Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81960180), la Fundación del Patrimonio Zinke y la Fundación Charlotte y Tistou Kerstan, Centro Médico Clínico de Enfermedades Oculares de Yunnan (ZX2019-02-01). Agradecemos al Prof. Longbao Lv (Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias, Kunming, China) por compartir los globos oculares de mono utilizados en este estudio.

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Revisión Ética del Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias (IACUC-PE-2022-06-002), y la revisión de ética animal y protocolo animal de la Universidad de Yunnan (YNU20220149).
1. Preparación de explantes retinianos
<ol><li>Obtener globos oculares de primates de macacos de tipo salvaje, de 1 a 3 años de edad, almacenar en solución de almacenamiento de tejidos y transportar en hielo dentro d...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

La fototransducción visual se refiere al proceso biológico por el cual las señales de luz se convierten en señales eléctricas por las células fotorreceptoras dentro de la retina del ojo. Las células fotorreceptoras son neuronas polarizadas capaces de fototransducción, y hay dos tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastones y conos después de las formas de sus segmentos externos. Los bastones son responsables de la visión escotópica y los conos son responsables de la visión fotópica y de alta agude...

La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva y es causada por mutaciones en una amplia variedad de genes patógenos1. El resultado final de la RD es la pérdida de visión y en la gran mayoría de los casos la enfermedad sigue siendo intratable hasta el día de hoy. Por lo tanto, es importante estudiar los mecanismos celulares que conducen a la muerte de los fotorreceptores utilizando modelos que representen fielmente la condición de la enfermedad humana. Aquí, los modelos basados en primates son de particular interés debido a su cercanía con los humanos. En particular, tales modelos pueden avanzar en el desarrollo de intervenciones terapéuticas apropiadas que pueden detener o retrasar la muerte de las células fotorreceptoras.
Investigaciones previas sobre los mecanismos de muerte celular en la DR han demostrado que la disminución o pérdida de la actividad de la fosfodiesterasa 6 (PDE6) causada por mutaciones del gen desencadenante de la DR conduce a una hidrólisis reducida del monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)2,3. El GMPc es un agonista específico de los canales iónicos dependientes de nucleótidos cíclicos (CNGC) en los segmentos externos de bastones (ROS) y también es una molécula clave responsable de la conversión de señales luminosas en señales eléctricas en células fotorreceptoras de vertebrados4. La hidrólisis reducida de cGMP provoca la acumulación de cGMP en ROS, lo que lleva a la apertura de CNGC 5. En consecuencia, las vías de fototransducción se activan, lo que resulta en un aumento de las concentraciones de cationes en las células fotorreceptoras. Este proceso impone una carga metabólica a los fotorreceptores, que cuando se sobreactivan, por ejemplo, por mutaciones en la PDE6, pueden causar la muerte celular.
Muchos estudios han demostrado que una sobreacumulación significativa de GMPc en fotorreceptores de modelos de ratón con diferentes mutaciones del gen RD puede causar la activación de la proteína quinasa dependiente de cGMP (PKG)3,6. Esto conduce a un aumento sustancial de las células moribundas positivas para TUNEL y un adelgazamiento gradual de la capa celular fotorreceptora. Estudios previos sugieren que la sobreactivación del PKG causada por niveles elevados de GMPc es una condición necesaria y suficiente para la inducción de la muerte celular fotorreceptora 2,5. Los estudios en diferentes modelos de ratón de RD también han demostrado que la activación de PKG inducida por niveles elevados de cGMP en fotorreceptores, conduce a la sobreactivación de efectores aguas abajo como la poli-ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), histona deacetilasa (HDAC) y calpaína 2,7,8,9. Esto implica asociaciones causales entre estas diferentes proteínas diana y la muerte celular fotorreceptora.
Sin embargo, la investigación previa sobre la patología, toxicofarmacología y terapia de la DR se basó principalmente en modelos de ratón para la DR10,11,12. Sin embargo, siguen existiendo inmensas dificultades en la traducción clínica de estos resultados. Esto se debe a las considerables diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, especialmente con respecto a la estructura retiniana. En contraste, los primates no humanos (NHP) también comparten un alto grado de similitud con los humanos con respecto a las características genéticas, los patrones fisiológicos y la regulación de los factores ambientales. Por ejemplo, la terapia optogenética fue investigada como un medio para restaurar la actividad retiniana en un modelo NHP13. Lingam y sus colegas demostraron que las células precursoras de fotorreceptores de retina derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos de buena fabricación pueden rescatar el daño de los fotorreceptores de cono en NHP14. Por lo tanto, los modelos de NHP son importantes para la exploración de la patogénesis de la DR y el desarrollo de métodos de tratamiento efectivos. En particular, los modelos NHP de DR, que exhiben mecanismos patogénicos similares a los de los humanos, podrían desempeñar un papel crítico en los estudios sobre el desarrollo y el análisis toxicofarmacológico in vivo de nuevos fármacos.
En vista del largo ciclo de vida, el alto nivel de dificultades técnicas y el alto costo involucrado en el establecimiento de modelos de primates in vivo , establecimos un modelo de primates no humanos in vitro (NHP) utilizando cultivos de retina de macaco explantada. En primer lugar, se seleccionaron macacos de tipo silvestre de 1 a 3 años para el cultivo in vitro de explantes de retina, que incluía el complejo retina-RPE-coroides. Los explantes se trataron con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM y 400 μM) para inducir la vía de señalización cGMP-PKG. La muerte celular fotorreceptora se cuantificó y analizó mediante el ensayo TUNEL, y la acumulación de cGMP en explantes se verificó mediante inmunofluorescencia. Dado el alto grado de similitud con respecto a la distribución celular y la morfología, el grosor de la capa retiniana y otras características fisiológicas de la retina entre monos y humanos, el establecimiento de la vía de señalización cGMP-PKG en el modelo retiniano in vitro puede facilitar futuras investigaciones sobre la patogénesis de la DR, así como estudios sobre el desarrollo y la toxicofarmacología de nuevos fármacos para el tratamiento de la DR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva. La sobreactivación de la vía de la proteína quinasa (PKG) dependiente de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) en las células fotorreceptoras causa la muerte celular fotorreceptora, especialmente en modelos que albergan mutaciones en la fosfodiesterasa 6b (PDE6b). Estudios previos sobre RD han utilizado principalmente modelos murinos como ratones rd1 o rd10 . Dadas las diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, es importante entender hasta qué punto las retinas de primates y roedores son comparables. Los macacos comparten un alto nivel de similitud genética con los humanos. Por lo tanto, se seleccionaron macacos de tipo silvestre (de 1 a 3 años) para el cultivo in vitro de explantes de retina que incluyeron el complejo retina-epitelio pigmentario retiniano (EPR)-coroides. Estos explantes fueron tratados con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast para inducir la vía de señalización cGMP-PKG y simular la patogénesis de la DR. La acumulación de cGMP y la muerte celular en explantes retinianos de primates se verificaron posteriormente mediante inmunofluorescencia y el ensayo TUNEL. El modelo retiniano de primates establecido en este estudio puede servir para estudios relevantes y efectivos sobre los mecanismos de DR dependientes de cGMP-PKG, así como para el desarrollo de futuros enfoques de tratamiento.

En este estudio, se realizó un cultivo de explante retiniano de mono macaco utilizando explantes que contenían el complejo retina-EPR-coroides (Figura 1, Figura Suplementaria S1). En comparación con el cultivo in vitro de células retinianas que utilizan la retina sin el EPR y la coroides adjuntos, nuestro cultivo de explante facilita una mejor supervivencia celular y, en consecuencia, prolonga la supervivencia de las células fotorreceptoras.
<p class="jove_...

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Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Los explantes retinianos obtenidos de macacos de tipo silvestre se cultivaron in vitro. La degeneración retiniana y la vía de señalización cGMP-PKG se indujeron utilizando el inhibidor de la PDE6 zaprinast. La acumulación de cGMP en los explantes a diferentes concentraciones de zaprinast se verificó mediante inmunofluorescencia.

Cultivos organotípicos de explante retiniano de mono macaco

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

El modelo retiniano de primates establecido en este estudio nos ofrece la investigación del mecanismo integral y el desarrollo terapéutico del deterioro retiniano dependiente de cGMP-PKG. Este modelo individual de primates no humanos reserva la confirmación del tejido retiniano y las interacciones intercelulares, lo que permite una mejor simulación de las condiciones in vivo. También reduce el uso de animales y acorta la duración experimental.Proporcionar un enfoque experimental de control para investigar el desarrollo o la degeneración de la retina. Comience la preparación de los explantes retinianos lavando los globos oculares aislados de macacos de tipo salvaje con 10 mililitros de yodo 5% povidona durante 30 segundos. Para evitar la contaminación bacteriana, sumerja los globos oculares en una solución de estreptomicina PBS de penicilina al 5% durante un minuto antes de la incubación en 10 mililitros de medio R16 durante cinco minutos.Luego sumerja los globos oculares en 10 mililitros de solución de proteína Ace-K precalentada a 37 grados centígrados e incubada durante dos minutos. Realice la siguiente incubación en 10 mililitros de uno a uno R16 más solución fetal de suero bovino durante cinco minutos. Dar un lavado final en 10 mililitros de R16 fresco.Una vez hecho esto, separe la esclerótica, la córnea, el iris, el cristalino y el cuerpo vítreo. Luego corta la retina de cuatro lados con pinzas y tijeras. A continuación, use una cuchilla fina de árbol de cuatro mililitros para cortar el explante retiniano a 1,5 milímetros del lado nasal, cuatro milímetros del lado temporal y dos milímetros de los lados superior e inferior de la cabeza del nervio óptico.Luego, utilizando una hoja fina de árbol de seis milímetros, corte el lado central del explante retiniano que contiene el disco óptico y la mácula. Con una pipeta ancha, tire del explante de retina que contiene la retina y la coroides y colóquelo en el centro del inserto con el lado del fotorreceptor hacia arriba. Sumerge completamente la retina en un mililitro del medio completo en la placa debajo de la membrana.Cultive los explantes de retina y colóquelos en una incubadora de 37 grados centígrados con dióxido de carbono humidificado al 5%. Administrar el tratamiento de concentración de fármaco adecuado para explantes durante cuatro días. Use al menos tres explantes por condición de tratamiento y use los explantes sin el medicamento como control positivo.Para la fijación y criosección, trate los explantes de retina con un mililitro de aldehído paraformado durante 45 minutos. Después de un breve enjuague con un mililitro de PBS incubar en serie los explantes en sacarosa al 10% durante 10 minutos, sacarosa al 20% durante 20 minutos y sacarosa al 30% durante 30 minutos. Corta los explantes retinianos uniformemente con cuatro cuadrantes en la periferia y seis milímetros en el centro.Luego transfiera los explantes retinianos a una caja de hojalata de aproximadamente 1.5 por 1.5 centímetros con un medio de incrustación compuesto de temperatura de corte óptima que cubra el explante. Inmediatamente, congele las secciones de tejido en nitrógeno líquido y colóquelas en un refrigerador a 20 grados para su almacenamiento. A continuación, recorte el agar en un pequeño bloque que contenga la muestra de tejido.Divida los bloques en bloques de 10 micrómetros y coloque las secciones en portaobjetos de microscopio de adhesión con un cepillo suave. Luego seque las secciones durante 45 minutos a 40 grados centígrados y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta que las use. Para la tinción cíclica de guanosina monofosfato o cGMP, dibuje un anillo hidrófobo alrededor de las secciones retinianas secas con una pluma bloqueadora de líquidos y cubra las muestras.Sumerja los portaobjetos en 200 microlitros de 0,3% PBS y Triton-X100 o PBST durante 10 minutos seguido de un tratamiento de una hora en 200 microlitros de solución de bloqueo a temperatura ambiente. A continuación, incubar el portaobjetos de muestra durante la noche con los 200 microlitros de anticuerpos primarios preparados en la solución de bloqueo a cuatro grados centígrados y enjuague tres veces con PBS durante 10 minutos. Incubar el portaobjetos en 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente.Después de tres lavados de PBS durante 10 minutos, cubra las muestras con un medio de montaje antidecoloración que contenga DAPI y guárdelas a cuatro grados centígrados durante al menos 30 minutos antes de la obtención de imágenes. Seque el portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos y dibuje un anillo de barrera repelente al agua alrededor de la muestra de tejido retiniano con una pluma bloqueadora de líquidos. Después de la incubación con 40 mililitros de PBS durante 15 minutos, trate las secciones con 42 mililitros de tampón tris molar 0.05 o TBS a 37 grados centígrados.Aspirar el TBS, incubar las muestras con seis microlitros de proteinasa K durante cinco minutos y lavar los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno. Exponga los portaobjetos a 40 mililitros de solución de ácido acético etanol en el chaplin. Cúbralo con una hoja transparente e incube a menos 20 grados centígrados durante cinco minutos.Lave las diapositivas tres veces con TBS durante cinco minutos cada vez. Exponga los portaobjetos a 200 a 300 microlitros de solución de bloqueo o BSA al 1% e incubarlos en una cámara de humedad durante una hora. A aproximadamente 130 microlitros de solución roja TMR por portaobjetos y después de una hora, dé dos lavados de 200 microlitros de PBS durante cinco minutos cada uno.Coloque portaobjetos que contengan una o dos gotas de medio de montaje antidecoloración con DAPI sobre las muestras e incube los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante al menos 30 minutos antes de obtener imágenes. Después de la tinción secuencial con túnel y cGMP, proceda a la microscopía de luz y fluorescencia ajustando los parámetros de la cámara. Capture las imágenes de cuatro campos de cada sección utilizando el software con una cámara digital con un aumento de 20x.Obtenga imágenes representativas de las áreas centrales de la retina utilizando DAPI, EGFP y TMR con escaneo z-stack y un intervalo de un micrómetro y opcional a 1.251 micrómetros. En los explantes retinianos tratados con diferentes concentraciones de los inhibidores de la PDE6 Zaprinast el número de células positivas para túnel y GMPc aumentó considerablemente en la capa nuclear externa en comparación con el grupo control. La alta proporción de células positivas para túnel sugirió que el aumento en la actividad de cGMP puede mejorar la degeneración de células retinianas inducida por el nido y la acumulación de cGMP juega un papel en la degeneración de los fotorreceptores.La preparación del explante debe llevarse a cabo lo antes posible. Op animal dispersa cinco y cualquier acumulación porque mejora la supervivencia celular y mejora el estado de la fibra de la serie de pilas a granel. En la mayor medida visible, el vítreo debe limpiarse con esteroides.Evite entrar en contacto con las capas de fibras nerviosas de la retina al transferir explantes de retina para evitar lesiones celulares mecánicas. Tenga en cuenta que para emitir una transferencia suave de explantes de retina a los insertos de cultivo, la mascota puede empaparse previamente en algo para mantenerla húmeda antes de transferir los tejidos de la retina. Además, todo el proceso debe llevarse a cabo en la atmósfera de esteroides para evitar la contaminación durante el proceso.

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