Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (nr 81960180), Zinke Heritage Foundation och Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Vi tackar professor Longbao Lv (Zoologiska institutet, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Kina) för att ha delat med sig av apögongloberna som användes i denna studie.

Djurstudien granskades och godkändes av etikprövningskommittén vid Zoologiska institutet, Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002) och djuretisk granskning och djurprotokoll vid Yunnan University (YNU20220149).
1. Beredning av retinala explantat
<ol><li>Få primatögonbollar från makaker av vildtyp, i åldern 1 till 3 år, förvara i vävnadsförvaringslösning och transportera på is inom 3 timmar efter enukleation efter att aporna offrades eller efter naturli...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

Visuell fototransduktion hänvisar till den biologiska processen genom vilken ljussignaler omvandlas till elektriska signaler av fotoreceptorceller i ögats näthinna. Fotoreceptorceller är polariserade neuroner som kan fototransduktion, och det finns två olika typer av fotoreceptorer som kallas stavar och kottar efter formerna på deras yttre segment. Stavar är ansvariga för den skotopiska synen och kottar är ansvariga för fotopisk och hög synskärpa. Ärftlig RD avser neurodegenerativa sjukdomar som känneteckna...

Ärftlig retinal degeneration (RD) kännetecknas av progressiv fotoreceptorcelldöd och orsakas av mutationer i en mängd olika patogena gener1. Slutresultatet av RD är synförlust och i de allra flesta fall är sjukdomen fortfarande obehandlingsbar till denna dag. Därför är det viktigt att studera de cellulära mekanismerna som leder till fotoreceptordöd med hjälp av modeller som troget representerar det mänskliga sjukdomstillståndet. Här är primatbaserade modeller av särskilt intresse på grund av deras närhet till människor. I synnerhet kan sådana modeller främja utvecklingen av lämpliga terapeutiska ingrepp som kan stoppa eller fördröja fotoreceptorcelldöd.
Tidigare forskning om mekanismerna för celldöd vid RD har visat att minskningen eller förlusten av fosfodiesteras 6 (PDE6) aktivitet orsakad av RD-utlösande genmutationer leder till minskad hydrolys av cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP)2,3. cGMP är en specifik agonist för de cykliska nukleotidstyrda jonkanalerna (CNGCs) i stavens yttre segment (ROS) och är också en nyckelmolekyl som ansvarar för omvandlingen av ljussignaler till elektriska signaler i ryggradsdjurens fotoreceptorceller4. Minskad cGMP-hydrolys orsakar ackumulering av cGMP i ROS, vilket leder till öppnandet av CNGC 5. Följaktligen aktiveras fototransduktionsvägarna, vilket resulterar i en ökning av katjonkoncentrationerna i fotoreceptorceller. Denna process medför en metabolisk belastning på fotoreceptorer, som när de överaktiveras, till exempel av mutationer i PDE6, kan orsaka celldöd.
Många studier har visat att en signifikant överackumulering av cGMP i fotoreceptorer hos musmodeller med olika RD-genmutationer kan orsaka aktivering av cGMP-beroende proteinkinas (PKG)3,6. Detta leder till en betydande ökning av döende, TUNEL-positiva celler och en gradvis uttunning av fotoreceptorcellskiktet. Tidigare studier tyder på att PKG-överaktivering orsakad av förhöjda cGMP-nivåer är ett nödvändigt och tillräckligt villkor för induktion av fotoreceptorcelldöd 2,5. Studier på olika musmodeller av RD har också visat att PKG-aktivering inducerad av förhöjda cGMP-nivåer i fotoreceptorer leder till överaktivering av nedströms effektorer såsom poly-ADP-ribospolymeras 1 (PARP1), histondeacetylas (HDAC) och calpain 2,7,8,9. Detta innebär orsakssamband mellan dessa olika målproteiner och fotoreceptorcelldöd.
Tidigare forskning om patologi, toxikofarmakologi och terapi av RD baserades dock huvudsakligen på musmodeller för RD10,11,12. Icke desto mindre kvarstår enorma svårigheter i den kliniska översättningen av dessa resultat. Detta beror på de stora genetiska och fysiologiska skillnaderna mellan möss och människor, särskilt med avseende på näthinnans struktur. Däremot delar icke-mänskliga primater (NHP) också en hög grad av likhet med människor med avseende på genetiska egenskaper, fysiologiska mönster och miljöfaktorreglering. Till exempel undersöktes optogenetisk terapi som ett sätt att återställa retinal aktivitet i en NHP-modell13. Lingam och kollegor visade att god tillverkningspraxis-grade human-inducerad pluripotent stamcells-härledd retinal fotoreceptorprekursorceller kan rädda konfotoreceptorskador i NHP14. Därför är NHP-modeller viktiga för utforskningen av RD-patogenes och utvecklingen av effektiva behandlingsmetoder. I synnerhet kan NHP-modeller av RD, som uppvisar patogena mekanismer som liknar dem hos människor, spela en avgörande roll i studier om utveckling och in vivo toxikofarmakologisk analys av nya läkemedel.
Med tanke på den långa livscykeln, höga tekniska svårigheter och höga kostnader för att etablera primatmodeller in vivo etablerade vi en in vitro icke-mänsklig primatmodell (NHP) med hjälp av kulturer av explanterad makaknäthinna. Först valdes makaker av vildtyp i åldern 1-3 år ut för in vitro-odling av retinala explantat, vilket inkluderade retina-RPE-choroidkomplexet. Explantater behandlades sedan med olika koncentrationer av PDE6-hämmaren zaprinast (100 μM, 200 μM och 400 μM) för att inducera cGMP-PKG-signalvägen. Fotoreceptorcelldöd kvantifierades och analyserades med hjälp av TUNEL-analysen, och cGMP-ackumulering i explantat verifierades via immunofluorescens. Med tanke på den höga graden av likhet med avseende på celldistribution och morfologi, näthinnans skikttjocklek och andra fysiologiska egenskaper hos näthinnan mellan apor och människor, kan etableringen av cGMP-PKG-signalvägen i in vitro-retinalmodellen underlätta framtida forskning om patogenesen av RD samt studier av utveckling och toxikofarmakologi av nya läkemedel för RD-behandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

Ärftlig retinal degeneration (RD) kännetecknas av progressiv fotoreceptorcelldöd. Överaktivering av den cykliska guanosinmonofosfat (cGMP)-beroende proteinkinasvägen (PKG) i fotoreceptorceller orsakar fotoreceptorcelldöd, särskilt i modeller som innehåller fosfodiesteras 6b (PDE6b) mutationer. Tidigare studier på RD har huvudsakligen använt murina modeller som rd1 eller rd10 möss. Med tanke på de genetiska och fysiologiska skillnaderna mellan möss och människor är det viktigt att förstå i vilken utsträckning näthinnan hos primater och gnagare är jämförbara. Makaker delar en hög grad av genetisk likhet med människor. Därför valdes makaker av vildtyp (i åldern 1-3 år) för in vitro-odling av retinala explantat som inkluderade retina-retinal pigmentepitel (RPE)-choroidkomplex. Dessa explantat behandlades med olika koncentrationer av PDE6-hämmaren zaprinast för att inducera cGMP-PKG-signalvägen och simulera RD-patogenes. cGMP-ackumulering och celldöd i primatretinala explantat verifierades därefter med hjälp av immunofluorescens och TUNEL-analysen. Den primatnäthinnemodell som etablerats i denna studie kan tjäna för relevanta och effektiva studier av mekanismerna för cGMP-PKG-beroende RD, liksom för utveckling av framtida behandlingsmetoder.

I denna studie utfördes Macaque monkey retinal explantkultur med användning av explantat innehållande näthinnan-RPE-choroidkomplexet (figur 1, kompletterande figur S1). Jämfört med in vitro-kulturen av retinala celler som använder näthinnan utan bifogad RPE och choroid, underlättar vår explantkultur bättre cellöverlevnad och förlänger följaktligen överlevnaden av fotoreceptorceller.
Vi använde olika koncentrationer av PDE...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Retinala explantat erhållna från makaker av vildtyp odlades in vitro. Retinal degeneration och cGMP-PKG-signalvägen inducerades med användning av PDE6-hämmaren zaprinast. cGMP-ackumulering i explanterna vid olika zaprinastkoncentrationer verifierades med hjälp av immunofluorescens.

Organotypiska retinala explantkulturer från Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Primatnäthinnemodellen som etablerades i denna studie erbjuder vi undersökning av den omfattande mekanismen och den terapeutiska utvecklingen av cGMP-PKG-beroende retinal försämring. Denna individuella icke-humana primatmodell reserverar retinal vävnadsbekräftelse och intercellulära interaktioner som möjliggör bättre simulering av in vivo-förhållanden. Det minskar också djuranvändningen och det förkortar försökstiden.Tillhandahålla en kontrollexperimentell metod för att undersöka näthinnans utveckling eller degeneration. Börja beredningen av retinal explantat genom att tvätta ögonbollarna isolerade från vilda typ makaker med 10 ml 5% povidonjod i 30 sekunder. För att undvika bakteriell kontaminering, doppa ögonbollarna i en 5% penicillin streptomycin PBS-lösning i en minut före inkubation i 10 ml R16-medium i fem minuter.Sänk sedan ögonbollarna i 10 ml protein Ace-K-lösning, förvärmd vid 37 grader Celsius och inkuberas i två minuter. Utför nästa inkubation i 10 ml av en till en R16 plus fetal bovin serumlösning i fem minuter. Ge en slutlig tvätt i 10 ml färsk R16.När du är klar, separera sclera, hornhinnan, iris, lins och glaskropp. Skär sedan näthinnan från fyra sidor med pincett och sax. Använd sedan ett fyra milliliter träd fint blad för att skära retinal explantat vid en 1,5 millimeter från nässidan, fyra millimeter från den temporala sidan och en två millimeter från de överlägsna och underlägsna sidorna av det optiska nervhuvudet.Skär sedan med ett sex millimeter trädfint blad den centrala sidan av retinalplantan som innehåller optisk skiva och makula. Dra näthinnan explantat som innehåller näthinnan och åderhinnan med en bred pipett och placera den i mitten av insatsen med fotoreceptorsidan uppåt. Sänk ner näthinnan helt i en milliliter av hela mediet på plattan under membranet.Odla retinalplantningarna och placera dem i en 37 grader Celsius inkubator med fuktad 5% koldioxid. Ge lämplig läkemedelskoncentrationsbehandling till explantat i fyra dagar. Använd minst tre explantat per behandlingsförhållande och använd explanterna utan läkemedlet som en positiv kontroll.För fixering och kryo-sektionering, behandla retinal explantat med en milliliter paraform aldehyd i 45 minuter. Efter en kort sköljning med en milliliter PBS inkubera explanterna i 10% sackaros i 10 minuter, 20% sackaros i 20 minuter och 30% sackaros i 30 minuter. Skär näthinnans explantat jämnt med fyra kvadranter i periferin och sex millimeter i mitten.Överför sedan näthinnans explantat till en tennlåda på cirka 1,5 x 1,5 x 1,5 centimeter med ett optimalt skärtemperatursammansatt inbäddningsmedium som täcker explantet. Frys omedelbart vävnadssektionerna i flytande kväve och placera dem i ett 20 graders kylskåp för förvaring. Trimma sedan agar i ett litet block som innehåller vävnadsprovet.Dela blocken i 10 mikrometer block och placera sektionerna på vidhäftningsmikroskopglas med en mjuk borste. Torka sedan sektionerna i 45 minuter vid 40 grader Celsius och förvara dem vid minus 80 grader Celsius tills de används. För cykliskt guanosinmonofosfat eller cGMP-färgning, dra en hydrofob ring runt de torkade näthinnesektionerna med en flytande blockerarpenna och täck proverna.Sänk ner objektglasen i 200 mikroliter 0,3% PBS och Triton-X100 eller PBST i 10 minuter följt av en timmes behandling i 200 mikroliter blockerande lösning vid rumstemperatur. Inkubera sedan provglaset över natten med 200 mikroliter primär antikropp beredd i blockeringslösningen vid fyra grader Celsius och skölj den tre gånger med PBS i 10 minuter. Inkubera glaset i 200 mikroliter sekundär antikropp i en timme vid rumstemperatur.Efter tre tvättar av PBS i 10 minuter, täck proverna med ett antifade monteringsmedium innehållande DAPI och förvara vid fyra grader Celsius i minst 30 minuter före avbildning. Torka glaset vid rumstemperatur i 15 minuter och dra en vattenavvisande barriärring runt näthinnans vävnadsprov med en vätskeblockerarpenna. Efter inkubation med 40 ml PBS i 15 minuter behandla sektionerna med 42 ml 0,05 molar tris-buffert eller TBS vid 37 grader Celsius.Aspirera TBS, inkubera proverna med sex mikroliter proteinas K i fem minuter och tvätta glasen tre gånger med PBS i fem minuter vardera. Utsätt objektglasen för 40 ml etanolättiksyralösning i chaplin. Täck det med ett genomskinligt ark och inkubera vid minus 20 grader Celsius i fem minuter.Tvätta bilderna tre gånger med TBS i fem minuter varje gång. Utsätt objektglasen för 200 till 300 mikroliter blockeringslösning eller 1% BSA och inkubera dem i en fuktighetskammare i en timme. Vid cirka 130 mikroliter TMR röd lösning per glas och efter en timme, ge två tvättar på 200 mikroliter PBS i fem minuter vardera.Placera täckglas som innehåller en till två droppar antifade monteringsmedium med DAPI över proverna och inkubera objektglasen vid fyra grader Celsius i minst 30 minuter före avbildning. Efter sekventiell färgning med tunnel och cGMP fortsätt för ljus- och fluorescensmikroskopi genom att justera kameraparametrarna. Ta bilder av fyra fält från varje sektion med hjälp av programvaran med en digitalkamera med 20x förstoring.Få representativa bilder från de centrala delarna av näthinnan med DAPI, EGFP och TMR med z-stack-skanning och ett intervall på en mikrometer och valfritt vid 1,251 mikrometer. I näthinnans explantat behandlade med olika koncentrationer av PDE6-hämmarna Zaprinast ökade antalet tunnel- och cGMP-positiva celler kraftigt i det yttre kärnskiktet jämfört med kontrollgruppen. Den höga andelen tunnelpositiva celler föreslog att ökningen av cGMP-aktivitet kan förbättra pre-nest-inducerad retinal celldegeneration och cGMP-ackumulering spelar en roll i fotoreceptordegeneration.Explantberedning måste utföras så snart som möjligt. Op djur scatter femmor och eventuell ackumulering eftersom det förbättrar cellöverlevnad och förbättra statusen för fiber av bulk stack serien. I största möjliga utsträckning bör glaskroppen rengöras med steroider.Undvik att kontakta retinala nervfiberskikt vid överföring av retinala explantat för att förhindra mekanisk cellskada. Observera, för att utfärda en smidig överföring av retinala explantat till odlingsinsatser kan husdjuret förblötläggas i något för att hålla det fuktigt innan det överförs näthinnevävnader. Dessutom måste hela processen utföras i steroidatmosfären för att undvika kontaminering under processen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic hippocampus Slice kulturer

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic Cerebellar kulturer: apoptotiska utmaningar och Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-elektrod Array Inspelningar av neuronala laviner i Organotypic kulturer

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonala på magen mitthjärnan: Ett system att studera Dopaminerga nervsystemets utveckling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Analysen av Purkinje Cell Dendritic Morfologi i Organotypiska slice kulturer

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neurala Explantation kulturer från<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic Slice kulturer för att studera Oligodendrocyte Dynamics och myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Den Analys av neurovaskulär Remodeling i Entorhino-hippocampus Organotypic Slice kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Undersöka Funktionell Regeneration i Organotypiska Spinal Cord Samkulturer Grown på Multi-elektrod Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...