Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الملكية في المملكة المتحدة (رقم المنحة. IEC \ NSFC \ 201094) ، ومنحة دكتوراه الكومنولث.

ملاحظة: يصف البروتوكول طريقة النشاف الغربي للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية.
1. ثقافة الخلية والنقل
<ol><li>قم بتسخين جميع الكواشف في حمام الخرز (37 درجة مئوية) قبل إجراء زراعة الخلية. تحضير وسط الاستزراع ، وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ لكل ?...

تم استخدام العديد من الطرق لقياس أنشطة SLC12 من CCCs التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية ، بما في ذلك KCC2. وقد ثبت أن العديد من هذه التقنيات تعزز المعرفة العلمية بشأن تحليل الأهمية الوظيفية لهذه الناقلات وأنماط هيكلها الوظيفي في مختلف الطفرات المرتبطة بالمرض. بشكل حاسم ، هناك مزايا ومحاذير...

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl- وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي1،2،3،4. إن الحفاظ على تركيز Cl- منخفض داخل الخلايا العصبية ([Cl-]i) عند 4-6 مللي متر بواسطة KCC2 يسهل γ-aminobutyric acid (GABA) / فرط استقطاب الجلايسين وتثبيط متشابك في الدماغ والحبل الشوكي5. ارتبط الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع4. علاوة على ذلك ، فإن انخفاض قذف Cl− بوساطة KCC2 وضعف فرط استقطاب GABAA و / أو التيارات بوساطة مستقبلات الجلايسين متورطة في الصرع وآلام الأعصاب والتشنج 6,7. يتم تعديل الخلايا العصبية KCC2 بشكل سلبي عن طريق فسفرة المخلفات التنظيمية الرئيسية داخل المجال داخل الخلايا الطرفية C بواسطة مركب إشارات كيناز كيناز1 المرتبط بالبرولين / الألانين الغني بالألانين (SPAK) / المستجيب للإجهاد التأكسدي (OSR) 1 ، والذي يسهل الحفاظ على نشاط GABA غير المستقطب في الخلايا العصبية غير الناضجة2،8،9 . يقوم WNK-SPAK / OSR1 بفسفرة بقايا ثريونين 906 و 1007 (Thr906 / Thr1007) وبالتالي يقلل من تنظيم التعبير الجيني mRNA ل KCC2 ، مما يؤدي إلى تدهور لاحق في وظيفته الفسيولوجية 8,10. والأهم من ذلك ، أنه من المعروف بالفعل أن مركب كيناز WNK-SPAK / OSR1 معروف بالفسفرة وتثبيطتعبير KCC2 1،2،4،11،12 ، وأن تثبيط مسارات إشارات مجمع الكيناز لفسفرة Thr906 / Thr1007 قد تم ربطه بزيادة التعبير عن جين KCC2 mRNA 13،14،15 . من المهم ملاحظة أن تنظيم التعبير العصبي KCC2 و Na + -K + -2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) عبر فسفرة البروتين يعمل بشكل متزامن وفي أنماط عكسية1،4،16.
وقد أحرز تقدم ثابت وكبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). يسلط البروتوكول المقدم هنا الضوء على تطبيق تقنيات النشاف الغربية لدراسة وظائف وأنشطة الناقل العصبي K + -Cl- co-transporter KCC2 من خلال التحقيق في فسفرة الناقل المشترك في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007.
اللطخة الغربية هي طريقة تستخدم للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية من عينة من الأنسجة أو الخلية. تفصل هذه الطريقة أولا البروتينات حسب الحجم من خلال الرحلان الكهربائي. ثم يتم نقل البروتينات كهربائيا إلى دعامة صلبة (عادة غشاء) قبل تمييز البروتين المستهدف باستخدام جسم مضاد معين. يتم اقتران الأجسام المضادة بعلامات مختلفة أو أجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور يتم اكتشافها باستخدام طرق القياس اللوني أو التلألؤ الكيميائي أو التألق. هذا يسمح باكتشاف بروتين مستهدف محدد من خليط من البروتينات. وقد استخدمت هذه التقنية لتوصيف المواقع الفوسفاتية النوعية ل KCCs1 واستخدمت لتحديد مثبطات الكيناز التي تثبط فسفرة KCC3 Thr991/Thr104817. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يكتشف على وجه التحديد KCC2 الكلي والمفسفر من تحلل الخلايا / الأنسجة. من حيث المبدأ ، يعد اكتشاف الأجسام المضادة المترافقة بالبروتين بواسطة هذه التقنية مفيدا للغاية لأنه يساعد على تحسين فهم الأنشطة التعاونية في مواقع الفوسفو في KCC2 ، والتي تلقي الضوء على الآليات الجزيئية المشاركة في لوائحها الفسيولوجية. يمثل التحليل الكمي للتعبير الكلي للبروتين وظيفة ونشاط KCC2. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي. الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 ضار وقد ارتبط بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع. وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). هنا ، يسلط البروتوكول الضوء على كيفية التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز - Thr906 و Thr1007 - باستخدام تقنية النشاف الغربية. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا. ستتم مناقشة بعض هذه التقنيات الإضافية بإيجاز في هذه المخطوطة.

هنا ، بحثت النتيجة التمثيلية المقدمة في الشكل 1 في تأثير staurosporine و NEM على الفسفرة بوساطة WNK-SPAK / OSR1 ل KCC2 و NKCC1 في خطوط خلايا HEK293 التي تعبر بثبات عن KCC2b (HEKrnKCC2b) 18 باستخدام تقنية النشاف الغربي. وترد مناقشة تفاصيل شاملة عن النتائج التمثيلية في Zhang et a...

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

يسلط البروتوكول الحالي الضوء على تطبيق تقنية النشاف الغربي لدراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2. يصف البروتوكول التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007 عبر النشاف الغربي. أيضا ، يتم تمييز طرق إضافية لتأكيد نشاط KCC2 لفترة وجيزة في هذا النص.

دراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2 باستخدام النشاف الغربي

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في فهم الآليات المشاركة في تنظيم KCC2 من خلال التقييم المباشر لفسفرة الحجم الجزيئي للكيناز ، وبالتالي إلقاء الضوء على وظائفه وأنشطته الفسيولوجية. يمكن استخدامه لتحديد وتوصيف جزيئات مثل البروتينات ذات الأهمية من المخاليط المعقدة للجزيئات ذات الصلة حتى عندما يكون تعبير البروتين دقيقا جدا. هذه التقنية هي أداة أساسية لتحليل البروتين للأنظمة المعقدة وتحديد الآليات المحتملة الكامنة وراء وظيفة الأنسجة الشاذة أو المرض.سيتم توضيح الإجراءات يوم الأحد سليمان يوشيا ، طالب دكتوراه من مختبري. ابدأ بالتسليح المسبق لجميع الكواشف في حمام حبة 37 درجة مئوية وإذابة خلايا الكلى الجنينية البشرية KCC2b المستقرة بالكامل في حمام الخرز. ثم نقل الخلايا من أنبوب قارورة التبريد إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من الوسائط الطازجة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،200 G لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.بعد استنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة شفاط مثبتة بمضخة تفريغ ، أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من الوسائط الطازجة. انقل المعلق إلى طبق 10 سم واتركه ينمو لمدة 48 ساعة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 90٪ من الالتقاء ، قم بتقسيمها عن طريق استنشاق الوسائط القديمة وشطفها بملليلتر من PBS.أضف ملليلتر من التربسين واحتضنهما لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. اغسل خلايا التربسين باستخدام ملليلتر من الوسائط الكاملة. أضف تسعة ملليلتر من الوسائط الطازجة إلى الأطباق الجديدة.ثم أضف ملليلتر واحد من المحلول من الطبق القديم إلى الطبق الجديد. انقل أطباق الخلية المنقسمة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة لتحقيق أكثر من 90٪ من التقاء. عالج الخلايا إما باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو ثمانية ستوروسبورين ميكرومولار أو 0.5 مليمولار N-ethylmaleimide لمدة 15 دقيقة قبل الحصاد في محلول التحلل.استنشاق الوسائط من طبق الثقافة المنقولة ، ووضع أطباق الثقافة على الجليد ، وغسل الخلايا مع PBS الجليد البارد. نضح PBS وإضافة 1.0 ملليلتر من عازلة تحلل الجليد البارد إلى الطبق. بعد كشط الخلايا من قاع الطبق باستخدام مكشطة خلية بلاستيكية باردة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يوضع على الثلج ، يليه تحريض مستمر لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.بعد الطرد المركزي ، تحلل الخلية في جهاز طرد مركزي بارد ، ضعها على الجليد. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج مبرد مسبقا ، وتخلص من الحبيبات. ماصة 300 ميكرولتر من البروتين G Sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.ثم الطرد المركزي الحل في 500 غرام لمدة دقيقتين. بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من PBS ودوامة جيدا. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي وكرر الخطوة.بعد ذلك ، امزج ملليغرام واحد من الأجسام المضادة لثريونين KCC2 906 والأجسام المضادة لثريونين 1007 المضادة ل KCC2 مع 200 ميكرولتر من حبات Protein G Sepharose قبل تكوين الحجم إلى 500 ميكرولتر باستخدام PBS. بعد الاهتزاز على منصة تهتز أو عجلة دوارة لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية ، كرر غسلتين باستخدام PBS. قم بإجراء تقدير كمي للبروتين على محللات الخلية وأضف ملليغرام واحد من محللة الخلية إلى الخرز المغسول واحتضانه في دوار من طرف إلى طرف قبل الدوران.أعط ثلاث غسلات مع PBS تحتوي على 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم ، تليها ثلاث غسلات مع 200 ميكرولتر من PBS قبل إعادة تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة LDS. هز الأنابيب في شاكر الدوار في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. احتضانها في كتلة تسخين وطرد مركزي قبل استخدام المادة الطافية لتحميل الهلام.قم بتجميع جهاز صب Western Blot وصب جل فصل 8٪ طازج لصب الجل ، مما يتيح حوالي سنتيمترين من المساحة من أعلى زجاج الصب. أضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المطلق إلى الإعداد واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. قم بإزالة الأيزوبروبانول باستخدام ماصة وشطف الجل بعناية بحوالي 200 ميكرولتر من الماء المقطر.بعد إضافة جل تكديس طازج بنسبة 6٪ إلى إعداد الصب ، قم بتركيبه برفق في مشط البئر واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم ثبت الجل المصبوب في خزان الرحلان الكهربائي. بعد صب المخزن المؤقت الجاري في الخزان ، قم بتحميل خمسة ميكرولتر من علامة الوزن الجزيئي في البئر الأول وكمية متساوية من البروتين في كل بئر من هلام SDS-PAGE.املأ الآبار الفارغة ب LDS وقم بتشغيل الجل لمدة 90 إلى 120 دقيقة عند 120 فولت. إعادة ترطيب غشاء النيتروسليلوز مع نقل عازلة تحتوي على 20 ٪ من الميثانول. شطف الجل والغشاء مع المخزن المؤقت للنقل ونشرها برفق على كومة التحضير.رتب الساندويتش المراد نقله بهذا الترتيب: قطب سالب ، رغوة شطيرة ، جل SDS-PAGE مغسول بورق الترشيح ، غشاء نيتروسليلوز مغسول ، ورق ترشيح ، رغوة شطيرة ، قطب موجب. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتكديس الساندويتش المجمع في خزان النقل وقم بتشغيله عند 90 فولت لمدة 90 دقيقة أو 30 فولت لمدة 360 دقيقة. سد الغشاء الجاف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عازلة حجب.احتضان الأغشية مع التخفيفات المناسبة من الأجسام المضادة الأولية وبيتا أكتين في منع العازلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم أعط ثلاث غسلات من TBST لمدة خمس دقائق لكل منهما. احتضان الغشاء المغسول بجسم مضاد ثانوي مخفف في مخزن مؤقت للحجب لمدة 60 دقيقة وكرر ثلاث غسلات من TBST.بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الغشاء المغسول على لوحة التصوير. لتطوير الإشارات ، انشر المحلول المحضر عن طريق خلط أحجام متساوية من كل كاشف تلألؤ كيميائي محسن على الغشاء قبل نقل لوحة التصوير إلى نظام التصوير للتصوير. تسببت معالجة خلايا HEK293 باستخدام staurosporine و N-ethylmaleimide أو NEM في انخفاض الفسفرة في المواقع المستهدفة SPAK ، ثريونين 233 الموجود في مجال كيناز T-loop ، وموقع الفسفرة S-loop serine 373 من SPAK المعبر عنه داخليا.قلل Staurosporine من فسفرة سيرين 940 في خلايا HEK294 التي تعبر بثبات عن KCC2b ، لكن NEM زادت بشكل كبير من الفسفرة. علاوة على ذلك ، يقلل الستوروسبورين من الفسفرة في موقع ثريونين 505 ، بينما تسبب NEM في زيادة طفيفة ولكنها غير مهمة في الفسفرة في نفس الموقع. ترتبط التأثيرات التفاضلية لكلا المركبين على فسفرة بروتين كيناز C في موقع ثريونين 505 و KCC2b في موقع سيرين 940 ارتباطا جيدا.أظهرت النتيجة التمثيلية أيضا أن NEM تسبب في زيادة كبيرة في التعبير عن إجمالي كمية KCC2 ، في حين أن التعبير عن إجمالي NKCC1 و SPAK لم يتغير بشكل كبير عند معالجته بكلا المركبين. علاوة على ذلك ، تسبب المركبان في انخفاض فسفرة SPAK في مواقع ثريونين 233 وسيرين 373 ، وهذا مرتبط بالفسفرة المختصرة للثريونين 906/1007 والثريونين 203/207/212 والمعبر عنها داخليا NKCC1 على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، قلل ستوروسبورين و NEM من فسفرة بروتين كيناز C في موقع سيرين 940 وعبر بثبات عن KCC2b على التوالي ، والذي ارتبط بالتقليل والزيادة في فسفرة بروتين كيناز C دلتا في موقع ثريونين 505 عند معالجة الستوروسبورين و NEM على التوالي.إذا تم استخدام جسم مضاد أولي أو ثانوي غير صحيح ، فلن يتم رؤية الشريط أثناء التصوير. أيضا ، قد لا تكون الإشارة مرئية إذا تم استخدام تركيز منخفض جدا من الأجسام المضادة. هذه التقنية هي أداة ذات صلة في التحليل الكمي للبروتين وقد سمحت باستخدامها للعديد من الأغراض العلمية والموارد ، بما في ذلك كأداة تشخيص مبكر فعالة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA وCLC: Downregulation CLF-1-تعتمد من CNTFRα كما تظاهر عن طريق ويسترن التنشيف، تثبيط إنزيمات الليزوزومية، وسيتولوجية مناعية

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

إعداد Oligomer بيتا-اميلويد A11-إيجابية وتقييم استخدام دوت النشاف التحليل

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...