Name: organotypic retinal explant cultures from macaque monkey
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81960180), Zinke miras vakfı ve Charlotte ve Tistou Kerstan Vakfı, Yunnan Göz Hastalığı Klinik Tıp Merkezi (ZX2019-02-01) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan maymun gözbebeklerini paylaştığı için Prof. Longbao Lv'ye (Zooloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Kunming, Çin) teşekkür ederiz.

Hayvan çalışması, Zooloji Enstitüsü Etik İnceleme Komitesi, Çin Bilimler Akademisi (IACUC-PE-2022-06-002) ve Yunnan Üniversitesi hayvan etiği incelemesi ve hayvan protokolü (YNU20220149) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Retinal eksplantların hazırlanması
<ol><li>1 ila 3 yaşları arasındaki vahşi tip makaklardan primat gözbebekleri elde edin, doku depolama çözeltisinde saklayın ve maymunlar kurban edildikten sonra veya doğal ölü...

<ol>
	<li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP.">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).</li><li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models.">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li><li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration:+Targets,+compounds,+and+biomarkers.">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).</li><li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration.">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).</li><li>Mencl, S., Trifunovi&#263;, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+(experimental+study).">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li><li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration.">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li><li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse.">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death &amp; Disease. 1 (2), 24 (2010).</li><li>Kulkarni, M., Trifunovi&#263;, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors.">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li><li>Trifunovi&#263;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li><li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice.">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li><li>Sch&#246;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+(RP43).">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li><li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation.">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li><li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates.">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 464 (2021).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death:+perspectives+for+therapy+development.">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+(PDE6):+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa.">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li><li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa.">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).</li><li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas:+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology.">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).</li></ol>

Görsel fototransdüksiyon, ışık sinyallerinin gözün retinasındaki fotoreseptör hücreler tarafından elektrik sinyallerine dönüştürüldüğü biyolojik süreci ifade eder. Fotoreseptör hücreler, fototransdüksiyon yapabilen polarize nöronlardır ve dış segmentlerinin şekillerinden sonra çubuklar ve koniler olarak adlandırılan iki farklı fotoreseptör türü vardır. Çubuklar skotopik görmeden sorumludur ve koniler fotopik ve yüksek keskinlikte görmeden sorumludur. Kalıtsal RD, ilerleyici retina...

Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir ve çok çeşitli patojenik genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanır1. RD'nin nihai sonucu görme kaybıdır ve vakaların büyük çoğunluğunda hastalık bu güne kadar tedavi edilemez olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, fotoreseptör ölümüne yol açan hücresel mekanizmaları, insan hastalık durumunu sadık bir şekilde temsil eden modelleri kullanarak incelemek önemlidir. Burada, primat bazlı modeller, insanlara olan yakınlıkları nedeniyle özellikle ilgi çekicidir. Özellikle, bu tür modeller fotoreseptör hücre ölümünü durdurabilecek veya geciktirebilecek uygun terapötik müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir.
RD'de hücre ölümü mekanizmaları üzerine yapılan önceki araştırmalar, RD'yi tetikleyen gen mutasyonlarının neden olduğu fosfodiesteraz 6 (PDE6) aktivitesinin azalmasının veya kaybının, siklik guanozin monofosfatın (cGMP) hidrolizinin azalmasına yol açtığını göstermiştir2,3. cGMP, çubuk dış segmentlerindeki (ROS'lar) siklik nükleotid kapılı iyon kanallarının (CNGC'ler) spesifik bir agonistidir ve aynı zamanda omurgalı fotoreseptör hücrelerinde ışık sinyallerinin elektrik sinyallerine dönüştürülmesinden sorumlu anahtar bir moleküldür4. Azaltılmış cGMP hidrolizi, ROS'larda cGMP birikimine neden olur ve CNGC'lerin açılmasına neden olur 5. Sonuç olarak, fototransdüksiyon yolları aktive edilir ve fotoreseptör hücrelerde katyon konsantrasyonlarında bir artışa neden olur. Bu süreç, fotoreseptörlere, örneğin PDE6'daki mutasyonlar tarafından aşırı aktive edildiğinde hücre ölümüne neden olabilecek metabolik bir yük getirir.
Birçok çalışma, farklı RD gen mutasyonlarına sahip fare modellerinin fotoreseptörlerinde önemli miktarda cGMP aşırı birikiminin, cGMP'ye bağımlı protein kinazının (PKG) aktivasyonuna neden olabileceğini göstermiştir3,6. Bu, ölme, TUNEL-pozitif hücrelerde önemli bir artışa ve fotoreseptör hücre tabakasının kademeli olarak incelmesine yol açar. Önceki çalışmalar, yüksek cGMP seviyelerinin neden olduğu PKG aşırı aktivasyonunun, fotoreseptör hücre ölümünün indüksiyonu için gerekli ve yeterli bir koşul olduğunu göstermektedir 2,5. RD'nin farklı fare modelleri üzerinde yapılan çalışmalar, fotoreseptörlerde yüksek cGMP seviyeleri tarafından indüklenen PKG aktivasyonunun, poli-ADP-riboz polimeraz 1 (PARP1), histon deasetilaz (HDAC) ve calpain 2,7,8,9 gibi aşağı akış efektörlerinin aşırı aktivasyonuna yol açtığını göstermiştir. Bu, bu farklı hedef proteinler ile fotoreseptör hücre ölümü arasındaki nedensel ilişkileri ima eder.
Bununla birlikte, RD'nin patolojisi, toksikofarmakolojisi ve tedavisi ile ilgili önceki araştırmalar esas olarak RD10,11,12 için fare modellerine dayanıyordu. Bununla birlikte, bu sonuçların klinik çevirisinde büyük zorluklar devam etmektedir. Bu, fareler ve insanlar arasındaki, özellikle retinal yapı ile ilgili önemli genetik ve fizyolojik farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Buna karşılık, insan olmayan primatlar (NHP'ler) ayrıca genetik özellikler, fizyolojik kalıplar ve çevresel faktör düzenlemesi açısından insanlarla yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Örneğin, optogenetik tedavi, bir NHP model13'te retinal aktiviteyi geri kazanmanın bir yolu olarak araştırılmıştır. Lingam ve meslektaşları, iyi üretim uygulaması sınıfı insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı retinal fotoreseptör öncü hücrelerinin NHP14'te koni fotoreseptör hasarını kurtarabileceğini göstermiştir. Bu nedenle NHP modelleri, RD patogenezinin araştırılması ve etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir. Özellikle, insanlardakine benzer patojenik mekanizmalar sergileyen RD'nin NHP modelleri, yeni ilaçların geliştirilmesi ve in vivo toksikofarmakoloji analizi ile ilgili çalışmalarda kritik bir rol oynayabilir.
Uzun yaşam döngüsü, yüksek düzeyde teknik zorluklar ve in vivo primat modellerinin oluşturulmasında yer alan yüksek maliyet göz önüne alındığında, ekzode makak retina kültürlerini kullanarak in vitro insan dışı primat (NHP) modeli oluşturduk. İlk olarak, retina-RPE-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için 1-3 yaş arası vahşi tip makaklar seçildi. Eksplantlar daha sonra cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast (100 μM, 200 μM ve 400 μM) ile muamele edildi. Fotoreseptör hücre ölümü TUNEL testi kullanılarak ölçüldü ve analiz edildi ve eksplantlarda cGMP birikimi immünofloresan yoluyla doğrulandı. Maymunlar ve insanlar arasındaki hücre dağılımı ve morfolojisi, retina tabakası kalınlığı ve retinanın diğer fizyolojik özellikleri açısından yüksek derecede benzerlik göz önüne alındığında, in vitro retinal modelde cGMP-PKG sinyal yolunun kurulması, RD'nin patogenezi üzerine gelecekteki araştırmaları ve RD tedavisi için yeni ilaçların geliştirilmesi ve toksikofarmakolojisine yönelik çalışmaları kolaylaştırabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>A11015</td>
			<td>Secondary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-acetic acid solution</td>
			<td>Shyuanye</td>
			<td>R20492</td>
			<td>Fixing liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td>Optimized storage of fresh organ and tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td>Fixing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN. / STREP. 100&#215;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td>Penicillin / Streptomycin antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline(PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Shanghailikang</td>
			<td>310411</td>
			<td>Disinfector agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>539480</td>
			<td>Break down protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16 medium</td>
			<td>Life technologies corporation</td>
			<td>074-90743A</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-cGMP</td>
			<td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody of cGMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopheryl acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3412</td>
			<td>Cell / tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffer (TBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1080</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Supplements of Complete Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaprinast</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0878</td>
			<td>PDE6 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Imager M2 Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 900 Airyscan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>high resolution laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiocam</td>
			<td>&#160;Zeiss, Oberkochen,Germany</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision4.7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primate eyeballs from wildtype macaque</td>
			<td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td>
			<td>SYXK (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto;" />) K2017 -0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic retinal explant cultures from macaque monkey

Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir. Fotoreseptör hücrelerde siklik guanozin monofosfat (cGMP)-bağımlı protein kinaz (PKG) yolunun aşırı aktivasyonu, özellikle fosfodiesteraz 6b (PDE6b) mutasyonlarını barındıran modellerde fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. RD ile ilgili önceki çalışmalarda esas olarak rd1 veya rd10 fareleri gibi murin modelleri kullanılmıştır. Fareler ve insanlar arasındaki genetik ve fizyolojik farklılıklar göz önüne alındığında, primat ve kemirgenlerin retinalarının ne ölçüde karşılaştırılabilir olduğunu anlamak önemlidir. Makaklar, insanlarla yüksek düzeyde genetik benzerlik paylaşır. Bu nedenle, retina-retinal pigment epiteli (RPE)-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için vahşi tip makaklar (1-3 yaş arası) seçildi. Bu eksplantlar, cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek ve RD patogenezini simüle etmek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast ile tedavi edildi. primat retinal eksplantlarda cGMP birikimi ve hücre ölümü daha sonra immünofloresan ve TUNEL testi kullanılarak doğrulandı. Bu çalışmada oluşturulan primat retinal modeli, cGMP-PKG'ye bağımlı RD mekanizmalarına ilişkin ilgili ve etkili çalışmaların yanı sıra gelecekteki tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine de hizmet edebilir.

Bu çalışmada Makak maymunu retinal eksplant kültürü, retina-RPE-koroid kompleksini içeren eksplantlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 1, Ek Şekil S1). Ekli RPE ve koroid olmadan retinayı kullanan retina hücrelerinin in vitro kültürü ile karşılaştırıldığında, eksplant kültürümüz daha iyi hücre sağkalımını kolaylaştırır ve buna bağlı olarak fotoreseptör hücrelerin hayatta kalmasını uzatır.
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey at JoVE.com

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Vahşi tip makaklardan elde edilen retinal eksplantlar in vitro olarak kültürlendi. Retinal dejenerasyon ve cGMP-PKG sinyal yolu PDE6 inhibitörü zaprinast kullanılarak indüklendi. Farklı zaprinast konsantrasyonlarındaki eksplantlarda cGMP birikimi, immünofloresan kullanılarak doğrulandı.

Makak Maymunundan Organotipik Retinal Eksplant Kültürleri

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Bu çalışmada oluşturulan primat retinal modeli, cGMP-PKG'ye bağımlı retina bozulmasının kapsamlı mekanizmasını ve terapötik gelişimini araştırdı. Bu bireysel insan dışı primat modeli, retinal doku doğrulamasını ve in vivo koşulların daha iyi simülasyonunu sağlayan hücreler arası etkileşimleri saklı tutar. Ayrıca hayvan kullanımını azaltır ve deney süresini kısaltır.Retina gelişimi veya dejenerasyonunu araştırmak için kontrol deneysel bir yaklaşım sağlamak. Yabani tip makaklardan izole edilen göz kürelerini 10 mililitre% 5 povidon iyot ile 30 saniye boyunca yıkayarak retinal eksplantların hazırlanmasına başlayın. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için, göz kürelerini beş dakika boyunca 10 mililitre R16 ortamında inkübasyondan önce bir dakika boyunca% 5'lik bir penisilin streptomisin PBS çözeltisine batırın.Daha sonra göz kürelerini, 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış ve iki dakika boyunca inkübe edilmiş 10 mililitre protein Ace-K çözeltisine batırın. Bir sonraki inkübasyonu beş dakika boyunca 10 mililitre bir ila bir R16 artı fetal sığır serum çözeltisinde gerçekleştirin. 10 mililitre taze R16'da son bir yıkama yapın.İşiniz bittiğinde, sklera, kornea, iris, lens ve vitreus gövdesini ayırın. Sonra retinayı dört taraftan cımbız ve makasla kesin. Daha sonra, retinal eksplantı burun tarafından 1,5 milimetre, temporal taraftan dört milimetre ve optik sinir başının üst ve alt taraflarından iki milimetre kesmek için dört mililitrelik bir ağaç ince bıçağı kullanın.Daha sonra altı milimetrelik bir ağaç ince bıçağı kullanarak, optik disk ve makulayı içeren retinal eksplantın orta tarafını kesin. Geniş bir pipet kullanarak, retina ve koroidi içeren retina eksplantını çekin ve fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde ekin ortasına yerleştirin. Retinayı, zarın altındaki plakadaki tam ortamın bir mililitresine tamamen batırın.Retinal eksplantları kültüre alın ve nemlendirilmiş% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Dört gün boyunca eksplantlara uygun ilaç konsantrasyonu tedavisini verin. Tedavi koşulu başına en az üç eksplant kullanın ve eksplantları ilaçsız pozitif bir kontrol olarak kullanın.Sabitleme ve kriyo-kesit için, retinal eksplantları 45 dakika boyunca bir mililitre paraform aldehit ile tedavi edin. Bir mililitre PBS ile kısa bir durulamadan sonra, eksplantları seri olarak 10 dakika boyunca% 10 sakaroz, 20 dakika boyunca% 20 sakkaroz ve% 30 sakkaroz içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Retinal eksplantları çevrede dört kadran ve merkezde altı milimetre olacak şekilde düzgün bir şekilde kesin.Daha sonra retinal eksplantları, eksplantı kaplayan optimum bir kesme sıcaklığı bileşiği gömme ortamı ile yaklaşık 1.5 x 1.5 x 1.5 santimetrelik bir teneke kutuya aktarın. Hemen, doku bölümlerini sıvı azotla dondurun ve saklamak için 20 derecelik bir buzdolabına koyun. Ardından, agar'ı doku örneğini içeren küçük bir bloğa kesin.Blokları 10 mikrometrelik bloklara bölün ve bölümleri yumuşak bir fırça kullanarak yapışma mikroskobu slaytlarına yerleştirin. Daha sonra bölümleri 40 santigrat derecede 45 dakika kurutun ve kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Siklik guanozin monofosfat veya cGMP boyama için, kurutulmuş retina bölümlerinin etrafına sıvı bloker kalemle hidrofobik bir halka çizin ve numuneleri örtün.Slaytları 10 dakika boyunca 200 mikrolitre% 0.3 PBS ve Triton-X100 veya PBST'ye daldırın, ardından oda sıcaklığında 200 mikrolitre bloke edici çözeltiye bir saatlik bir işlem uygulayın. Daha sonra, numune slaydını, bloke edici çözeltide dört santigrat derecede hazırlanan 200 mikrolitre birincil antikor ile gece boyunca inkübe edin ve 10 dakika boyunca PBS ile üç kez durulayın. Slaydı oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 mikrolitre ikincil antikor içinde inkübe edin.PBS'nin 10 dakika boyunca üç kez yıkanmasından sonra, numuneleri DAPI içeren bir antifade montaj ortamı ile örtün ve görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca dört santigrat derecede saklayın. Slaytı oda sıcaklığında 15 dakika kurutun ve retina dokusu örneğinin etrafına sıvı bloker kalemle su itici bir bariyer halkası çizin. 15 dakika boyunca 40 mililitre PBS ile inkübasyondan sonra, bölümleri 37 santigrat derecede 42 mililitre 0.05 molar tris tampon veya TBS ile tedavi edin.TBS'yi aspire edin, numuneleri beş dakika boyunca altı mikrolitre proteinaz K ile inkübe edin ve slaytları her biri beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Slaytları chaplin içinde 40 mililitre etanol asetik asit çözeltisine maruz bırakın. Şeffaf bir tabaka ile örtün ve beş dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin.Slaytları her seferinde beş dakika boyunca TBS ile üç kez yıkayın. Slaytları 200 ila 300 mikrolitre bloke edici çözeltiye veya% 1 BSA'ya maruz bırakın ve bir saat boyunca bir nem odasında inkübe edin. Slayt başına yaklaşık 130 mikrolitre TMR kırmızı çözeltisinde ve bir saat sonra, her biri beş dakika boyunca 200 mikrolitre PBS'lik iki yıkama yapın.Bir ila iki damla antifade montaj ortamı içeren kapak slaytlarını DAPI ile numunelerin üzerine yerleştirin ve slaytları görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Tünel ve cGMP ile sıralı boyamadan sonra kamera parametrelerini ayarlayarak ışık ve floresan mikroskobu için ilerleyin. Yazılımı kullanarak her bölümden dört alanın görüntülerini 20x büyütmede bir dijital kamera ile yakalayın.DAPI, EGFP ve TMR kullanarak retinanın merkezi bölgelerinden z-stack tarama ve bir mikrometre aralıklarla ve isteğe bağlı olarak 1.251 mikrometrede temsili resimler elde edin. PDE6 inhibitörleri Zaprinast'ın farklı konsantrasyonları ile tedavi edilen retinal eksplantlarda, dış nükleer tabakada tünel ve cGMP pozitif hücrelerin sayısı kontrol grubuna kıyasla güçlü bir şekilde artmıştır. Tünel pozitif hücrelerin yüksek oranı, cGMP aktivitesindeki artışın pre nest kaynaklı retinal hücre dejenerasyonunu artırabileceğini ve cGMP birikiminin fotoreseptör dejenerasyonunda rol oynadığını düşündürmektedir.Eksplant hazırlığı mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Op hayvan saçılım beşli ve herhangi bir birikim çünkü hücre hayatta kalmasını iyileştirir ve dökme yığın serisinin lif durumunu arttırır. Görülebilir ölçüde vitreus steroidlerle temizlenmelidir.Mekanik hücre hasarını önlemek için retina eksplantlarını transfer ederken retinal sinir lifi katmanlarına temas etmekten kaçının. Lütfen retinal eksplantların kültür eklerine düzgün bir şekilde aktarılmasını sağlamak için, evcil hayvanın retina dokularını aktarmadan önce nemli tutmak için bir şeye önceden batırılabileceğini unutmayın. Ek olarak, işlem sırasında kontaminasyonu önlemek için tüm işlem steroid atmosferinde gerçekleştirilmelidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Çok elektrot Dizileri Yetiştirilen Organotipik Omurilik Co-kültürler Fonksiyonel Rejenerasyon incelenmesi

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...