Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) og et Commonwealth Ph.D. Scholarship.

BEMÆRK: Protokollen beskriver western blotting-metoden til påvisning af specifikke proteiner af interesse.
1. Cellekultur og transfektion
<ol><li>Varm alle reagenserne i perlebadet (37 °C) op inden celledyrkningsproceduren. Forbered kulturmedium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% hver af 2mM L-glutamin, 100x ikke-essentiel aminosyre, 100 mM natriumpyruvat og 100 enheder / ml penicillin-streptomycin.</li>
	<li>Optøning af ...

Mange metoder er blevet brugt til at måle aktiviteterne i SLC12 af CCC'er, der udtrykkes i neuronerne, herunder KCC2. Mange af disse teknikker har vist sig at forbedre den videnskabelige viden om analysen af disse transportørers funktionelle relevans og deres strukturfunktionsmønstre i forskellige sygdomsrelaterede mutationer. Kritisk er der fordele og forbehold ved de forskellige metoder21. Protokollen forklaret ovenfor skitserede imidlertid, hvordan man vurderer KCC2-phosphorylering på kinas...

Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC'er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at Cl-homeostase fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning 1,2,3,4. Vedligeholdelsen af lav intraneuronal Cl-koncentration ([Cl-]i) ved 4-6 mM ved KCC2 letter γ-aminosmørsyre (GABA)/glycinhyperpolarisering og synaptisk hæmning i hjernen og rygmarven5. Manglende korrekt regulering af KCC2 har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi4. Desuden har nedsat KCC2-medieret Cl-ekstrudering og nedsat hyperpolariserende GABAA og / eller glycinreceptormedierede strømme været impliceret i epilepsi, neuropatisk smerte og spasticitet 6,7. Neuronal KCC2 moduleres negativt via phosphorylering af vigtige regulatoriske rester inden for dets C-terminale intracellulære domæne af det med-ingen-lysin (WNK)-STE20 / SPS1-relaterede prolin / alaninrige (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinasesignalkompleks1, hvilket letter vedligeholdelsen af depolariseret GABA-aktivitet i umodne neuroner 2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1 phosphorylerer threoninrester 906 og 1007 (Thr906 / Thr1007) og nedregulerer efterfølgende mRNA-genekspression af KCC2, hvilket fører til en deraf følgende forringelse af dets fysiologiske funktion 8,10. Endnu vigtigere er det imidlertid allerede en kendsgerning, at WNK-SPAK / OSR1 kinasekomplekset er kendt for phosphorylat og hæmmer KCC2-ekspression 1,2,4,11,12, og at inhiberingen af kinasekompleksets signalveje til phosphorylat Thr906 / Thr1007 har været forbundet med den øgede ekspression af KCC2 mRNA-genet 13,14,15 . Det er vigtigt at bemærke, at reguleringen af neuronal KCC2 og Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) ekspression via proteinfosforylering virker samtidigt og i omvendte mønstre 1,4,16.
Der er sket konsekvente og betydelige fremskridt med hensyn til forståelsen af de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, og som er akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Protokollen, der præsenteres her, fremhæver anvendelsen af western blotting-teknikker til at studere funktionerne og aktiviteterne hos neuronal K +-Cl-co-transporter KCC2 ved at undersøge phosphorylering af cotransporteren på kinaseregulerende steder Thr906/1007.
Western blot er en metode, der bruges til at detektere specifikke proteiner af interesse fra en prøve af væv eller celle. Denne metode adskiller først proteinerne efter størrelse gennem elektroforese. Proteinerne overføres derefter elektroforetisk til en fast støtte (normalt en membran), før målproteinet markeres ved hjælp af et specifikt antistof. Antistofferne er konjugeret til forskellige tags eller fluorophorekonjugerede antistoffer, der detekteres ved hjælp af enten kolorimetriske, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Dette gør det muligt at detektere et specifikt målprotein fra en blanding af proteiner. Denne teknik er blevet brugt til at karakterisere fosfospecifikke steder i KCCs1 og er blevet brugt til at identificere kinasehæmmere, der hæmmer KCC3 Thr991 / Thr1048 phosphorylation17. Ved at følge denne protokol kan man specifikt detektere total og phosphoryleret KCC2 fra celle / væv lysater. I princippet er påvisning af proteinkonjugerede antistoffer ved hjælp af denne teknik meget instrumentel, da det hjælper med at forbedre forståelsen af samarbejdsaktiviteter på phospho-stederne i KCC2, hvilket kaster lys over de molekylære mekanismer, der er involveret i deres fysiologiske reguleringer. Den kvantitative analyse af det samlede proteinekspression er repræsentativt for KCC2's funktion og aktivitet. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC'er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at Cl-homeostase fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning. Manglende korrekt regulering af KCC2 er skadelig og har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi. Der er sket betydelige fremskridt med hensyn til at forstå de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Her fremhæver protokollen, hvordan man undersøger KCC2-fosforylering på kinaseregulerende steder - Thr906 og Thr1007 - ved hjælp af western blotting-teknik. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase. Et par af disse yderligere teknikker vil kort blive diskuteret i dette manuskript.

Her undersøgte det repræsentative resultat, der blev præsenteret i figur 1, virkningen af staurosporin og NEM på WNK-SPAK / OSR1 medieret phosphorylering af KCC2 og NKCC1 i HEK293 cellelinjer, der stabilt udtrykker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 ved hjælp af western blotting-teknikken. Omfattende detaljer om de repræsentative resultater diskuteres i Zhang et al.15. I lighed med NAM er staurosporin en bred kinasehæmmer, der kan ...

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Den nuværende protokol fremhæver anvendelsen af western blotting teknik til at studere funktioner og aktiviteter af neuronal K-Cl co-transporter KCC2. Protokollen beskriver undersøgelsen af KCC2-phosphorylering på kinaseregulerende steder Thr906/1007 via western blotting. Yderligere metoder til bekræftelse af KCC2-aktivitet er også kort fremhævet i denne tekst.

Undersøgelse af funktioner og aktiviteter af neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 ved hjælp af Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Denne protokol kan hjælpe med at forstå de mekanismer, der er involveret i KCC2-regulering ved direkte at vurdere dens kinasemolekylære størrelse phosphorylering og dermed kaste lys over dets fysiologiske funktioner og aktiviteter. Det kan bruges til at identificere og karakterisere molekyler som proteiner af interesse fra komplekse blandinger af beslægtede molekyler, selv når et proteinudtryk er meget minut. Teknikken er et vigtigt redskab til proteinanalyse af komplekse systemer og identifikation af potentielle mekanismer, der ligger til grund for afvigende vævsfunktion eller sygdom.Søndag demonstrerer Solomon Josiah, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium. Begynd med at forarme alle reagenser i 37 grader Celsius perlebadet og optø den stabilt transected rotte KCC2b menneskelige embryonale nyre 293 celler helt i perlebadet. Overfør derefter cellerne fra cryo hætteglasrøret til et centrifugerør indeholdende fem milliliter friske medier og centrifuger cellerne ved 1.200 G i tre til fem minutter.Efter aspirering af supernatanten ved hjælp af en aspiratorpipette fastgjort til en vakuumpumpe, suspenderer cellerne i 10 ml friske medier. Overfør suspensionen til en 10 centimeter opvaskeplade og lad den vokse i 48 timer i en inkubator med 37 grader Celsius temperatur og 5% kuldioxid. Når cellerne når 90% sammenløb, opdeles dem ved at suge de gamle medier og skylle dem med to milliliter PBS.Tilsæt to milliliter trypsin og inkuber dem i cirka et til to minutter ved stuetemperatur. Vask de trypsiniserede celler ved hjælp af to milliliter af det komplette medie. Tilsæt ni milliliter friske medier til de nye retter.Tilsæt derefter en milliliter opløsning fra den gamle skål til den nye skål. Overfør de delte celleretter til inkubatoren i 48 timer for at opnå mere end 90% sammenløb. Cellerne behandles med enten dimethylsulfoxid, otte mikromolære staurosporin eller 0,5 millimolar N-ethylmaleimid i 15 minutter, før de høstes i lysisbuffer.Aspirer medierne fra den transected kulturskål, læg kulturskålene på is og vask cellerne med iskold PBS. Aspirer PBS og tilsæt 1,0 ml iskold lysisbuffer til skålen. Efter skrabning af cellerne fra bunden af skålen ved hjælp af en kold plastcelleskraber overføres cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør anbragt på is efterfulgt af konstant omrøring i 30 minutter ved fire grader Celsius.Efter centrifugering af cellelysaterne i en kold centrifuge placeres den på is. Saml supernatanten i et forkølet frisk rør, og kassér pelleten. Pipetter 300 mikroliter protein G Sepharose i et mikrocentrifugerør.Derefter centrifugeres opløsningen ved 500 G i to minutter. Efter kassation af supernatanten tilsættes 500 mikroliter PBS og hvirvelbrønd. Kassér supernatanten efter centrifugering og gentag trinnet.Bland derefter et milligram anti-KCC2 threonin 906 og anti-KCC2 threonin 1007 antistoffer med 200 mikroliter protein G Sepharose perler, før du udgør volumenet til 500 mikroliter med PBS. Efter at have rystet på en vibrerende platform eller roterende hjul i to timer ved fire grader Celsius, gentag to vaske med PBS. Udfør proteinkvantificering på cellelysaterne, og tilsæt et milligram cellelysatet til de vaskede perler og inkuber i en ende-til-ende rotator, før den spinder ned.Giv tre vaske med PBS indeholdende 150 millimolar natriumchlorid, efterfulgt af tre vaske med 200 mikroliter PBS, før den sidste pellet genindgives i 100 mikroliter LDS-prøvebuffer. Ryst rørene i en rotorryster ved stuetemperatur i fem minutter. Inkuber dem i en varmeblok og centrifuger dem, før du bruger supernatanten til gelpåfyldning.Saml Western Blot-støbeapparatet, og hæld frisklavet 8% adskillende gel for at støbe gelen, hvilket giver cirka to centimeter plads fra toppen af støbeglasset. Tilsæt 200 mikroliter absolut isopropanol til opsætningen og lad den stå ved stuetemperatur i 60 minutter. Fjern isopropanol med en pipette, og skyl gelen forsigtigt med ca. 200 mikroliter destilleret vand.Efter tilsætning af frisklavet 6% stablingsgel til støbeopsætningen skal du forsigtigt passe i brøndkammen og lade stå ved stuetemperatur i 30 minutter. Fastgør derefter den støbte gel i elektroforesetanken. Efter hældning af den løbende buffer i tanken skal du lægge fem mikroliter molekylvægtmarkør i den første brønd og en lige stor mængde protein i hver brønd i SDS-PAGE-gelen.Fyld de tomme brønde med LDS og kør gelen i ca. 90 til 120 minutter ved 120 volt. Rehydrere nitrocellulosemembranen med overførselsbuffer indeholdende 20% methanol. Skyl gelen og membranen med overførselsbufferen og spred dem forsigtigt ud på forberedelsesstakken.Arranger sandwichen, der skal overføres i denne rækkefølge: negativ elektrode, sandwichskum, filterpapir skyllet SDS-PAGE gel, skyllet nitrocellulosemembran, filterpapir, sandwichskum, positiv elektrode. Når du er færdig, skal du stable den samlede sandwich i overførselstanken og køre ved 90 volt i 90 minutter eller 30 volt i 360 minutter. Bloker den tørre membran i en time ved stuetemperatur ved hjælp af en blokerende buffer.Inkubere membranerne med passende fortyndinger af primært antistof og beta-actin i blokerende buffer i en time ved stuetemperatur eller natten over ved fire grader Celsius. Giv derefter tre vaske TBST i fem minutter hver. Inkuber den vaskede membran med et sekundært antistof fortyndet i en blokerende buffer i 60 minutter og gentag tre vaske TBST.Når du er færdig, skal du placere den vaskede membran på billeddannelseskortet. For at udvikle signalerne spredes den fremstillede opløsning ved at blande lige store mængder af hvert forbedret kemiluminescensreagens på membranen, inden billeddannelseskortet overføres til billeddannelsessystemet til billeddannelse. Behandlingen af HEK293-celler med staurosporin og N-ethylmaleimid eller NEM forårsagede nedsat phosphorylering på SPAK-målsteder, threonin 233 beliggende i T-loop-kinasedomænet og S-loop-phosphoryleringsstedet serin 373 af endogent udtrykt SPAK.Staurosporin reducerede phosphoryleringen af serin 940 i HEK294-celler, der stabilt udtrykker KCC2b, men NEM øgede sin phosphorylering betydeligt. Desuden nedsætter staurosporin phosphorylering på threonin 505-stedet, mens NEM forårsagede en lille, men ubetydelig stigning i phosphorylering på samme sted. De differentielle virkninger af begge forbindelser på phosphorylering af proteinkinase C på threonin 505-stedet og KCC2b på serin 940-stedet korrelerer godt.Det repræsentative resultat viste også, at NEM forårsagede en signifikant stigning i ekspressionen af den samlede KCC2-mængde, mens ekspressionen af den samlede NKCC1 og SPAK ikke blev signifikant ændret, når den blev behandlet med begge forbindelser. Desuden forårsagede de to forbindelser en nedsat phosphorylering af SPAK på threonin 233 og serin 373 steder, og dette korrelerede med den forkortede phosphorylering af henholdsvis threonin 906/1007 og threonin 203/207/212 og endogent udtrykt NKCC1. Derudover reducerede og øgede staurosporin og NEM phosphoryleringen af proteinkinase C på henholdsvis serin 940-stedet og stabilt udtrykt KCC2b, hvilket korrelerede med reduktionen og forøgelsen i phosphorylering af proteinkinase C-delta på threonin 505-stedet ved henholdsvis staurosporin- og NEM-behandling.Hvis der anvendes et forkert primært eller sekundært antistof, ses båndet ikke under billeddannelsen. Signalet er muligvis ikke synligt, hvis der anvendes en for lav koncentration af antistof. Teknikken er et relevant værktøj i kvantitativ analyse af protein og har tilladt dets anvendelse til mange videnskabelige og ressourcemæssige formål, herunder som et effektivt tidligt diagnostisk værktøj.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA og CLC: CLF-1-afhængig Nedregulering af CNTFRa som demonstreret ved Western blotting, Inhibering af lysosomale enzymer, og Immunocytokemi

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting-protokollen for et lille antal hæmatopoietisk stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive β-amyloid Oligomer forberedelse og vurdering ved hjælp af Dot Blotting analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjælp af immunoreaktionsfremmende teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Oprensning af endogene drosophila transiente receptorpotentialekanaler

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...