Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 81960180), della Zinke Heritage Foundation e della Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Ringraziamo il Prof. Longbao Lv (Istituto di Zoologia, Accademia Cinese delle Scienze, Kunming, Cina) per aver condiviso i bulbi oculari delle scimmie utilizzati in questo studio.

Lo studio sugli animali è stato esaminato e approvato dal Comitato di revisione etica dell'Istituto di zoologia, dall'Accademia cinese delle scienze (IACUC-PE-2022-06-002) e dalla revisione dell'etica animale e dal protocollo animale dell'Università dello Yunnan (YNU20220149).
1. Preparazione di espianti retinici
<ol><li>Ottenere bulbi oculari di primati da macachi selvatici, di età compresa tra 1 e 3 anni, conservarli in una soluzione di conservazione dei tessuti e trasp...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

La fototrasduzione visiva si riferisce al processo biologico mediante il quale i segnali luminosi vengono convertiti in segnali elettrici dalle cellule dei fotorecettori all'interno della retina dell'occhio. Le cellule dei fotorecettori sono neuroni polarizzati capaci di fototrasduzione, e ci sono due diversi tipi di fotorecettori chiamati coni e bastoncelli dopo le forme dei loro segmenti esterni. I bastoncelli sono responsabili della visione scotopica e i coni sono responsabili della visione fotopica e ad alta acuità....

La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori ed è causata da mutazioni in un'ampia varietà di geni patogeni1. Il risultato finale della RD è la perdita della vista e nella stragrande maggioranza dei casi la malattia rimane incurabile fino ad oggi. Pertanto, è importante studiare i meccanismi cellulari che portano alla morte dei fotorecettori utilizzando modelli che rappresentino fedelmente la condizione della malattia umana. Qui, i modelli basati sui primati sono di particolare interesse a causa della loro vicinanza agli esseri umani. In particolare, tali modelli possono far progredire lo sviluppo di interventi terapeutici appropriati che possono arrestare o ritardare la morte cellulare dei fotorecettori.
Precedenti ricerche sui meccanismi di morte cellulare nella RD hanno dimostrato che la diminuzione o la perdita dell'attività della fosfodiesterasi 6 (PDE6) causata da mutazioni geniche che innescano RD porta a una ridotta idrolisi del guanosina monofosfato ciclico (cGMP)2,3. cGMP è un agonista specifico dei canali ionici ciclici nucleotide-dipendenti (CNGC) nei segmenti esterni dei bastoncelli (ROS) ed è anche una molecola chiave responsabile della conversione dei segnali luminosi in segnali elettrici nelle cellule fotorecettrici dei vertebrati4. La ridotta idrolisi del cGMP provoca l'accumulo di cGMP nei ROS, portando all'apertura dei CNGC 5. Di conseguenza, le vie di fototrasduzione vengono attivate, con conseguente aumento delle concentrazioni di cationi nelle cellule dei fotorecettori. Questo processo impone un carico metabolico sui fotorecettori, che se sovraattivato, ad esempio, da mutazioni nella PDE6, può causare la morte cellulare.
Molti studi hanno dimostrato che un significativo sovraaccumulo di cGMP nei fotorecettori di modelli murini con diverse mutazioni del gene RD può causare l'attivazione della proteina chinasi cGMP-dipendente (PKG)3,6. Ciò porta ad un sostanziale aumento delle cellule morenti, TUNEL-positive e ad un graduale assottigliamento dello strato cellulare del fotorecettore. Studi precedenti suggeriscono che la sovraattivazione di PKG causata da elevati livelli di cGMP è una condizione necessaria e sufficiente per l'induzione della morte cellulare dei fotorecettori 2,5. Studi su diversi modelli murini di RD hanno anche dimostrato che l'attivazione di PKG, indotta da elevati livelli di cGMP nei fotorecettori, porta a una sovraattivazione degli effettori a valle come la poli-ADP-ribosio polimerasi 1 (PARP1), l'istone deacetilasi (HDAC) e la calpain 2,7,8,9. Ciò implica associazioni causali tra queste diverse proteine bersaglio e la morte delle cellule dei fotorecettori.
Tuttavia, la ricerca precedente sulla patologia, tossicofarmacologia e terapia della RD si basava principalmente su modelli murini per RD10,11,12. Tuttavia, permangono immense difficoltà nella traduzione clinica di questi risultati. Ciò è dovuto alle notevoli differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, soprattutto per quanto riguarda la struttura retinica. Al contrario, i primati non umani (NHP) condividono anche un alto grado di somiglianza con gli esseri umani per quanto riguarda le caratteristiche genetiche, i modelli fisiologici e la regolazione dei fattori ambientali. Ad esempio, la terapia optogenetica è stata studiata come mezzo per ripristinare l'attività retinica in un modello NHP13. Lingam e colleghi hanno dimostrato che le cellule precursori dei fotorecettori retinici derivati da cellule staminali pluripotenti derivate da cellule staminali di buona fabbricazione possono salvare il danno del fotorecettore del cono in NHP14. Pertanto, i modelli NHP sono importanti per l'esplorazione della patogenesi RD e lo sviluppo di metodi di trattamento efficaci. In particolare, i modelli NHP di RD, che presentano meccanismi patogenetici simili a quelli dell'uomo, potrebbero svolgere un ruolo critico negli studi sullo sviluppo e nell'analisi tossicofarmacologica in vivo di nuovi farmaci.
In considerazione del lungo ciclo di vita, dell'elevato livello di difficoltà tecniche e degli elevati costi necessari per stabilire modelli di primati in vivo, abbiamo stabilito un modello in vitro di primati non umani (NHP) utilizzando colture di retina di macaco espiantata. In primo luogo, i macachi selvatici di età compresa tra 1 e 3 anni sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici, che includevano il complesso retina-RPE-coroide. Gli espianti sono stati quindi trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG. La morte cellulare dei fotorecettori è stata quantificata e analizzata utilizzando il test TUNEL e l'accumulo di cGMP negli espianti è stato verificato tramite immunofluorescenza. Dato l'elevato grado di somiglianza rispetto alla distribuzione cellulare e alla morfologia, allo spessore dello strato retinico e ad altre caratteristiche fisiologiche della retina tra scimmie e umani, la creazione della via di segnalazione cGMP-PKG nel modello retinico in vitro può facilitare la ricerca futura sulla patogenesi della RD, nonché gli studi sullo sviluppo e la tossicofarmacologia di nuovi farmaci per il trattamento delle RD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori. L'iperattivazione della via ciclica della proteina chinasi dipendente dalla guanosina monofosfato (cGMP) (PKG) nelle cellule dei fotorecettori causa la morte delle cellule dei fotorecettori, specialmente nei modelli che ospitano mutazioni della fosfodiesterasi 6b (PDE6b). Precedenti studi sulla RD hanno utilizzato principalmente modelli murini come topi rd1 o rd10 . Date le differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, è importante capire fino a che punto le retine di primati e roditori sono comparabili. I macachi condividono un alto livello di somiglianza genetica con gli esseri umani. Pertanto, i macachi selvatici (di età compresa tra 1-3 anni) sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici che includevano il complesso epitelio pigmentato retinico-retinico (RPE)-coroide. Questi espianti sono stati trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG e simulare la patogenesi RD. L'accumulo di cGMP e la morte cellulare negli espianti retinici dei primati sono stati successivamente verificati utilizzando l'immunofluorescenza e il saggio TUNEL. Il modello retinico dei primati stabilito in questo studio può servire per studi pertinenti ed efficaci sui meccanismi della RD cGMP-PKG-dipendente, nonché per lo sviluppo di futuri approcci terapeutici.

In questo studio, la coltura retinica di espianti di scimmia macaco è stata eseguita utilizzando espianti contenenti il complesso retina-RPE-coroide (Figura 1, Figura supplementare S1). Rispetto alla coltura in vitro di cellule retiniche che utilizzano la retina senza RPE e coroide collegati, la nostra coltura di espianti facilita una migliore sopravvivenza cellulare e, di conseguenza, prolunga la sopravvivenza delle cellule dei fotorecettori.
<p class="jove_co...

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Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Gli espianti retinici ottenuti da macachi selvatici sono stati coltivati in vitro. La degenerazione retinica e la via di segnalazione cGMP-PKG sono state indotte utilizzando l'inibitore della PDE6 zaprinast. L'accumulo di cGMP negli espianti a diverse concentrazioni di zaprinast è stato verificato utilizzando l'immunofluorescenza.

Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Il modello retinico dei primati stabilito in questo studio offre lo studio del meccanismo globale e dello sviluppo terapeutico del deterioramento retinico cGMP-PKG dipendente. Questo modello individuale di primate non umano riserva la conferma del tessuto retinico e le interazioni intercellulari che consentono una migliore simulazione delle condizioni in vivo. Riduce anche l'uso animale e riduce la durata sperimentale.Fornire un approccio sperimentale di controllo per studiare lo sviluppo o la degenerazione della retina. Iniziare la preparazione degli espianti retinici lavando i bulbi oculari isolati dai macachi selvatici con 10 millilitri di iodio povidone al 5% per 30 secondi. Per evitare la contaminazione batterica, immergere i bulbi oculari in una soluzione di streptomicina PBS al 5% di penicillina per un minuto prima dell'incubazione in 10 millilitri di terreno R16 per cinque minuti.Quindi immergere i bulbi oculari in 10 millilitri di soluzione proteica Ace-K preriscaldata a 37 gradi Celsius e incubata per due minuti. Eseguire la successiva incubazione in 10 millilitri di una a una soluzione di siero bovino fetale R16 più per cinque minuti. Dare un lavaggio finale in 10 millilitri di R16 fresco.Una volta fatto, separare la sclera, la cornea, l'iride, il cristallino e il corpo vitreo. Quindi tagliare la retina da quattro lati con pinzette e forbici. Quindi, utilizzare una lama sottile da quattro millilitri per tagliare l'espianto retinico a 1,5 millimetri dal lato nasale, quattro millimetri dal lato temporale e due millimetri dai lati superiore e inferiore della testa del nervo ottico.Quindi usando una lama sottile di sei millimetri tagliare il lato centrale dell'espianto retinico contenente il disco ottico e la macula. Utilizzando un pipet largo, tirare l'espianto di retina contenente la retina e la coroide e posizionarlo al centro dell'inserto con il fotorecettore rivolto verso l'alto. Immergere completamente la retina in un millilitro del mezzo completo sulla piastra sotto la membrana.Coltivare gli espianti retinici e metterli in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica umidificata al 5%. Somministrare il trattamento di concentrazione del farmaco appropriato per espianti per quattro giorni. Utilizzare almeno tre espianti per condizione di trattamento e utilizzare gli espianti senza il farmaco come controllo positivo.Per il fissaggio e la criosezione, trattare gli espianti retinici con un millilitro di aldeide paraforme per 45 minuti. Dopo un breve risciacquo con un millilitro di PBS incubare in serie gli espianti in 10% di saccarosio per 10 minuti, 20% di saccarosio per 20 minuti e 30% di saccarosio per 30 minuti. Tagliare gli espianti retinici in modo uniforme con quattro quadranti nella periferia e sei millimetri al centro.Quindi trasferire gli espianti retinici in una scatola di latta di circa 1,5 per 1,5 per 1,5 centimetri con un mezzo di incorporamento del composto di temperatura di taglio ottimale che copre l'espianto. Immediatamente, congelare le sezioni di tessuto in azoto liquido e metterle in un frigorifero a 20 gradi per la conservazione. Quindi, tagliare l'agar in un piccolo blocco contenente il campione di tessuto.Sezionare i blocchi in blocchi da 10 micrometri e posizionare le sezioni su vetrini da microscopio ad adesione usando una spazzola morbida. Quindi asciugare le sezioni per 45 minuti a 40 gradi Celsius e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Per la colorazione ciclica con guanosina monofosfato o cGMP, disegnare un anello idrofobo attorno alle sezioni retiniche essiccate con una penna bloccante liquida e coprire i campioni.Immergere i vetrini in 200 microlitri di 0,3% PBS e Triton-X100 o PBST per 10 minuti seguiti da un trattamento di un'ora in 200 microlitri di soluzione bloccante a temperatura ambiente. Quindi, incubare il vetrino del campione durante la notte con i 200 microlitri di anticorpo primario preparato nella soluzione bloccante a quattro gradi Celsius e sciacquarlo tre volte con PBS per 10 minuti. Incubare il vetrino in 200 microlitri di anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente.Dopo tre lavaggi di PBS per 10 minuti, coprire i campioni con un mezzo di montaggio antisbiadimento contenente DAPI e conservare a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti prima dell'imaging. Asciugare il vetrino a temperatura ambiente per 15 minuti e disegnare un anello barriera idrorepellente attorno al campione di tessuto retinico con una penna bloccante liquida. Dopo l'incubazione con 40 millilitri di PBS per 15 minuti trattare le sezioni con 42 millilitri di tris-buffer molare 0,05 o TBS a 37 gradi Celsius.Aspirare il TBS, incubare i campioni con sei microlitri di proteinasi K per cinque minuti e lavare i vetrini tre volte con PBS per cinque minuti ciascuno. Esporre i vetrini a 40 millilitri di soluzione di acido acetico etanolo nel chaplin. Coprirlo con un foglio trasparente e incubare a meno 20 gradi Celsius per cinque minuti.Lavare i vetrini tre volte con TBS per cinque minuti ogni volta. Esporre i vetrini a 200-300 microlitri di soluzione bloccante o 1% BSA e incubarli in una camera di umidità per un'ora. A circa 130 microlitri di soluzione rossa TMR per vetrino e dopo un'ora, somministrare due lavaggi da 200 microlitri di PBS per cinque minuti ciascuno.Posizionare i vetrini di copertura contenenti da una a due gocce di mezzo di montaggio antidissolvenza con DAPI sui campioni e incubare i vetrini a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti prima dell'imaging. Dopo la colorazione sequenziale con tunnel e cGMP procedere alla microscopia a luce e fluorescenza regolando i parametri della telecamera. Cattura le immagini di quattro campi da ogni sezione utilizzando il software con una fotocamera digitale con ingrandimento 20x.Ottieni immagini rappresentative dalle aree centrali della retina utilizzando DAPI, EGFP e TMR con scansione z-stack e un intervallo di un micrometro e opzionale a 1.251 micrometri. Negli espianti retinici trattati con diverse concentrazioni degli inibitori della PDE6 Zaprinast il numero di cellule tunnel e cGMP positive è stato fortemente aumentato nello strato nucleare esterno rispetto al gruppo di controllo. L'alta percentuale di cellule positive al tunnel ha suggerito che l'aumento dell'attività del cGMP può migliorare la degenerazione delle cellule retiniche indotta prima del nido e l'accumulo di cGMP svolge un ruolo nella degenerazione dei fotorecettori.La preparazione dell'espianto deve essere eseguita il prima possibile. Op animale spargere cinque e qualsiasi accumulo perché migliora la sopravvivenza cellulare e migliora lo stato di fibra di serie stack bulk. In misura massima visibile il vitreo deve essere pulito con steroidi.Evitare di contattare gli strati di fibre nervose retiniche durante il trasferimento di espianti retinici per prevenire lesioni cellulari meccaniche. Si prega di prendere nota, per emettere un trasferimento regolare di espianti retinici agli inserti di coltura l'animale può essere pre-immerso in qualcosa per mantenerlo umido prima di trasferire i tessuti retinici. Inoltre, l'intero processo deve essere eseguito nell'atmosfera steroidea per evitare la contaminazione durante il processo.

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