Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
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Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81960180), da fundação de herança Zinke e da Fundação Charlotte e Tistou Kerstan, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Agradecemos ao Prof. Longbao Lv (Instituto de Zoologia, Academia Chinesa de Ciências, Kunming, China) por compartilhar os globos oculares de macaco usados neste estudo.

O estudo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências (IACUC-PE-2022-06-002), e revisão de ética animal e protocolo animal da Universidade de Yunnan (YNU20220149).
1. Preparação de explantes de retina
<ol><li>Obter globos oculares de primatas de macacos selvagens, com idades entre 1 e 3 anos de idade, armazenar em solução de armazenamento de tecidos e transportá-los no gelo dentro de 3 h ap...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

A fototransdução visual refere-se ao processo biológico pelo qual os sinais luminosos são convertidos em sinais elétricos por células fotorreceptoras dentro da retina do olho. As células fotorreceptoras são neurônios polarizados capazes de fototransdução, e existem dois tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastonetes e cones após as formas de seus segmentos externos. Os bastões são responsáveis pela visão escotópica e os cones são responsáveis pela visão fotópica e de alta acuidade. A DR h...

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras e causada por mutações em uma grande variedade de genes patogênicos1. O resultado final da DR é a perda da visão e, na grande maioria dos casos, a doença permanece intratável até hoje. Portanto, é importante estudar os mecanismos celulares que levam à morte dos fotorreceptores usando modelos que representem fielmente a condição da doença humana. Aqui, os modelos baseados em primatas são de particular interesse devido à sua proximidade com os humanos. Notadamente, tais modelos podem avançar no desenvolvimento de intervenções terapêuticas apropriadas que possam deter ou retardar a morte celular dos fotorreceptores.
Pesquisas prévias sobre os mecanismos de morte celular na DR demonstraram que a diminuição ou perda da atividade da fosfodiesterase 6 (PDE6) causada por mutações no gene desencadeante da DR leva à redução da hidrólise do monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)2,3. O GMPc é um agonista específico dos canais iônicos dependentes de nucleotídeo cíclico (CNGCs) nos segmentos externos dos bastonetes (ROSs) e também é uma molécula-chave responsável pela conversão de sinais luminosos em sinais elétricos em células fotorreceptoras devertebrados4. A hidrólise reduzida do GMPc causa o acúmulo de GMPc em ROSs, levando à abertura de CNGCs 5. Consequentemente, as vias de fototransdução são ativadas, resultando em um aumento nas concentrações de cátions nas células fotorreceptoras. Esse processo impõe uma carga metabólica aos fotorreceptores, que quando superativados, por exemplo, por mutações na PDE6, podem causar morte celular.
Muitos estudos têm demonstrado que um acúmulo significativo de GMPc em fotorreceptores de modelos de camundongos com diferentes mutações no gene da DR pode causar a ativação da proteína quinase dependente de GMPc (PKG)3,6. Isso leva a um aumento substancial de células TUNEL-positivas e a um afinamento gradual da camada de células fotorreceptoras. Estudos prévios sugerem que a superativação de PKG causada por níveis elevados de GMPc é uma condição necessária e suficiente para a indução de morte de células fotorreceptoras 2,5. Estudos em diferentes modelos murinos de DR também mostraram que a ativação de PKG induzida por níveis elevados de GMPc em fotorreceptores leva à superativação de efetores a jusante, como poli-ADP-ribose polimerase 1 (PARP1), histona desacetilase (HDAC) e calpaína 2,7,8,9. Isso implica associações causais entre essas diferentes proteínas-alvo e a morte de células fotorreceptoras.
No entanto, pesquisas anteriores sobre a patologia, toxicofarmacologia e terapia da DR foram baseadas principalmente em modelos murinos para DR10,11,12. No entanto, ainda persistem imensas dificuldades na tradução clínica desses resultados. Isso se deve às consideráveis diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, especialmente no que diz respeito à estrutura da retina. Em contraste, primatas não humanos (NHPs) também compartilham um alto grau de similaridade com humanos no que diz respeito a características genéticas, padrões fisiológicos e regulação de fatores ambientais. Por exemplo, a terapia optogenética foi investigada como um meio de restaurar a atividade retiniana em um modelo de PNH13. Lingam e seus colegas demonstraram que as células precursoras de fotorreceptores da retina derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de boa prática de fabricação podem resgatar danos ao fotorreceptor do cone no NHP14. Portanto, modelos de PNH são importantes para a exploração da patogênese da DR e o desenvolvimento de métodos de tratamento eficazes. Em particular, modelos de PNH de DR, exibindo mecanismos patogênicos semelhantes aos de humanos, poderiam desempenhar um papel crítico em estudos sobre o desenvolvimento e análise toxicofarmacológica in vivo de novos fármacos.
Tendo em vista o longo ciclo de vida, o alto nível de dificuldades técnicas e o alto custo envolvido no estabelecimento de modelos in vivo de primatas, estabelecemos um modelo in vitro de primata não humano (NHP) usando culturas de retina de macaco explantado. Primeiramente, macacos selvagens com idade entre 1 e 3 anos foram selecionados para cultivo in vitro de explantes da retina, que incluíram o complexo retina-EPR-coróide. Os explantes foram então tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) para induzir a via de sinalização GMP-PKG. A morte de células fotorreceptoras foi quantificada e analisada pelo ensaio TUNEL e o acúmulo de GMPc nos explantes foi verificado por imunofluorescência. Dado o alto grau de similaridade com relação à distribuição e morfologia celular, espessura da camada retiniana e outras características fisiológicas da retina entre macacos e humanos, o estabelecimento da via de sinalização GMPc-PKG no modelo retiniano in vitro pode facilitar futuras pesquisas sobre a patogênese da DR, bem como estudos sobre o desenvolvimento e toxicofarmacologia de novas drogas para o tratamento da DR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras. A superativação da via da proteína quinase dependente de guanosina monofosfato (GMPc) cíclica (PKG) em células fotorreceptoras causa morte celular fotorreceptora, especialmente em modelos que abrigam mutações na fosfodiesterase 6b (PDE6b). Estudos prévios sobre DR utilizaram principalmente modelos murinos, como camundongos rd1 ou rd10 . Dadas as diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, é importante entender até que ponto as retinas de primatas e roedores são comparáveis. Os macacos compartilham um alto nível de semelhança genética com os seres humanos. Portanto, macacos selvagens (com idade entre 1-3 anos) foram selecionados para o cultivo in vitro de explantes da retina que incluíram o complexo retina-epitélio pigmentar da retina (EPR)-coroide. Esses explantes foram tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast para induzir a via de sinalização GMPc-PKG e simular a patogênese da DR. O acúmulo de GMPc e a morte celular em explantes de retina de primatas foram posteriormente verificados usando imunofluorescência e o ensaio TUNEL. O modelo de retina de primatas estabelecido neste estudo pode servir para estudos relevantes e efetivos sobre os mecanismos da DR dependente de GMPc-PKG, bem como para o desenvolvimento de futuras abordagens de tratamento.

Neste estudo, a cultura de explantes de retina de macacos macacos foi realizada utilizando explantes contendo o complexo retina-EPR-coróide (Figura 1, Figura Suplementar S1). Em comparação com a cultura in vitro de células da retina usando a retina sem o EPR e a coroide anexados, nossa cultura de explantes facilita uma melhor sobrevivência celular e, consequentemente, prolonga a sobrevivência das células fotorreceptoras.
Foram util...

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Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Explantes retinianos obtidos de macacos selvagens foram cultivados in vitro. A degeneração retiniana e a via de sinalização GMPc-PKG foram induzidas com o uso do inibidor de PDE6 zaprinast. O acúmulo de GMPc nos explantes em diferentes concentrações de zaprinast foi verificado por imunofluorescência.

Culturas organotípicas de explantes da retina de macacos

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

O modelo de retina de primata estabelecido neste estudo oferece a investigação do mecanismo abrangente e o desenvolvimento terapêutico da deterioração retiniana dependente de GMPc-PKG. Este modelo individual de primatas não humanos reserva a confirmação do tecido retiniano e interações intercelulares, o que permite uma melhor simulação das condições in vivo. Também reduz o uso de animais e encurta a duração experimental.Fornecer uma abordagem experimental de controle para investigar o desenvolvimento ou degeneração da retina. Comece a preparação dos explantes da retina lavando os globos oculares isolados de macacos selvagens com 10 mililitros de iodo a 5% de povidona por 30 segundos. Para evitar a contaminação bacteriana, mergulhe os globos oculares em uma solução PBS de estreptomicina de penicilina a 5% por um minuto antes da incubação em 10 mililitros de meio R16 por cinco minutos.Em seguida, mergulhe os globos oculares em 10 mililitros de solução de proteína Ace-K pré-aquecida a 37 graus Celsius e incubada por dois minutos. Realizar a próxima incubação em 10 mililitros de um a um R16 mais soro fetal bovino por cinco minutos. Dê uma lavagem final em 10 mililitros de R16 fresco.Uma vez feito, separe a esclera, córnea, íris, cristalino e vítreo do corpo. Em seguida, corte a retina de quatro lados com pinça e tesoura. Em seguida, use uma lâmina fina de árvore de quatro mililitros para cortar o explante da retina a 1,5 milímetro do lado nasal, quatro milímetros do lado temporal e dois milímetros dos lados superior e inferior da cabeça do nervo óptico.Em seguida, usando uma lâmina fina de árvore de seis milímetros, corte o lado central do explante da retina contendo o disco óptico e a mácula. Usando uma pipeta larga, puxe o explante de retina contendo a retina e a coroide e coloque-o no meio da inserção com o lado do fotorreceptor para cima. Submergir totalmente a retina em um mililitro do meio completo na placa abaixo da membrana.Cultivar os explantes da retina e colocá-los em uma incubadora de 37 graus Celsius com dióxido de carbono umidificado a 5%. Dê o tratamento de concentração de droga apropriado para explantes por quatro dias. Usar pelo menos três explantes por condição de tratamento e usar os explantes sem a droga como controle positivo.Para fixação e criossecção, tratar os explantes da retina com um mililitro de aldeído paraforme por 45 minutos. Após uma breve lavagem com um mililitro de PBS, incubar os explantes em 10% de sacarose por 10 minutos, 20% de sacarose por 20 minutos e 30% de sacarose por 30 minutos. Cortar os explantes da retina uniformemente com quatro quadrantes na periferia e seis milímetros no centro.Em seguida, transfira os explantes da retina para uma caixa de estanho de cerca de 1,5 por 1,5 por 1,5 centímetros com um meio de incorporação composto de temperatura de corte ideal cobrindo o explante. Imediatamente, congele as seções de tecido em nitrogênio líquido e coloque-as em uma geladeira de 20 graus para armazenamento. Em seguida, corte o ágar em um pequeno bloco contendo a amostra de tecido.Sepasse os blocos em blocos de 10 micrômetros e coloque os cortes em lâminas de microscópio de adesão usando uma escova macia. Em seguida, seque as seções por 45 minutos a 40 graus Celsius e guarde-as a 80 graus Celsius negativos até usar. Para coloração de monofosfato de guanosina cíclica ou GMPc, desenhe um anel hidrofóbico ao redor das seções secas da retina com uma caneta bloqueadora de líquidos e cubra as amostras.Imergir as lâminas em 200 microlitros de PBS 0,3% e Triton-X100 ou PBST por 10 minutos, seguido de um tratamento de uma hora em 200 microlitros de solução de bloqueio à temperatura ambiente. Em seguida, incube a lâmina de amostra durante a noite com os 200 microlitros de anticorpo primário preparados na solução de bloqueio a quatro graus Celsius e lave-a três vezes com PBS por 10 minutos. Incubar a lâmina em 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente.Após três lavagens de PBS por 10 minutos, cubra as amostras com um meio de montagem antifade contendo DAPI e armazene a quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens. Seque a lâmina à temperatura ambiente por 15 minutos e desenhe um anel de barreira repelente de água ao redor do espécime de tecido da retina com uma caneta bloqueadora de líquidos. Após incubação com 40 mililitros de PBS por 15 minutos, tratar os cortes com 42 mililitros de tris-tampão 0,05 molar ou TBS a 37 graus Celsius.Aspirar a TBS, incubar as amostras com seis microlitros de proteinase K por cinco minutos e lavar as lâminas três vezes com PBS por cinco minutos cada. Expor as lâminas a 40 mililitros de solução de etanol ácido acético no chaplin. Cubra com uma folha transparente e incube a menos 20 graus Celsius por cinco minutos.Lave as lâminas três vezes com TBS por cinco minutos cada vez. Expor as lâminas a 200 a 300 microlitros de solução de bloqueio ou BSA a 1% e incubá-las em uma câmara de umidade por uma hora. A aproximadamente 130 microlitros de solução vermelha TMR por lâmina e após uma hora, dê duas lavagens de 200 microlitros de PBS por cinco minutos cada.Coloque lâminas contendo uma a duas gotas de meio de montagem antifade com DAPI sobre as amostras e incube as lâminas a quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens. Após a coloração sequencial com túnel e GMPc, proceda à microscopia de luz e fluorescência, ajustando os parâmetros da câmera. Capture as imagens de quatro campos de cada seção usando o software com uma câmera digital em aumento de 20x.Obtenha imagens representativas das áreas centrais da retina usando DAPI, EGFP e TMR com varredura z-stack e um intervalo de um micrômetro e opcional em 1.251 micrômetros. Nos explantes retinianos tratados com diferentes concentrações dos inibidores da PDE6 Zaprinast, o número de células positivas para túnel e GMPc aumentou fortemente na camada nuclear externa em comparação com o grupo controle. A alta proporção de células positivas para túnel sugeriu que o aumento na atividade do GMPc pode aumentar a degeneração celular da retina pré-ninho e o acúmulo de GMPc desempenha um papel na degeneração dos fotorreceptores.A preparação dos explantes deve ser efectuada o mais rapidamente possível. Op animal espalhar cinco e qualquer acumulação, porque melhora a sobrevivência celular e melhorar o status da fibra da série de pilha a granel. Até certo ponto, visível, o vítreo deve ser limpo com esteroides.Evite entrar em contato com as camadas de fibras nervosas da retina ao transferir explantes da retina para evitar lesão celular mecânica. Por favor, tome nota, para emitir uma transferência suave de explantes da retina para inserções de cultura, o animal de estimação pode ser pré-embebido em algo para mantê-lo úmido antes de transferir os tecidos da retina. Além disso, todo o processo deve ser realizado na atmosfera de esteroides para evitar a contaminação durante o processo.

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