Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), Zinke heritage foundation, og Charlotte og Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Vi takker Prof. Longbao Lv (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Kina) for å dele apeøyebollene som ble brukt i denne studien.

Dyrestudien ble gjennomgått og godkjent av Ethics Review Committee of Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002), og dyreetikkgjennomgang og dyreprotokoll fra Yunnan University (YNU20220149).
1. Fremstilling av retinal explants
<ol><li>Få primatøyeboller fra villtype makaker, i alderen 1 til 3 år, lagre i vevslagringsløsning, og transport på is innen 3 timer etter enukleasjon etter at apene ble ofret eller etter naturlig død.</li>
	<li>Fo...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

Visuell fototransduksjon refererer til den biologiske prosessen der lyssignaler omdannes til elektriske signaler av fotoreceptorceller i øyets netthinne. Fotoreceptorceller er polariserte nevroner som er i stand til fototransduksjon, og det finnes to forskjellige typer fotoreceptorer kalt stenger og kegler etter formene til deres ytre segmenter. Stenger er ansvarlige for skotopisk syn og kjegler er ansvarlige for fotopisk og høy skarphetssyn. Arvelig RD relaterer seg til nevrodegenerative sykdommer karakterisert ved pr...

Arvelig retinal degenerasjon (RD) er preget av progressiv fotoreceptorcelledød og er forårsaket av mutasjoner i et bredt spekter av patogene gener1. Sluttresultatet av RD er synstap, og i de aller fleste tilfeller forblir sykdommen uhelbredelig til denne dagen. Derfor er det viktig å studere de cellulære mekanismene som fører til fotoreceptordød ved hjelp av modeller som trofast representerer den menneskelige sykdomstilstanden. Her er primatbaserte modeller av spesiell interesse på grunn av deres nærhet til mennesker. Spesielt kan slike modeller fremme utviklingen av passende terapeutiske inngrep som kan stoppe eller forsinke fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning på mekanismene for celledød i RD har vist at reduksjon eller tap av fosfodiesterase 6 (PDE6) aktivitet forårsaket av RD-utløsende genmutasjoner fører til redusert hydrolyse av syklisk guanosinmonofosfat (cGMP) 2,3. cGMP er en spesifikk agonist av de sykliske nukleotid-styrte ionkanalene (CNGC) i stavens ytre segmenter (ROS) og er også et nøkkelmolekyl som er ansvarlig for konvertering av lyssignaler til elektriske signaler i virveldyrfotoreceptorceller4. Redusert cGMP-hydrolyse forårsaker akkumulering av cGMP i ROS, noe som fører til åpningen av CNGC 5. Følgelig aktiveres fototransduksjonsveiene, noe som resulterer i en økning i kationkonsentrasjoner i fotoreceptorceller. Denne prosessen påfører fotoreseptorer en metabolsk byrde, som når de overaktiveres, for eksempel ved mutasjoner i PDE6, kan forårsake celledød.
Mange studier har vist at en signifikant overakkumulering av cGMP i fotoreseptorer av musemodeller med forskjellige RD-genmutasjoner kan forårsake aktivering av cGMP-avhengig proteinkinase (PKG)3,6. Dette fører til en betydelig økning i døende, TUNEL-positive celler og en gradvis tynning av fotoreseptorcellelaget. Tidligere studier tyder på at PKG-overaktivering forårsaket av forhøyede cGMP-nivåer er en nødvendig og tilstrekkelig betingelse for induksjon av fotoreseptorcelledød 2,5. Studier på forskjellige musemodeller av RD har også vist at PKG-aktivering indusert av forhøyede cGMP-nivåer i fotoreseptorer, fører til overaktivering av nedstrøms effektorer som poly-ADP-ribosepolymerase 1 (PARP1), histondeacetylase (HDAC) og calpain 2,7,8,9. Dette innebærer årsakssammenhenger mellom disse forskjellige målproteinene og fotoreceptorcelledød.
Imidlertid var tidligere forskning på patologi, toksikofarmakologi og terapi av RD hovedsakelig basert på musemodeller for RD10,11,12. Likevel gjenstår enorme vanskeligheter i den kliniske oversettelsen av disse resultatene. Dette skyldes de betydelige genetiske og fysiologiske forskjellene mellom mus og mennesker, spesielt med hensyn til retinalstrukturen. I motsetning til dette deler ikke-menneskelige primater (NHP) også en høy grad av likhet med mennesker med hensyn til genetiske egenskaper, fysiologiske mønstre og miljøfaktorregulering. For eksempel ble optogenetisk terapi undersøkt som et middel for å gjenopprette retinal aktivitet i en NHP-modell13. Lingam og kolleger viste at god produksjonspraksis av menneskeindusert pluripotent stamcelleavledet retinal fotoreceptor-forløperceller kan redde keglefotoreceptorskader i NHP14. Derfor er NHP-modeller viktige for utforskning av RD-patogenese og utvikling av effektive behandlingsmetoder. Spesielt kan NHP-modeller av RD, som viser patogene mekanismer som ligner på mennesker, spille en kritisk rolle i studier på utvikling og in vivo toksikofarmakologianalyse av nye stoffer.
I lys av den lange livssyklusen, høye tekniske vanskeligheter og høye kostnader involvert i å etablere in vivo primatmodeller, etablerte vi en in vitro ikke-human primat (NHP) modell ved bruk av kulturer av eksplantet makaknetthinne. For det første ble villtypemakaker i alderen 1-3 år valgt for in vitro-kultur av retinale eksplanter, som inkluderte retina-RPE-choroid-komplekset. Eksplanter ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PDE6-hemmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM) for å indusere cGMP-PKG-signalveien. Fotoreseptorcelledød ble kvantifisert og analysert ved hjelp av TUNEL-analysen, og cGMP-akkumulering i eksplanter ble verifisert via immunfluorescens. Gitt den høye graden av likhet med hensyn til cellefordeling og morfologi, retinallagtykkelse og andre fysiologiske egenskaper av retina mellom aper og mennesker, kan etableringen av cGMP-PKG-signalveien i in vitro retinalmodellen lette fremtidig forskning på patogenesen av RD, samt studier av utvikling og toksikofarmakologi av nye legemidler til RD-behandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

Arvelig retinal degenerasjon (RD) er preget av progressiv fotoreceptorcelledød. Overaktivering av den sykliske guanosinmonofosfat (cGMP) -avhengige proteinkinase (PKG) -banen i fotoreceptorceller forårsaker fotoreceptorcelledød, spesielt i modeller som har fosfodiesterase 6b (PDE6b) mutasjoner. Tidligere studier på RD har hovedsakelig brukt murine modeller som rd1 eller rd10 mus. Gitt de genetiske og fysiologiske forskjellene mellom mus og mennesker, er det viktig å forstå i hvilken grad netthinnene til primater og gnagere er sammenlignbare. Macaques deler et høyt nivå av genetisk likhet med mennesker. Derfor ble villtypemakaker (i alderen 1-3 år) valgt for in vitro-kulturen av retinale eksplanter som inkluderte retina-retinal pigmentepitel (RPE)-choroid-komplekset. Disse eksplantene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PDE6-hemmeren zaprinast for å indusere cGMP-PKG-signalveien og simulere RD-patogenesen. cGMP-akkumulering og celledød i primater retinale eksplanter ble deretter verifisert ved hjelp av immunfluorescens og TUNEL-analysen. Primatretinalmodellen etablert i denne studien kan tjene til relevante og effektive studier av mekanismene for cGMP-PKG-avhengig RD, samt for utvikling av fremtidige behandlingsmetoder.

I denne studien ble Macaque monkey retinal explant kultur utført ved hjelp av eksplanter som inneholder retina-RPE-choroid-komplekset (figur 1, tilleggsfigur S1). Sammenlignet med in vitro-kulturen av retinale celler ved bruk av retina uten vedlagt RPE og choroid, letter vår eksplantkultur bedre celleoverlevelse og forlenger følgelig overlevelsen av fotoreceptorceller.
Vi brukte ulike konsentrasjoner av PDE6-hemmeren zaprinast (100 μM...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Retinal explants hentet fra villtype makaker ble dyrket in vitro. Netthinnegenerasjon og cGMP-PKG-signalveien ble indusert ved bruk av PDE6-hemmeren zaprinast. cGMP-akkumulering i eksplantene ved forskjellige zaprinastkonsentrasjoner ble verifisert ved bruk av immunfluorescens.

Organotypiske Retinal Explant Kulturer fra Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Primatretinalmodellen etablert i denne studien tilbyr undersøkelsen av den omfattende mekanismen og den terapeutiske utviklingen av cGMP-PKG-avhengig retinal forverring. Denne individuelle ikke-menneskelige primatmodellen reserverer retinal vevsbekreftelse og intercellulære interaksjoner som muliggjør bedre simulering av in vivo forhold. Det reduserer også dyrebruken, og det forkorter den eksperimentelle varigheten.Gi en kontrolleksperimentell tilnærming for å undersøke retinal utvikling eller degenerasjon. Begynn forberedelsen av retinal explants ved å vaske øyebollene isolert fra villtype makaker med 10 ml 5% povidonjod i 30 sekunder. For å unngå bakteriell forurensning, dypp øyebollene i en 5% penicillin streptomycin PBS-løsning i ett minutt før inkubering i 10 ml R16 medium i fem minutter.Deretter senkes øyebollene i 10 ml protein Ace-K-oppløsning, forvarmet ved 37 grader Celsius og inkubert i to minutter. Utfør neste inkubasjon i 10 ml av en til en R16 pluss føtal bovin serumløsning i fem minutter. Gi en siste vask i 10 ml fersk R16.Når du er ferdig, skille sclera, hornhinnen, iris, linsen og glasslegemet. Klipp deretter netthinnen fra fire sider med pinsett og saks. Deretter bruker du et fire milliliter tre fint blad for å kutte retinal explant på en 1,5 millimeter fra nesesiden, fire millimeter fra den tidlige siden og en to millimeter fra de øvre og nedre sidene av optisk nervehode.Deretter bruker du et seks millimeter tre fint blad som kutter den sentrale siden av retinal explant som inneholder optisk plate og makula. Bruk en bred pipet, trekk retina explant som inneholder retina og choroid og plasser den i midten av innsatsen med fotoreceptorsiden opp. Senk netthinnen helt ned i en milliliter av det komplette mediet på platen under membranen.Kultur retinal explants og plasser dem i en 37 graders Celsius inkubator med fuktet 5% karbondioksid. Gi riktig legemiddelkonsentrasjonsbehandling til eksplanter i fire dager. Bruk minst tre eksplanter per behandlingstilstand og bruk eksplantene uten stoffet som en positiv kontroll.For fiksering og kryo-seksjonering, behandle retinal explants med en milliliter paraform aldehyd i 45 minutter. Etter en kort skylling med en milliliter PBS inkuberer eksplantene serielt i 10% sukrose i 10 minutter, 20% sukrose i 20 minutter og 30% sukrose i 30 minutter. Klipp retinale eksplanter jevnt med fire kvadranter i periferien og seks millimeter i midten.Overfør deretter retinale eksplanter til en blikkboks på ca. 1,5 x 1,5 x 1,5 centimeter med et optimalt skjæretemperaturforbindelsesmedium som dekker eksplanten. Frys umiddelbart vevsseksjonene i flytende nitrogen og legg dem i et 20 graders kjøleskap for oppbevaring. Deretter trimmer agar i en liten blokk som inneholder vevsprøven.Seksjon blokkene i 10 mikrometer blokker og plasser seksjonene på adhesjonsmikroskoplysbilder ved hjelp av en myk børste. Tørk deretter seksjonene i 45 minutter ved 40 grader Celsius og oppbevar dem ved minus 80 grader Celsius til bruk. For syklisk guanosinmonofosfat eller cGMP-farging, tegne en hydrofob ring rundt de tørkede retinalseksjonene med en flytende blokkeringspenn og dekke prøvene.Fordyp lysbildene i 200 mikroliter 0,3% PBS og Triton-X100 eller PBST i 10 minutter etterfulgt av en times behandling i 200 mikroliter blokkeringsløsning ved romtemperatur. Deretter inkuberer prøven lysbildet over natten med 200 mikroliter primært antistoff fremstilt i blokkeringsløsningen ved fire grader Celsius og skyll det tre ganger med PBS i 10 minutter. Inkuber lysbildet i 200 mikroliter sekundært antistoff i en time ved romtemperatur.Etter tre vasker av PBS i 10 minutter, dekk prøvene med et antifademonteringsmedium som inneholder DAPI og oppbevar ved fire grader Celsius i minst 30 minutter før avbildning. Tørk lysbildet ved romtemperatur i 15 minutter og trekk en vannavvisende barrierering rundt netthinnevevsprøven med en flytende blokkeringspenn. Etter inkubering med 40 ml PBS i 15 minutter, behandle seksjonene med 42 ml 0, 05 molar tris-buffer eller TBS ved 37 grader Celsius.Aspirer TBS, inkuber prøvene med seks mikroliter proteinase K i fem minutter og vask lysbilder tre ganger med PBS i fem minutter hver. Utsett lysbildene til 40 ml etanol eddiksyreoppløsning i chaplin. Dekk det med et gjennomsiktig ark og inkuber ved minus 20 grader Celsius i fem minutter.Vask lysbildene tre ganger med TBS i fem minutter hver gang. Utsett lysbildene til 200 til 300 mikroliter blokkeringsløsning eller 1% BSA og inkuber dem i et fuktighetskammer i en time. Ved omtrent 130 mikroliter TMR-rød oppløsning per lysbilde og etter en time, gi to vasker på 200 mikroliter PBS i fem minutter hver.Plasser dekklysbilder som inneholder en til to dråper antifademonteringsmedium med DAPI over prøvene og inkuber lysbildene ved fire grader Celsius i minst 30 minutter før avbildning. Etter sekvensiell farging med tunnel og cGMP, fortsett for lys- og fluorescensmikroskopi ved å justere kameraparametrene. Ta bilder av fire felt fra hver seksjon ved hjelp av programvaren med et digitalkamera ved 20x forstørrelse.Få representative bilder fra de sentrale områdene av netthinnen ved hjelp av DAPI, EGFP og TMR med z-stack-skanning og et intervall på en mikrometer og valgfritt ved 1.251 mikrometer. I retinale eksplanter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PDE6-hemmerne Zaprinast var antall tunnel- og cGMP-positive celler sterkt økt i det ytre nukleære laget sammenlignet med kontrollgruppen. Den høye andelen tunnelpositive celler antydet at økningen i cGMP-aktivitet kan forbedre pre-nest-indusert retinalcelledegenerasjon, og cGMP-akkumulering spiller en rolle i fotoreceptordegenerasjon.Explant forberedelse må utføres så snart som mulig. Op dyr scatter femmere og enhver akkumulering fordi det forbedrer celleoverlevelse og forbedrer statusen til fiber av bulk stack serien. I størst mulig grad synlig, bør glasslegemet rengjøres med steroider.Unngå å kontakte retinal nervefiberlagene når du overfører retinale eksplanter for å forhindre mekanisk celleskade. Vær oppmerksom på at for å utstede en jevn overføring av retinale eksplanter til kulturinnsatser, kan kjæledyret bli for-dyppet i noe for å holde det fuktig før du overfører retinal vev. I tillegg må hele prosessen utføres i steroidatmosfæren for å unngå forurensning under prosessen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonale Ventral midthjernen: Et system for å Study dopaminerge neuronal Development In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Eksplantasjon kulturer fra<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic skive kulturer til å studere oligodendrocyte Dynamics og myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen av Neurokar ombygging i Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Gransker Funksjonell Regeneration i organotypiske Ryggmargs Co-kulturer dyrket på Multi-elektrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...