Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81960180), קרן מורשת זינקה וקרן שרלוט וטיסטו קרסטן, המרכז הרפואי הקליני למחלות עיניים יונאן (ZX2019-02-01). אנו מודים לפרופ' לונגבאו לב (המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, קונמינג, סין) על שיתוף גלגלי העיניים של הקופים ששימשו במחקר זה.

המחקר בבעלי חיים נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (IACUC-PE-2022-06-002), וסקירת אתיקה של בעלי חיים ופרוטוקול בעלי חיים של אוניברסיטת יונאן (YNU20220149).
1. הכנת חצילים ברשתית
<ol><li>השיגו גלגלי עיניים של פרימטים מקופי מקוק פראיים, בני שנה עד 3...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

פוטוטרנסדוקציה חזותית מתייחסת לתהליך הביולוגי שבו אותות אור מומרים לאותות חשמליים על ידי תאים קולטי אור בתוך רשתית העין. תאים קולטי אור הם תאי עצב מקוטבים המסוגלים לבצע פוטוטרנסדוקציה, וישנם שני סוגים שונים של פוטורצפטורים המכונים מוטות ומדוכים על שם צורות המקטעים החיצוניים שלהם. מוטות ...

ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור ונגרם על ידי מוטציות במגוון רחב של גנים פתוגניים1. התוצאה הסופית של RD היא אובדן ראייה וברוב המכריע של המקרים המחלה נותרה בלתי ניתנת לטיפול עד עצם היום הזה. לכן, חשוב לחקור את המנגנונים התאיים המובילים למוות של קולטני אור באמצעות מודלים המייצגים נאמנה את מצב המחלה האנושי. כאן, מודלים מבוססי פרימטים מעניינים במיוחד בשל קרבתם לבני אדם. יש לציין כי מודלים כאלה עשויים לקדם את הפיתוח של התערבויות טיפוליות מתאימות שיכולות לעצור או לעכב מוות של תאים קולטי אור.
מחקרים קודמים על מנגנוני מוות תאי ב- RD הוכיחו כי ירידה או אובדן של פעילות פוספודיאסטראז 6 (PDE6) הנגרמת על ידי מוטציות בגן מפעיל RD מובילה להידרוליזה מופחתת של מונופוספט גואנוזין מחזורי (cGMP)2,3. cGMP הוא אגוניסט ספציפי של תעלות היונים המגודרות בנוקלאוטידים מחזוריים (CNGCs) במקטעים החיצוניים של המוט (ROSs) והוא גם מולקולת מפתח האחראית להמרת אותות אור לאותות חשמליים בתאי קולטני אור בעלי חוליות4. הידרוליזה מופחתת של cGMP גורמת להצטברות של cGMP ב-ROSs, מה שמוביל לפתיחת CNGCs 5. כתוצאה מכך, מסלולי פוטוטרנסדוקציה מופעלים, וכתוצאה מכך עלייה בריכוזי קטיון בתאים קולטי אור. תהליך זה מטיל עומס מטבולי על פוטורצפפטורים, אשר כאשר מופעלים יתר על המידה, למשל, על ידי מוטציות ב- PDE6, עלולים לגרום למוות תאי.
מחקרים רבים הראו כי הצטברות יתר משמעותית של cGMP בפוטורצפטורים של מודלים עכבריים עם מוטציות שונות בגן RD עלולה לגרום להפעלה של חלבון קינאז תלוי cGMP (PKG)3,6. זה מוביל לעלייה משמעותית בתאים גוססים, חיוביים TUNEL ודילול הדרגתי של שכבת התא photoreceptor. מחקרים קודמים מצביעים על כך שהפעלת יתר של PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות היא תנאי הכרחי ומספיק להשראת מוות תאי קולטני אור 2,5. מחקרים על מודלים שונים של RD בעכברים הראו גם כי הפעלת PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות בפוטורצפטורים, מובילה להפעלת יתר של גורמים משפיעים במורד הזרם, כגון פולי-ADP-ריבוז פולימראז 1 (PARP1), היסטון דאצטילאז (HDAC) וקלפין 2,7,8,9. זה מרמז על קשרים סיבתיים בין חלבוני מטרה שונים אלה לבין מוות של תאים קולטי אור.
עם זאת, מחקרים קודמים על פתולוגיה, טוקסיקופרקולוגיה וטיפול ב- RD התבססו בעיקר על מודלים של עכברים עבור RD10,11,12. עם זאת, נותרו קשיים עצומים בתרגום הקליני של תוצאות אלה. זאת בשל ההבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים הניכרים בין עכברים לבני אדם, במיוחד בכל הנוגע למבנה הרשתית. לעומת זאת, פרימטים לא אנושיים (NHPs) חולקים גם רמה גבוהה של דמיון עם בני אדם ביחס למאפיינים גנטיים, דפוסים פיזיולוגיים וויסות גורמים סביבתיים. לדוגמה, טיפול אופטוגנטי נחקר כאמצעי לשחזור פעילות הרשתית במודלNHP 13. לינגאם ועמיתיו הדגימו כי ייצור טוב של תאים מקדימים של קולטני אור ברשתית שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עשוי להציל נזק לקולטני אור חרוט ב- NHP14. לכן, מודלים NHP חשובים לחקר פתוגנזה RD ופיתוח שיטות טיפול יעילות. בפרט, מודלים NHP של RD, המציגים מנגנונים פתוגניים דומים לאלה בבני אדם, יכולים לשחק תפקיד קריטי במחקרים על פיתוח וניתוח טוקסיקו-פרמקולוגיה in vivo של תרופות חדשות.
לאור מחזור החיים הארוך, הקשיים הטכניים הגבוהים והעלות הגבוהה הכרוכה בביסוס מודלים של פרימטים in vivo , הקמנו מודל של פרימטים לא אנושיים במבחנה (NHP) תוך שימוש בתרביות של רשתית מקוק מושתלת. ראשית, קופי מקוק מסוג בר בגילאי 1-3 שנים נבחרו לתרבית חוץ גופית של צמחי רשתית, שכללה את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואידים. לאחר מכן טופלו צמחים בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM) כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG. מוות תאי קולטני אור כומת ונותח באמצעות בדיקת TUNEL, והצטברות cGMP בצמחים אומתה באמצעות immunofluorescence. בהתחשב ברמת הדמיון הגבוהה ביחס לפיזור התאים ולמורפולוגיה, עובי שכבת הרשתית ומאפיינים פיזיולוגיים אחרים של הרשתית בין קופים לבני אדם, הקמת מסלול איתות cGMP-PKG במודל הרשתית במבחנה עשויה להקל על מחקר עתידי על הפתוגנזה של RD, כמו גם מחקרים על פיתוח וטוקסיקו-פרמקולוגיה של תרופות חדשות לטיפול ב- RD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור. הפעלת יתר של מסלול החלבון המחזורי גואנוזין מונופוספט (cGMP) התלוי בקינאז (PKG) בתאי פוטורצפטור גורמת למוות של תאים קולטי אור, במיוחד במודלים המכילים מוטציות פוספודיאסטראז 6b (PDE6b). מחקרים קודמים על RD השתמשו בעיקר במודלים מורינים כגון עכברי rd1 או rd10 . בהתחשב בהבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים בין עכברים לבני אדם, חשוב להבין באיזו מידה ניתן להשוות את הרשתיות של פרימטים ומכרסמים. קופי מקוק חולקים רמה גבוהה של דמיון גנטי עם בני אדם. לכן, קופי מקוק מסוג בר (בגילאי 1-3 שנים) נבחרו לתרבית במבחנה של צמחי רשתית שכללה את קומפלקס אפיתל פיגמנט רשתית (RPE)-כורואידים. צמחים אלה טופלו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG ולדמות פתוגנזה של RD. הצטברות cGMP ומוות תאים בצמחי רשתית של פרימטים אומתו לאחר מכן באמצעות immunofluorescence ובדיקת TUNEL. מודל רשתית הפרימטים שנקבע במחקר זה עשוי לשמש למחקרים רלוונטיים ויעילים על המנגנונים של RD תלוי cGMP-PKG, כמו גם לפיתוח גישות טיפול עתידיות.

במחקר זה, תרבית חציל רשתית של קופי מקוק בוצעה באמצעות צמחים המכילים את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואיד (איור 1, איור משלים S1). בהשוואה לתרבית במבחנה של תאי רשתית המשתמשים ברשתית ללא RPE וכורואיד מחוברים, תרבית הצמחים שלנו מאפשרת הישרדות תאים טובה יותר ובהתאם לכך, מאריכ...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

צמחי רשתית שהתקבלו מקופי מקוק מסוג בר תורבתו במבחנה. ניוון הרשתית ומסלול האיתות cGMP-PKG הושרו באמצעות מעכב PDE6 zaprinast. הצטברות cGMP בצמחים בריכוזי זפרינזט שונים אומתה באמצעות אימונופלואורסנציה.

תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

מודל רשתית הפרימטים שנקבע במחקר זה מציע את חקירת המנגנון המקיף ואת הפיתוח הטיפולי של הידרדרות רשתית תלוית cGMP-PKG. מודל פרימאטים לא-אנושי אינדיבידואלי זה שומר על אישור רקמת הרשתית ואינטראקציות בין-תאיות המאפשרות סימולציה טובה יותר של תנאי in vivo. זה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים וזה מקצר את משך הניסוי.מתן גישה ניסיונית מבוקרת לחקר התפתחות רשתית או ניוון. התחל את הכנת החצילים ברשתית על ידי שטיפת גלגלי העיניים שבודדו מקופי מקוק מסוג בר עם 10 מיליליטר של יוד פובידון 5% למשך 30 שניות. כדי למנוע זיהום חיידקי, טבלו את גלגלי העיניים בתמיסת PBS סטרפטומיצין 5% פניצילין למשך דקה אחת לפני הדגירה ב-10 מיליליטר של מדיום R16 למשך חמש דקות.לאחר מכן לטבול את גלגלי העיניים ב 10 מיליליטר של חלבון Ace-K פתרון שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס מודגר במשך שתי דקות. בצע את הדגירה הבאה ב 10 מיליליטר של אחד עד אחד R16 בתוספת תמיסת סרום בקר עוברית במשך חמש דקות. תן שטיפה סופית ב 10 מיליליטר של R16 טרי.לאחר שתסיים, להפריד את הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית. ואז לחתוך את הרשתית מארבעה צדדים עם פינצטה ומספריים. לאחר מכן, השתמש בלהב עץ דק של ארבעה מיליליטר כדי לחתוך את הצמח ברשתית ב -1.5 מילימטר מצד האף, ארבעה מילימטר מהצד הרקתי ושני מילימטר מהצדדים העליונים והנחותים של ראש עצב הראייה.לאחר מכן באמצעות להב דק עץ שישה מ"מ לחתוך את הצד המרכזי של explant הרשתית המכיל את הדיסק האופטי ואת מקולה. בעזרת צינור רחב, מושכים את צמח הרשתית המכיל את הרשתית והכורואיד ומניחים אותו במרכז האינסרט כשצד הפוטורצפטור כלפי מעלה. השקיעו לחלוטין את הרשתית במיליליטר אחד של המדיום המלא על הצלחת מתחת לקרום.תרכבו את החצילים ברשתית והניחו אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לח. תן את הטיפול המתאים בריכוז התרופה לצמחים במשך ארבעה ימים. השתמש לפחות שלושה explants לכל תנאי טיפול ולהשתמש explants ללא התרופה כמו שליטה חיובית.לתיקון וחתך קריו, יש לטפל בחצילים ברשתית עם מיליליטר אחד של אלדהיד פרפורם למשך 45 דקות. לאחר שטיפה קצרה עם מיליליטר אחד של PBS דוגרים סדרתית על הצמחים ב-10% סוכרוז למשך 10 דקות, 20% סוכרוז במשך 20 דקות ו-30% סוכרוז למשך 30 דקות. חותכים את הרשתית באופן אחיד עם ארבעה רבעים בפריפריה ושישה מילימטרים במרכז.לאחר מכן מעבירים את החצילים ברשתית לקופסת פח בגודל של כ-1.5 על 1.5 על 1.5 ס"מ עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית המטמיעה מדיום המכסה את החציל. מיד מקפיאים את חלקי הרקמה בחנקן נוזלי ומכניסים אותם למקרר של 20 מעלות לאחסון. לאחר מכן, חותכים את האגר לגוש קטן המכיל את דגימת הרקמה.מחלקים את הבלוקים לבלוקים של 10 מיקרומטר ומניחים את המקטעים על שקופיות מיקרוסקופ הדבקה באמצעות מברשת רכה. לאחר מכן יבשו את החלקים במשך 45 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס ואחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לצביעת גואנוזין מונופוספט מחזורי או cGMP, ציירו טבעת הידרופובית סביב חלקי הרשתית המיובשים בעזרת עט חוסם נוזלים וכסו את הדגימות.טבלו את המגלשות ב-200 מיקרוליטר של 0.3% PBS ו-Triton-X100 או PBST למשך 10 דקות ולאחר מכן טיפול של שעה ב-200 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו על שקופית הדגימה למשך הלילה עם 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני שהוכנו בתמיסת החסימה בארבע מעלות צלזיוס ושטפו אותה שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות. לדגור את המגלשה ב 200 מיקרוליטר של נוגדן משני במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר שלוש שטיפות של PBS במשך 10 דקות, כסו את הדגימות באמצעי הרכבה נגד דעיכה המכיל DAPI ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה. יבשו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות וציירו טבעת מחסום דוחה מים סביב דגימת רקמת הרשתית בעזרת עט חוסם נוזלים. לאחר הדגירה עם 40 מיליליטר של PBS במשך 15 דקות, לטפל בחלקים עם 42 מיליליטר של 0.05 טריס-באפר מולארי או TBS ב 37 מעלות צלזיוס.שאפו את ה-TBS, דגרו על הדגימות עם שישה מיקרוליטרים של פרוטאינאז K במשך חמש דקות ושטפו שקופיות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחת. חשוף את המגלשות ל 40 מיליליטר של תמיסת אתנול חומצה אצטית בצ'פלין. מכסים אותו בסדין שקוף ודגרים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם TBS במשך חמש דקות בכל פעם. חשוף את המגלשות ל-200 עד 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה או 1% BSA ודגר עליהן בתא לחות למשך שעה. בכ-130 מיקרוליטר של תמיסה אדומה TMR לכל שקופית ולאחר שעה, יש לתת שתי שטיפות של 200 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות כל אחת.הניחו שקופיות כיסוי המכילות טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה נגד דעיכה עם DAPI מעל הדגימות ודגרו על השקופיות בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה. לאחר צביעה רציפה עם מנהרה ו- cGMP המשיכו במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטיות על ידי התאמת הפרמטרים של המצלמה. צלם את התמונות של ארבעה שדות מכל מקטע באמצעות התוכנה עם מצלמה דיגיטלית בהגדלה של פי 20.קבל תמונות מייצגות מהאזורים המרכזיים של הרשתית באמצעות DAPI, EGFP ו- TMR עם סריקת z-stack ומרווח של מיקרומטר אחד ואופציונלי של 1.251 מיקרומטר. בצמחי הרשתית שטופלו בריכוזים שונים של מעכבי PDE6 Zaprinast, מספר התאים החיוביים למנהרה ול-cGMP עלה מאוד בשכבה הגרעינית החיצונית בהשוואה לקבוצת הביקורת. השיעור הגבוה של תאים חיוביים למנהרה הציע כי העלייה בפעילות cGMP עשויה להגביר את ניוון תאי הרשתית המושרה לפני הקן והצטברות cGMP ממלאת תפקיד בניוון קולטני אור.הכנת Explant חייבת להתבצע בהקדם האפשרי. חיות אופ מפזרות חמישיות וכל הצטברות מכיוון שהיא משפרת את הישרדות התאים ומשפרת את מצב הסיבים של סדרות ערימה בתפזורת. במידה רבה ביותר גלוי את הזגוגית יש לנקות עם סטרואידים.הימנע ממגע עם שכבות סיבי עצב הרשתית בעת העברת חצילים ברשתית כדי למנוע פגיעה בתאים מכניים. שימו לב, כדי לבצע העברה חלקה של חצילים ברשתית לתוספות תרבית ניתן להשרות את חיית המחמד מראש במשהו כדי לשמור עליה לחה לפני העברת רקמות הרשתית. בנוסף, התהליך כולו חייב להתבצע באטמוספירה סטרואידית כדי למנוע זיהום במהלך התהליך.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...