lagern Sie sie vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Trocknen Sie den Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und ziehen Sie mit einem flüssigen Blocker-Pen einen wasserabweisenden Barrierering um die Netzhautgewebeprobe. Nach 15-minütiger Inkubation mit 40 Millilitern PBS werden die Schnitte mit 42 Millilitern 0,05 molaren Tris-Puffer oder TBS bei 37 Grad Celsius behandelt.Aspirieren Sie das TBS, inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang mit sechs Mikrolitern Proteinase K und waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang mit PBS. Setzen Sie die Objektträger 40 Millilitern Ethanolessigsäurelösung im Chaplin aus. Decken Sie es mit einer transparenten Folie ab und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius.Waschen Sie die Objektträger jedes Mal fünf Minuten lang dreimal mit TBS. Setzen Sie die Objektträger 200 bis 300 Mikrolitern Blockierlösung oder 1 % BSA aus und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer. Geben Sie bei ca. 130 Mikrolitern TMR-Rotlösung pro Objektträger und nach einer Stunde zwei Waschgänge mit 200 Mikrolitern PBS für jeweils fünf Minuten.Legen Sie Abdeckobjektträger mit ein bis zwei Tropfen lichtechtem Eindeckmedium mit DAPI über die Proben und inkubieren Sie die Objektträger vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der sequentiellen Färbung mit Tunnel und cGMP wird für die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie durch Einstellen der Kameraparameter vorgegangen. Nehmen Sie die Bilder von vier Feldern aus jedem Abschnitt mit der Software mit einer Digitalkamera bei 20-facher Vergrößerung auf.Erhalten Sie repräsentative Bilder aus den zentralen Bereichen der Netzhaut mit DAPI, EGFP und TMR mit Z-Stack-Scanning und einem Intervall von einem Mikrometer und optional bei 1,251 Mikrometern. Bei den Netzhautexplantaten, die mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zaprinast behandelt wurden, war die Anzahl der Tunnel- und cGMP-positiven Zellen in der äußeren Kernschicht im Vergleich zur Kontrollgruppe stark erhöht. Der hohe Anteil an Tunnel-positiven Zellen deutet darauf hin, dass die Erhöhung der cGMP-Aktivität die vor dem Nest induzierte Netzhautdegeneration verstärken kann und die cGMP-Akkumulation eine Rolle bei der Photorezeptordegeneration spielt.Die Explantatvorbereitung muss so schnell wie möglich durchgeführt werden. Op Tier Scatter Fives und jede Akkumulation, weil es das Überleben der Zellen verbessert und den Status der Faser der Bulk-Stack-Serie verbessert. Soweit sichtbar, sollte der Glaskörper mit Steroiden gereinigt werden.Vermeiden Sie den Kontakt mit den retinalen Nervenfaserschichten bei der Übertragung von Netzhautexplantaten, um eine mechanische Zellverletzung zu vermeiden. Bitte beachten Sie, dass das Haustier vor dem Transfer von Netzhautgewebe in etwas eingeweicht werden kann, um einen reibungslosen Transfer von Netzhautexplantaten in Kultureinsätze zu ermöglichen, um es feucht zu halten. Darüber hinaus muss der gesamte Prozess in der Steroidatmosphäre durchgeführt werden, um eine Kontamination während des Prozesses zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

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