Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 81960180), Фонда наследия Зинкэ и Фонда Шарлотты и Тистоу Керстан, Юньнаньского клинического медицинского центра глазных болезней (ZX2019-02-01). Мы благодарим профессора Лунбао Лю (Институт зоологии Китайской академии наук, Куньмин, Китай) за то, что он поделился глазными яблоками обезьян, использованными в этом исследовании.

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по этике Института зоологии Китайской академии наук (IACUC-PE-2022-06-002), а также обзором этики животных и протоколом животных Юньнаньского университета (YNU20220149).
1. Приготовление эксплантатов сетчатки
<ol><...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

Визуальная фототрансдукция относится к биологическому процессу, посредством которого световые сигналы преобразуются в электрические сигналы фоторецепторными клетками в сетчатке глаза. Фоторецепторные клетки представляют собой поляризованные нейроны, способные к фототрансдукции, ...

Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток и обусловлена мутациями в широком спектре патогенных генов1. Конечным результатом РД является потеря зрения, и в подавляющем большинстве случаев болезнь остается неизлечимой по сей день. Поэтому важно изучать клеточные механизмы, приводящие к гибели фоторецепторов, используя модели, которые точно представляют состояние болезни человека. Здесь особый интерес представляют модели, основанные на приматах, из-за их близости к человеку. Примечательно, что такие модели могут способствовать разработке соответствующих терапевтических вмешательств, которые могут остановить или отсрочить гибель фоторецепторных клеток.
Предыдущие исследования механизмов гибели клеток при РД показали, что снижение или потеря активности фосфодиэстеразы 6 (ФДЭ6), вызванная мутациями генов, запускающих РД, приводит к снижению гидролиза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ)2,3. цГМФ является специфическим агонистом циклических нуклеотид-управляемых ионных каналов (CNGC) во внешних сегментах стержней (АФК), а также ключевой молекулой, ответственной за преобразование световых сигналов в электрические сигналы в фоторецепторных клеткахпозвоночных 4. Восстановленный гидролиз цГМФ вызывает накопление цГМФ в АФК, что приводит к открытию КНГК 5. Следовательно, пути фототрансдукции активируются, что приводит к увеличению концентрации катионов в фоторецепторных клетках. Этот процесс налагает метаболическую нагрузку на фоторецепторы, которая при чрезмерной активации, например, мутациями в ФДЭ6, может вызвать гибель клеток.
Многие исследования показали, что значительное перенакопление цГМФ в фоторецепторах мышиных моделей с различными мутациями гена RD может вызывать активацию цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG)3,6. Это приводит к значительному увеличению умирающих, TUNEL-положительных клеток и постепенному истончению клеточного слоя фоторецепторов. Предыдущие исследования показывают, что гиперактивация ФКГ, вызванная повышенным уровнем цГМФ, является необходимым и достаточным условием для индукции гибели фоторецепторных клеток 2,5. Исследования на различных мышиных моделях РД также показали, что активация ПКГ, вызванная повышенными уровнями цГМФ в фоторецепторах, приводит к чрезмерной активации нижестоящих эффекторов, таких как поли-АДФ-рибоза-полимераза 1 (PARP1), гистондеацетилазы (HDAC) и кальпаин 2,7,8,9. Это подразумевает причинно-следственные связи между этими различными белками-мишенями и гибелью фоторецепторных клеток.
Однако предыдущие исследования патологии, токсикофармакологии и терапии РД были в основном основаны на мышиных моделях РД10,11,12. Тем не менее, остаются огромные трудности в клиническом переводе этих результатов. Это связано со значительными генетическими и физиологическими различиями между мышами и людьми, особенно в отношении структуры сетчатки. Напротив, нечеловекообразные приматы (NHP) также имеют высокую степень сходства с людьми в отношении генетических характеристик, физиологических моделей и регуляции факторов окружающей среды. Например, оптогенетическая терапия была исследована как средство восстановления активности сетчатки в моделиNHP 13. Лингам и его коллеги продемонстрировали, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки-предшественники сетчатки могут спасти повреждение колбочковых фоторецепторов в NHP14. Поэтому модели NHP важны для изучения патогенеза РД и разработки эффективных методов лечения. В частности, NHP-модели РД, демонстрирующие патогенные механизмы, сходные с таковыми у людей, могут сыграть решающую роль в исследованиях по разработке и токсикофармакологическому анализу in vivo новых лекарств.
Ввиду длительного жизненного цикла, высокого уровня технических трудностей и высоких затрат, связанных с созданием моделей приматов in vivo , мы создали модель инопланетных приматов (NHP) in vitro с использованием культур эксплантированной сетчатки макак. Во-первых, были отобраны макаки дикого типа в возрасте 1-3 лет для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro , которые включали комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка. Затем эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 (100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ), чтобы индуцировать сигнальный путь цГМФ-ПКГ. Гибель фоторецепторных клеток была количественно определена и проанализирована с помощью анализа TUNEL, а накопление цГМФ в эксплантах было проверено с помощью иммунофлуоресценции. Учитывая высокую степень сходства в отношении распределения и морфологии клеток, толщины слоя сетчатки и других физиологических характеристик сетчатки у обезьян и человека, установление сигнального пути цГМФ-ПКГ в модели сетчатки in vitro может способствовать будущим исследованиям патогенеза РД, а также исследованиям в области разработки и токсикофармакологии новых препаратов для лечения РД.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток. Чрезмерная активация пути циклической гуанозинмонофосфата (цГМФ)-зависимой протеинкиназы (PKG) в фоторецепторных клетках вызывает гибель фоторецепторных клеток, особенно в моделях, содержащих мутации фосфодиэстеразы 6b (PDE6b). В предыдущих исследованиях RD использовались в основном мышиные модели, такие как мыши rd1 или rd10 . Учитывая генетические и физиологические различия между мышами и людьми, важно понять, в какой степени сетчатка приматов и грызунов сопоставима. Макаки имеют высокий уровень генетического сходства с людьми. Таким образом, для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro были отобраны макаки дикого типа (в возрасте 1-3 лет), включающие комплекс сетчато-ретинальный пигментный эпителий (RPE)-сосудистая оболочка. Эти эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 для индукции сигнального пути цГМФ-ПКГ и моделирования патогенеза РД. Накопление цГМФ и гибель клеток в эксплантах сетчатки приматов были впоследствии проверены с помощью иммунофлюоресценции и анализа TUNEL. Модель сетчатки приматов, созданная в этом исследовании, может служить для актуальных и эффективных исследований механизмов цГМФ-PKG-зависимой РД, а также для разработки будущих подходов к лечению.

В этом исследовании культуру эксплантата сетчатки макаки проводили с использованием эксплантов, содержащих комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка (рис. 1, дополнительный рисунок S1). По сравнению с культивированием клеток сетчатки in vitro с использованием ?...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Эксплантаты сетчатки, полученные от макак дикого типа, культивировали in vitro. Дегенерацию сетчатки и сигнальный путь цГМФ-ФКГ индуцировали с помощью ингибитора ФДЭ6 запринаста. Накопление цГМФ в эксплантах при различных концентрациях запринаста верифицировали с помощью иммунофлюоресценции.

Органотипические культуры экплантатов сетчатки макаки

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Модель сетчатки приматов, установленная в этом исследовании, мы предлагаем исследование комплексного механизма и терапевтического развития цГМФ-ПКГ-зависимого ухудшения состояния сетчатки. Эта индивидуальная модель нечеловеческих приматов резервирует подтверждение ткани сетчатки и межклеточные взаимодействия, что позволяет лучше моделировать условия in vivo. Это также сокращает использование животных и сокращает продолжительность эксперимента.Обеспечение контрольного экспериментального подхода для исследования развития или дегенерации сетчатки. Начните приготовление эксплантатов сетчатки с промывания глазных яблок, выделенных от макак дикого типа, 10 миллилитрами 5%-ного повидон-йода в течение 30 секунд. Чтобы избежать бактериального заражения, окуните глазные яблоки в 5% раствор пенициллина стрептомицина PBS на одну минуту перед инкубацией в 10 миллилитрах среды R16 в течение пяти минут.Затем погружают глазные яблоки в 10 миллилитров раствора белка Ace-K, предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия и выдерживают в течение двух минут. Следующую инкубацию проведите в 10 миллилитрах один-кодного раствора R16 плюс раствор эмбриональной бычьей сыворотки в течение пяти минут. Дайте окончательно постирать в 10 миллилитрах свежего R16.После этого отделите склеру, роговицу, радужную оболочку, хрусталик и стекловидное тело. Затем разрежьте сетчатку с четырех сторон пинцетом и ножницами. Затем используйте тонкое лезвие из четырех миллилитров, чтобы разрезать эксплантат сетчатки на расстоянии 1,5 миллиметра от носовой стороны, четырех миллиметров от височной стороны и двух миллиметров от верхней и нижней сторон головки зрительного нерва.Затем с помощью шестимиллиметрового дерева тонким лезвием разрезают центральную сторону эксплантата сетчатки, содержащую диск зрительного нерва и макулу. Используя широкую пипетку, потяните эксплантат сетчатки, содержащий сетчатку и сосудистую оболочку, и поместите его в середину вставки фоторецепторной стороной вверх. Полностью погрузите сетчатку в один миллилитр полной среды на пластинке под мембраной.Культивируйте эксплантаты сетчатки и поместите их в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с увлажненным 5% углекислым газом. Дайте соответствующую концентрацию препарата для обработки эксплантатов в течение четырех дней. Используйте не менее трех эксплантатов в каждом состоянии лечения и используйте эксплантаты без препарата в качестве положительного контроля.Для фиксации и криосекционирования обработайте эксплантаты сетчатки одним миллилитром параформного альдегида в течение 45 минут. После кратковременного промывания одним миллилитром PBS последовательно инкубируют эксплантаты в 10%-ной сахарозе в течение 10 минут, 20%-ной сахарозе в течение 20 минут и 30%-ной сахарозе в течение 30 минут. Разрежьте ретинальные эксплантаты равномерно с четырьмя квадрантами на периферии и шестью миллиметрами в центре.Затем перенесите эксплантаты сетчатки в жестяную коробку размером примерно 1,5 на 1,5 на 1,5 сантиметра с оптимальной температурой резки составной среды, покрывающей эксплантат. Сразу же заморозьте срезы тканей в жидком азоте и поместите их в холодильник при температуре 20 градусов для хранения. Затем обрежьте агар на небольшой блок, содержащий образец ткани.Разделите блоки на блоки по 10 микрометров и поместите срезы на предметные стекла адгезионного микроскопа с помощью мягкой щетки. Затем высушите срезы в течение 45 минут при температуре 40 градусов по Цельсию и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию до использования. Для окрашивания циклическим гуанозинмонофосфатом или цГМФ нарисуйте гидрофобное кольцо вокруг высушенных участков сетчатки жидкой блокирующей ручкой и накройте образцы.Погрузите предметные стекла в 200 микролитров 0,3% PBS и Triton-X100 или PBST на 10 минут с последующей часовой обработкой в 200 микролитрах блокирующего раствора при комнатной температуре. Затем инкубируйте предметное стекло образца в течение ночи с 200 микролитрами первичного антитела, приготовленного в блокирующем растворе при четырех градусах Цельсия, и трижды промойте его PBS в течение 10 минут. Инкубируют предметное стекло в 200 микролитрах вторичного антитела в течение одного часа при комнатной температуре.После трех промывок PBS в течение 10 минут покройте образцы монтажной средой с защитой от выцветания, содержащей DAPI, и храните при температуре четыре градуса Цельсия не менее 30 минут перед визуализацией. Высушите предметное стекло при комнатной температуре в течение 15 минут и нарисуйте водоотталкивающее барьерное кольцо вокруг образца ткани сетчатки с помощью ручки-блокатора жидкости. После инкубации с 40 миллилитрами PBS в течение 15 минут обрабатывают срезы 42 миллилитрами 0,05 молярного трис-буфера или TBS при 37 градусах Цельсия.Аспирируйте TBS, инкубируйте образцы с шестью микролитрами протеиназы K в течение пяти минут и трижды промойте предметные стекла PBS по пять минут каждый. Подвергните предметные стекла воздействию 40 миллилитров раствора этиловой уксусной кислоты в чаплине. Накройте его прозрачным листом и выдерживайте при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение пяти минут.Трижды промойте предметные стекла с помощью TBS в течение пяти минут каждый раз. Подвергните предметные стекла воздействию 200-300 микролитров блокирующего раствора или 1% BSA и инкубируйте их во влажной камере в течение одного часа. Примерно 130 микролитров красного раствора TMR на предметное стекло и через час дайте две промывки по 200 микролитров PBS в течение пяти минут каждая.Нанесите на образцы предметные стекла, содержащие одну-две капли антибактериальной монтажной среды, с помощью DAPI и инкубируйте предметные стекла при четырех градусах Цельсия в течение не менее 30 минут перед визуализацией. После последовательного окрашивания туннелем и цГМФ приступают к световой и флуоресцентной микроскопии, регулируя параметры камеры. Сделайте снимки четырех полей из каждого раздела с помощью программного обеспечения с цифровой камерой с 20-кратным увеличением.Получение репрезентативных изображений из центральных областей сетчатки с помощью DAPI, EGFP и TMR со сканированием z-стека и интервалом в один микрометр и опционально на 1,251 микрометра. В эксплантах сетчатки, обработанных различными концентрациями ингибиторов ФДЭ6 «Запринаст», количество туннельных и цГМФ-положительных клеток во внешнем ядерном слое было сильно увеличено по сравнению с контрольной группой. Высокая доля туннель-положительных клеток позволяет предположить, что увеличение активности цГМФ может усиливать индуцированную до гнезда дегенерацию клеток сетчатки, а накопление цГМФ играет роль в дегенерации фоторецепторов.Подготовка эксплантата должна быть проведена как можно скорее. Op животные разбрасывают пятерки и любое накопление, потому что это улучшает выживаемость клеток и улучшает состояние волокна серии объемных стеков. В наибольшей степени видимое стекловидное тело должно быть очищено стероидами.Избегайте контакта со слоями нервных волокон сетчатки при переносе эксплантатов сетчатки, чтобы предотвратить механическое повреждение клеток. Обратите внимание, что для выдачи плавного переноса эксплантатов сетчатки на культуральные вставки питомца можно предварительно замочить во чем-нибудь, чтобы он оставался влажным перед переносом тканей сетчатки. Кроме того, весь процесс должен выполняться в атмосфере стероидов, чтобы избежать загрязнения во время процесса.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Органотипической гиппокампа культур фрагмент

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-электрод массив записей из нейронов Лавины в органотипической культур

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Нейронных культур эксплантов от<em&gt; Xenopus Хепориз</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Исследуя функциональное Регенерация в Органотипической спинного мозга сопредседателей культур, выращенных на нескольких электродов массивов

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...