Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(第81960180号)、ジンケ遺産財団、および雲南眼疾患臨床医療センターのシャーロットアンドティストウケルスタン財団からの助成金によって支援されました(ZX2019-02-01)。Longbao Lv教授(中国科学院動物学研究所、昆明、中国)には、この研究で使用したサルの眼球を共有していただき、感謝します。

動物実験は、中国科学院動物学研究所の倫理審査委員会(IACUC-PE-2022-06-002)、および雲南大学の動物倫理審査および動物プロトコル(YNU20220149)によってレビューおよび承認されました。
1.網膜外植片の調製
<ol><li>1〜3歳の野生型マカクから霊長類の眼球を入手し、組織保存液に保存し、サルを屠殺した後または自然死後、除核から3時間以内に氷上で輸送します。...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

視覚光伝達とは、光信号が眼の網膜内の光受容体細胞によって電気信号に変換される生物学的プロセスを指します。視細胞は光伝達が可能な偏光ニューロンであり、光受容体には、その外側のセグメントの形状にちなんで桿体と錐体と呼ばれる2つの異なるタイプがあります。桿体は暗所視に責任があり、錐体は明所視と高視力に責任があります。遺伝性RDは、進行性の網膜視細胞死を特徴と?...

遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とし、多種多様な病原性遺伝子の変異によって引き起こされます1。RDの最終結果は視力喪失であり、ほとんどの場合、この病気は今日まで治療できないままです。したがって、光受容体死に至る細胞機構を、ヒトの病態を忠実に表現したモデルを用いて研究することが重要です。ここでは、霊長類ベースのモデルは、人間に近いため、特に興味深いものです。特に、このようなモデルは、視細胞死を停止または遅延させることができる適切な治療的介入の開発を進める可能性がある。
RDの細胞死メカニズムに関するこれまでの研究では、RDを誘発する遺伝子変異によって引き起こされるホスホジエステラーゼ6(PDE6)活性の低下または喪失が、環状グアノシン一リン酸(cGMP)の加水分解の減少につながることが示されています2,3。cGMPは、桿体外側セグメント(ROS)の環状ヌクレオチド依存性イオンチャネル(CNGC)の特異的アゴニストであり、脊椎動物の視細胞における光信号の電気信号への変換に関与する重要な分子でもあります4。cGMP加水分解の減少は、ROS中のcGMPの蓄積を引き起こし、CNGCの開放をもたらす5。その結果、光伝達経路が活性化され、その結果、光受容体細胞における陽イオン濃度が増加する。このプロセスは光受容体に代謝負荷を課し、例えばPDE6の突然変異によって過剰に活性化されると、細胞死を引き起こす可能性があります。
多くの研究により、RD遺伝子変異の異なるマウスモデルの光受容体におけるcGMPの有意な過剰蓄積が、cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)の活性化を引き起こす可能性があることが示されています3,6。これは、死にかけているTUNEL陽性細胞の大幅な増加および視細胞層の漸進的な薄化をもたらす。以前の研究では、cGMPレベルの上昇によって引き起こされるPKGの過剰活性化が、視細胞死の誘導に必要かつ十分な条件であることが示唆されています2,5。RDのさまざまなマウスモデルに関する研究では、光受容体のcGMPレベルの上昇によって誘導されるPKG活性化が、ポリ-ADP-リボースポリメラーゼ1(PARP1)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、およびカルパイン2,7,8,9などの下流エフェクターの過剰活性化につながることも示されています。これは、これらの異なる標的タンパク質と視細胞死との因果関係を示唆しています。
しかし、RDの病理学、毒物薬理学、および治療に関する以前の研究は、主にRD 10、11、12のマウスモデルに基づいていました。それにもかかわらず、これらの結果の臨床翻訳には計り知れない困難が残っています。これは、特に網膜構造に関して、マウスとヒトの間にかなりの遺伝的および生理学的違いがあるためです。対照的に、非ヒト霊長類(NHP)は、遺伝的特徴、生理学的パターン、および環境要因調節に関してもヒトと高度な類似性を共有しています。例えば、NHPモデル13における網膜活性を回復させる手段として、光遺伝学的治療が検討された。今回、Lingamたちの研究グループは、優れた製造基準級のヒト誘導多能性幹細胞由来網膜視細胞前駆細胞が、NHP14の錐体光受容体損傷を救済できることを実証した。したがって、NHPモデルは、RDの病因の探索と効果的な治療法の開発に重要です。特に、ヒトと同様の病原性メカニズムを示すRDのNHPモデルは、新薬の開発やin vivo毒性薬理学的解析の研究に重要な役割を果たす可能性があります。
in vivo 霊長類モデルの確立には、ライフサイクルの長期化、技術的困難度の高さ、コストの高さを考慮すると、外植したマカク網膜の培養を用いた in vitro 非ヒト霊長類(NHP)モデルを確立しました。まず、1〜3歳の野生型マカクを、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養用に選択した。次に、外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM)で処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導しました。TUNELアッセイを用いて視細胞死を定量・解析し、外植体におけるcGMP蓄積を免疫蛍光法 で 検証した。サルとヒトの網膜の細胞分布や形態、網膜層厚などの生理的特徴の類似性が高いことから、 in vitro 網膜モデルにおけるcGMP-PKGシグナル伝達経路の確立は、RDの病態解明やRD治療薬の開発・毒性薬理学の研究の進展につながることが期待されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とする。光受容体細胞における環状グアノシン一リン酸(cGMP)依存性プロテインキナーゼ(PKG)経路の過剰活性化は、特にホスホジエステラーゼ6b(PDE6b)変異を有するモデルにおいて、光受容体細胞死を引き起こす。RDに関する以前の研究では、主に rd1 または rd10 マウスなどのマウスモデルが使用されてきました。マウスとヒトの遺伝的および生理学的な違いを考えると、霊長類とげっ歯類の網膜がどの程度同等であるかを理解することが重要です。マカクザルは人間と高いレベルの遺伝的類似性を共有しています。したがって、野生型マカク(1〜3歳)を、網膜-網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養に選択しました。これらの外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナストで処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導し、RD病因をシミュレートしました。その後、霊長類網膜外植片におけるcGMP蓄積および細胞死を、免疫蛍光法およびTUNELアッセイを用いて検証した。本研究で確立された霊長類網膜モデルは、cGMP-PKG依存性RDのメカニズムに関する関連性のある効果的な研究、および将来の治療アプローチの開発に役立つ可能性があります。

本研究では、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む外植片を用いてマカクザル網膜外植片培養を行った(図1、 補足図S1)。RPEや脈絡膜を付着させない網膜を用いた網膜細胞の in vitro 培養と比較して、当社の外植片培養は細胞の生存率を高め、視細胞の寿命を延ばします。
異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM; <stro...

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Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

野生型マカクから得られた網膜外植体を インビトロで培養した。網膜変性およびcGMP−PKGシグナル伝達経路は、PDE6阻害剤ザプリナストを用いて誘導した。異なるザプリナスト濃度の外植体におけるcGMP蓄積は、免疫蛍光法を用いて検証された。

マカクザルの有機型網膜外植片培養

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

本研究で確立した霊長類網膜モデルを用いて、cGMP-PKG依存性網膜劣化の包括的なメカニズムの解明と治療法開発を提供します。この個々の非ヒト霊長類モデルは、網膜組織の確認と細胞間相互作用を予約し、in vivo状態のより良いシミュレーションを可能にします。また、動物の使用を減らし、実験期間を短縮します。網膜の発達または変性を調査するための制御実験的アプローチを提供する。野生型マカクから単離された眼球を10ミリリットルの5%ポビドンヨードで30秒間洗浄することにより、網膜外植片の調製を開始する。細菌汚染を避けるために、眼球を5%ペニシリンストレプトマイシンPBS溶液に1分間浸してから、10ミリリットルのR16培地で5分間インキュベートします。次に、37°Cで予熱した10ミリリットルのタンパク質Ace-K溶液に眼球を浸し、2分間インキュベートします。次に、10ミリリットルの1対1のR16プラスウシ胎児血清溶液中で5分間インキュベーションを行う。10ミリリットルの新鮮なR16で最終洗浄を行います。完了したら、強膜、角膜、虹彩、水晶体、硝子体を分離します。次に、ピンセットとはさみで網膜を4つの側面から切ります。次に、4ミリリットルの木の細かい刃を使って、視神経乳頭の鼻側から1.5ミリメートル、側頭側から4ミリメートル、上側と下側から2ミリメートルで網膜外植片を切断します。次いで、6ミリメートルの木の微細な刃を用いて、視神経乳頭及び黄斑を含む網膜外植片の中央側を切り出した。幅広のピペットを使用して、網膜と脈絡膜を含む網膜外植片を引っ張り、感光体側を上にしてインサートの中央に置きます。膜の下のプレート上の1ミリリットルの完全な培地に網膜を完全に沈めます。網膜外植片を培養し、加湿した37%二酸化炭素を含む摂氏5度のインキュベーターに入れます。外植片に適切な薬物濃度処理を4日間施す。処理条件ごとに少なくとも3つの外植片を使用し、薬物を含まない外植片をポジティブコントロールとして使用します。固定および凍結切片の場合は、網膜外植片を1ミリリットルのパラフォームアルデヒドで45分間処理します。1ミリリットルのPBSで短時間すすぎた後、外植片を10%スクロースで10分間、20%スクロースで20分間、30%スクロースで30分間連続的にインキュベートします。網膜外植片を周囲に4つの象限、中央に6ミリメートルで均一に切断します。次に、網膜外植片を、外植片を覆う最適な切断温度の複合包埋媒体を使用して、約1.5 x 1.5 x 1.5センチメートルのブリキの箱に移します。直ちに、組織切片を液体窒素で凍結し、20度の冷蔵庫に入れて保管します。次に、寒天を組織サンプルを含む小さなブロックにトリミングします。ブロックを10マイクロメートルのブロックに分割し、柔らかいブラシを使用して接着顕微鏡スライドにセクションを置きます。次に、切片を摂氏40度で45分間乾燥させ、使用するまで摂氏マイナス80度で保管します。環状グアノシン一リン酸またはcGMP染色の場合は、液体ブロッカーペンで乾燥した網膜切片の周りに疎水性リングを描き、サンプルを覆います。スライドを200マイクロリットルの0.3%PBSとTriton-X100またはPBSTに10分間浸した後、室温で200マイクロリットルのブロッキング溶液に1時間処理します。次に、ブロッキング溶液で調製した200マイクロリットルの一次抗体を摂氏4度で一晩サンプルスライドをインキュベートし、PBSで10分間3回すすぎます。スライドを200マイクロリットルの二次抗体中で室温で1時間インキュベートします。PBSを10分間3回洗浄した後、DAPIを含む退色防止封入剤でサンプルを覆い、イメージング前に摂氏4度で少なくとも30分間保存します。スライドを室温で15分間乾燥させ、液体ブロッカーペンで網膜組織標本の周りに撥水性バリアリングを引きます。40ミリリットルのPBSと15分間インキュベートした後、切片を42ミリリットルの0.05モルトリスバッファーまたはTBSで摂氏37度で処理します。TBSを吸引し、サンプルを6マイクロリットルのプロテイナーゼKで5分間インキュベートし、スライドをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。スライドをチャップリン中の40ミリリットルのエタノール酢酸溶液にさらします。透明なシートで覆い、マイナス20°Cで5分間インキュベートします。毎回5分間、TBSでスライドを3回洗います。スライドを200〜300マイクロリットルのブロッキング溶液または1%BSAにさらし、湿度チャンバー内で1時間インキュベートします。スライドあたり約130マイクロリットルのTMR赤色溶液で、1時間後に、200マイクロリットルのPBSをそれぞれ5分間2回洗浄します。DAPIを含む1〜2滴の退色防止封入剤を含むカバースライドをサンプルの上に置き、イメージングの前にスライドを摂氏4度で少なくとも30分間インキュベートします。トンネルとcGMPで連続染色した後、カメラのパラメータを調整して光学顕微鏡と蛍光顕微鏡に進みます。各セクションの4つのフィールドの画像を、20倍の倍率でデジタルカメラを備えたソフトウェアを使用してキャプチャします。DAPI、EGFP、TMRを使用して網膜の中央領域から代表的な画像を取得し、zスタックスキャンと1マイクロメートルの間隔を1マイクロメートル、オプションで1.251マイクロメートルにします。異なる濃度のPDE6阻害剤Zaprinastで処理した網膜外植片では、対照群と比較して、トンネルおよびcGMP陽性細胞数が外顆粒層で強く増加した。トンネル陽性細胞の割合が高いことは、cGMP活性の増加が巣前誘導網膜細胞変性を増強し、cGMP蓄積が光受容体変性に役割を果たす可能性があることを示唆した。外植片の準備はできるだけ早く行わなければなりません。Op動物は、細胞の生存を改善し、バルクスタックシリーズの繊維の状態を高めるため、5つおよび任意の蓄積を散布します。目に見える最大限に、硝子体はステロイドできれいにされるべきです。機械的細胞損傷を防ぐために、網膜外植片を移植するときは網膜神経線維層との接触を避けてください。網膜外植片を培養インサートにスムーズに移すために、網膜組織を移す前にペットを何かにあらかじめ浸して湿らせておくことができます。さらに、プロセス中の汚染を避けるために、プロセス全体をステロイド雰囲気で実行する必要があります。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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