Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81960180), Zinke 유산 재단, Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구에 사용된 원숭이 안구를 공유해 주신 Longbao Lv 교수(중국 쿤밍 중국과학원 동물학 연구소)에게 감사드립니다.

동물 연구는 중국과학원 동물학 연구소 윤리 검토 위원회(IACUC-PE-2022-06-002)와 윈난대학교 동물 윤리 검토 및 동물 프로토콜(YNU20220149)의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. 망막 체외이식편의 제조
<ol><li>1세에서 3세 사이의 야생형 원숭이에서 영장류 안구를 채취하여 조직 저장 용액에 보관하고 원숭이를 희생시킨 후 또는 자연사 후 적출 후 3시간 이내에 얼음 위에서...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

시각적 광변환은 눈의 망막 내에 있는 광수용체 세포에 의해 광 신호가 전기 신호로 변환되는 생물학적 과정을 말합니다. 광수용체 세포는 광변환이 가능한 편광 뉴런이며, 외부 세그먼트의 모양을 따서 간상체와 원뿔이라고 하는 두 가지 유형의 광수용체가 있습니다. 막대는 scotopic 시력을 담당하고 원뿔은 사진 및 고시력 시력을 담당합니다. 유전성 RD는 진행성 망막 광수용체 세포 사멸을 특징?...

유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 하며 다양한 병원성 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다1. RD의 최종 결과는 시력 상실이며 대부분의 경우 질병은 오늘날까지 치료할 수 없습니다. 따라서, 인간의 질병 상태를 충실하게 나타내는 모델을 사용하여 광수용체 사멸로 이어지는 세포 메커니즘을 연구하는 것이 중요합니다. 여기서 영장류 기반 모델은 인간과의 친밀감 때문에 특히 중요합니다. 특히, 이러한 모델은 광수용체 세포 사멸을 중단시키거나 지연시킬 수 있는 적절한 치료 개입의 개발을 진전시킬 수 있습니다.
RD의 세포 사멸 메커니즘에 대한 이전 연구에서는 RD 유발 유전자 돌연변이로 인한 포스포디에스테라제 6(PDE6) 활성의 감소 또는 손실이 고리형 구아노신 일인산(cGMP)의 가수분해를 감소시킨다는 것을 입증했습니다.2,3. cGMP는 막대 바깥쪽 세그먼트(ROS)에 있는 고리형 뉴클레오티드 개폐 이온 채널(CNGCs)의 특이적 작용제이며, 척추동물 광수용체 세포에서 광 신호를 전기 신호로 변환하는 역할을 하는 핵심 분자이기도 하다4. cGMP 가수 분해가 감소하면 ROS에 cGMP가 축적되어 CNGC가 개방된다 5. 결과적으로, 광변환 경로가 활성화되어 광수용체 세포에서 양이온 농도가 증가합니다. 이 과정은 광수용체에 대사 부담을 부과하며, 예를 들어 PDE6의 돌연변이에 의해 과잉 활성화되면 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.
많은 연구에서 RD 유전자 돌연변이가 다른 마우스 모델의 광수용체에서 cGMP의 상당한 과다 축적이 cGMP 의존성 단백질 키나아제(PKG)의 활성화를 유발할 수 있음을 보여주었습니다3,6. 이것은 죽어가는 TUNEL 양성 세포의 상당한 증가와 광수용체 세포층의 점진적인 얇아짐으로 이어집니다. 이전의 연구들은 상승된 cGMP 수치에 의한 PKG 과잉활성화가 광수용체 세포사멸의 유도를 위한 필요충분조건임을 시사한다 2,5. RD의 상이한 마우스 모델에 대한 연구는 또한 광수용체에서 상승된 cGMP 수준에 의해 유도된 PKG 활성화가 폴리-ADP-리보스 중합효소 1 (PARP1), 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 및 칼파인 2,7,8,9와 같은 다운스트림 이펙터의 과활성화를 유도한다는 것을 보여주었다. 이것은 이러한 서로 다른 표적 단백질과 광수용체 세포 사멸 사이의 인과 관계를 의미합니다.
그러나 RD의 병리학, 독성 약리학 및 치료에 대한 이전 연구는 주로 RD10,11,12에 대한 마우스 모델을 기반으로 했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 결과의 임상 번역에는 엄청난 어려움이 남아 있습니다. 이것은 특히 망막 구조와 관련하여 생쥐와 인간 사이의 상당한 유전적, 생리학적 차이 때문입니다. 대조적으로, 비인간 영장류(NHP)는 유전적 특성, 생리학적 패턴 및 환경 요인 조절과 관련하여 인간과 높은 수준의 유사성을 공유합니다. 예를 들어, 광유전학적 요법은 NHP 모델13에서 망막 활성을 회복시키는 수단으로서 조사되었다. Lingam과 동료들은 우수 제조 관행 등급의 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 망막 광수용체 전구체 세포가 NHP14에서 원추형 광수용체 손상을 구제할 수 있음을 입증했습니다. 따라서 NHP 모델은 RD 발병기전의 탐색과 효과적인 치료 방법의 개발에 중요합니다. 특히, 인간과 유사한 병원성 기전을 나타내는 RD의 NHP 모델은 신약의 개발 및 생체 내 독성 약리학 분석에 대한 연구에서 중요한 역할을 할 수 있습니다.
긴 수명 주기, 높은 수준의 기술적 어려움 및 생체 내 영장류 모델 구축과 관련된 높은 비용을 고려하여 이식된 원숭이 망막의 배양을 사용하여 시험관 내 비인간 영장류(NHP) 모델을 확립했습니다. 먼저, 망막-RPE-맥락막 복합체를 포함하는 망막 외식편의 시험관 내 배양을 위해 1-3세의 야생형 원숭이를 선택했습니다. 이어서, 체외이식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트(100 μM, 200 μM 및 400 μM)로 처리하여 cGMP-PKG 신호전달 경로를 유도하였다. 광수용체 세포 사멸은 TUNEL 분석을 사용하여 정량화 및 분석하였으며, 외식편에서의 cGMP 축적은 면역형광을 통해 검증하였다. 원숭이와 인간 사이의 세포 분포 및 형태, 망막층 두께 및 망막의 기타 생리학적 특성과 관련하여 높은 수준의 유사성을 감안할 때, 시험관 내 망막 모델에서 cGMP-PKG 신호 전달 경로의 확립은 RD의 발병기전에 대한 향후 연구뿐만 아니라 RD 치료를 위한 신약의 개발 및 독성 약리학에 대한 연구를 촉진할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 합니다. 광수용체 세포에서 고리형 구아노신 일인산(cGMP) 의존성 단백질 키나아제(PKG) 경로의 과활성화는 특히 포스포디에스테라제 6b(PDE6b) 돌연변이가 있는 모델에서 광수용체 세포 사멸을 유발합니다. RD에 대한 이전 연구에서는 주로 rd1 또는 rd10 마우스와 같은 쥐 모델을 사용했습니다. 생쥐와 인간의 유전 적, 생리 학적 차이를 감안할 때, 영장류와 설치류의 망막이 어느 정도 비슷한지를 이해하는 것이 중요합니다. 원숭이는 인간과 높은 수준의 유전적 유사성을 공유합니다. 따라서 망막-망막 색소 상피(RPE)-맥락막 복합체를 포함하는 망막 외식편의 시험관 내 배양을 위해 야생형 원숭이(1-3세)를 선택했습니다. 이들 외식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트로 처리하여 cGMP-PKG 신호전달 경로를 유도하고 RD 병인을 시뮬레이션하였다. 영장류 망막 외식편에서의 cGMP 축적 및 세포 사멸은 후속적으로 면역형광 및 TUNEL 분석을 사용하여 검증하였다. 이 연구에서 확립된 영장류 망막 모델은 cGMP-PKG 의존성 RD의 메커니즘에 대한 적절하고 효과적인 연구와 향후 치료 접근법 개발에 도움이 될 수 있습니다.

이 연구에서는 망막-RPE-맥락막 복합체를 포함하는 외식편을 사용하여 원숭이 원숭이 망막 외식편 배양을 수행했습니다(그림 1, 보충 그림 S1). 부착된 RPE 및 맥락막이 없는 망막을 사용하는 망막 세포의 시험관 내 배양과 비교할 때, 당사의 체외이식편 배양은 더 나은 세포 생존을 촉진하고 따라서 광수용체 세포의 생존을 연장합니다.
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Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

야생형 원숭이로부터 얻은 망막 외식편을 시험관 내에서 배양하였다. 망막 변성 및 cGMP-PKG 신호전달 경로는 PDE6 억제제 zaprinast를 사용하여 유도하였다. 상이한 자프리나스트 농도에서 외식편에서의 cGMP 축적은 면역형광법을 사용하여 검증하였다.

원숭이 원숭이의 Organotypic Retinal Explant 배양

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

본 연구에서 확립된 영장류 망막 모델은 cGMP-PKG 의존성 망막 열화의 포괄적인 메커니즘 및 치료 개발에 대한 조사를 제공합니다. 이 개별 비인간 영장류 모델은 망막 조직 확인 및 세포간 상호작용을 보유하여 생체 내 조건을 더 잘 시뮬레이션할 수 있습니다. 또한 동물 사용을 줄이고 실험 기간을 단축합니다.망막 발달 또는 변성을 조사하기 위한 대조 실험적 접근법을 제공합니다. 야생형 원숭이에서 분리된 안구를 10밀리리터의 5% 포비돈 요오드로 30초 동안 세척하여 망막 외식편 준비를 시작합니다. 박테리아 오염을 방지하려면 안구를 5% 페니실린 스트렙토마이신 PBS 용액에 1분 동안 담근 후 10밀리리터의 R16 배지에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 예열된 단백질 Ace-K 용액 10ml에 안구를 담그고 2분 동안 배양합니다. 1 대 1 R16 플러스 태아 소 혈청 용액 10 밀리리터에서 5 분 동안 다음 배양을 수행하십시오. 신선한 R16 10 밀리리터로 최종 세척하십시오.완료되면 공막, 각막, 홍채, 수정체 및 유리체를 분리합니다. 그런 다음 핀셋과 가위로 4면에서 망막을 자릅니다. 다음으로, 4 밀리리터 나무의 미세한 칼날을 사용하여 비강 쪽에서 1.5 밀리미터, 측두에서 4 밀리미터, 시신경 머리의 위쪽과 아래쪽에서 2 밀리미터에서 망막 이식편을 자릅니다.이어서, 6 밀리미터 나무의 가는 칼날을 사용하여 시신경과 황반을 포함하는 망막 외식편의 중앙을 절단한다. 넓은 피펫을 사용하여 망막과 맥락막이 포함된 망막 체외이식편을 당겨 광수용체 면이 위로 향하도록 하여 삽입물 중앙에 놓습니다. 멤브레인 아래의 판에 있는 완전한 배지 1밀리리터에 망막을 완전히 담그십시오.망막 체외이식편을 배양하고 가습된 5% 이산화탄소가 있는 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 4 일 동안 외식편에 적절한 약물 농도 처리를하십시오. 치료 조건당 최소 3개의 외식편을 사용하고 약물 없이 외식편을 양성 대조군으로 사용하십시오.고정 및 냉동 절편을 위해, 망막 체외이식편을 1밀리리터의 파라폼 알데히드로 45분 동안 처리한다. 1밀리리터의 PBS로 간단히 헹군 후, 체외이식편을 10분 동안 10% 수크로오스, 20분 동안 20% 슈크로스, 30분 동안 30% 슈크로오스에서 연속적으로 배양합니다. 망막 외식편을 주변에 4개의 사분면과 중앙에 6mm로 균일하게 절단합니다.그런 다음 망막 외식편을 약 1.5 x 1.5 x 1.5cm의 주석 상자로 옮기고 체외편을 덮는 최적 절단 온도 복합 포매 배지를 사용합니다. 즉시 조직 부분을 액체 질소로 얼리고 20도 냉장고에 보관하여 보관하십시오. 다음으로, 한천을 조직 샘플이 들어 있는 작은 블록으로 자릅니다.블록을 10마이크로미터 블록으로 분할하고 부드러운 브러시를 사용하여 접착 현미경 슬라이드에 섹션을 놓습니다. 그런 다음 섭씨 40도에서 45 분 동안 섹션을 건조시키고 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 순환 구아노신 모노포스페이트 또는 cGMP 염색의 경우 액체 차단제 펜으로 건조된 망막 섹션 주위에 소수성 링을 그리고 샘플을 덮습니다.슬라이드를 200 마이크로리터의 0.3% PBS 및 트리톤-X100 또는 PBST에 10분 동안 담근 후, 실온에서 200 마이크로리터의 블로킹 용액에 1시간 처리한다. 다음으로, 블로킹 용액에 준비된 200 마이크로리터의 1차 항체와 함께 샘플 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양하고 PBS로 10분 동안 3회 헹굽니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 2차 항체 200 마이크로리터에서 인큐베이션한다.PBS를 10분 동안 3회 세척한 후 DAPI를 함유하는 페이드 방지 장착 매체로 샘플을 덮고 이미징 전에 섭씨 4도에서 최소 30분 동안 보관합니다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 건조시키고 액체 차단제 펜으로 망막 조직 표본 주위에 발수 장벽 링을 그립니다. 40 밀리리터의 PBS로 15 분 동안 배양 한 후, 섭씨 37도에서 42 밀리리터의 0.05 몰 트리스 버퍼 또는 TBS로 절편을 처리한다.TBS를 흡인하고, 샘플을 6 마이크로리터의 프로테이나제 K로 5분 동안 배양하고, 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 슬라이드를 채플린의 에탄올 아세트산 용액 40ml에 노출시킵니다. 투명 시트로 덮고 섭씨 영하 20도에서 5 분 동안 배양하십시오.매번 5 분 동안 TBS로 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 슬라이드를 200-300 마이크로 리터의 차단 용액 또는 1 % BSA에 노출시키고 습도 챔버에서 1 시간 동안 배양합니다. 슬라이드 당 대략 130 마이크로리터의 TMR 적색 용액에서 그리고 1시간 후, 각각 5분 동안 200 마이크로리터의 PBS를 2회 세척한다.샘플 위에 DAPI가 있는 페이드 방지 마운팅 배지 1-2방울이 들어 있는 커버 슬라이드를 놓고 이미징 전에 최소 30분 동안 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양합니다. 터널 및 cGMP로 순차적으로 염색한 후 카메라 파라미터를 조정하여 광 및 형광 현미경 검사를 진행하였다. 20x 배율의 디지털 카메라와 함께 소프트웨어를 사용하여 각 섹션에서 4개 필드의 이미지를 캡처합니다.DAPI, EGFP 및 TMR을 사용하여 z-스택 스캐닝과 1마이크로미터 간격 및 1.251마이크로미터에서 선택 사항으로 망막의 중앙 영역에서 대표 사진을 얻습니다. 상이한 농도의 PDE6 억제제 Zaprinast로 처리된 망막 외식편에서, 대조군에 비해 외부 핵층에서 터널 및 cGMP 양성 세포의 수가 강하게 증가하였다. 터널 양성 세포의 높은 비율은 cGMP 활성의 증가가 네스트 전 유도된 망막 세포 변성 및 cGMP 축적이 광수용체 변성에서 역할을 하는 것을 향상시킬 수 있음을 시사하였다.이식편 준비는 가능한 한 빨리 수행해야합니다. Op 동물은 세포 생존을 향상시키고 벌크 스택 시리즈의 섬유 상태를 향상시키기 때문에 임의의 축적을 산란시킨다. 유리체는 최대한 눈에 띄게 스테로이드로 세척해야합니다.기계적 세포 손상을 방지하기 위해 망막 외식편을 옮길 때 망막 신경 섬유층과 접촉하지 마십시오. 망막 외식편을 배양 삽입물로 원활하게 옮기기 위해 애완 동물을 망막 조직을 옮기기 전에 촉촉하게 유지하기 위해 미리 담글 수 있습니다. 또한 전체 공정은 공정 중 오염을 피하기 위해 스테로이드 분위기에서 수행되어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

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연구

신경과학

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Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

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배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

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