Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) en een Commonwealth Ph.D. Scholarship.

OPMERKING: Het protocol beschrijft de western blotting-methode om specifieke eiwitten van belang te detecteren.
1. Celkweek en transfectie
<ol><li>Verwarm alle reagentia in het kralenbad (37 °C) vóór de celkweekprocedure. Bereid kweekmedium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% elk van 2mM L-glutamine, 100x niet-essentieel aminozuur, 100 mM natriumpyruvaat en 100 eenheden / ml penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Ontdooi stabi...

Veel methoden zijn gebruikt om de activiteiten van SLC12 van CCC's te meten die tot expressie komen in de neuronen, waaronder KCC2. Veel van deze technieken hebben bewezen de wetenschappelijke kennis te vergroten over de analyse van de functionele relevantie van deze transporters en hun structuur-functiepatronen in verschillende ziektegerelateerde mutaties. Kritisch zijn er voordelen en kanttekeningen bij de verschillende methoden21. Het hierboven uitgelegde protocol schetste echter hoe KCC2-fosfo...

Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kationchloride-cotransporters (CCC's), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming 1,2,3,4. Het behoud van een lage intraneuronale Cl-concentratie ([Cl-]i) bij 4-6 mM door KCC2 vergemakkelijkt γ-aminoboterzuur (GABA)/glycine hyperpolarisatie en synaptische remming in de hersenen en het ruggenmerg5. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie4. Bovendien zijn verminderde KCC2-gemedieerde Cl− extrusie en verminderde hyperpolariserende GABAA en/of glycine receptor-gemedieerde stromen betrokken bij epilepsie, neuropathische pijn en spasticiteit 6,7. Neuronale KCC2 wordt negatief gemoduleerd via fosforylering van belangrijke regulerende residuen binnen zijn C-terminale intracellulaire domein door het met-geen-lysine (WNK)-STE20/SPS1-gerelateerde proline/alanine-rijke (SPAK)/oxidatieve stress-responsieve (OSR) kinase signaleringscomplex1, wat het behoud van gedepolariseerde GABA-activiteit in onrijpe neuronenvergemakkelijkt 2,8,9 . De WNK-SPAK/OSR1 fosforyleert threonineresiduen 906 en 1007 (Thr906/Thr1007) en downreguleert vervolgens de mRNA-genexpressie van KCC2, wat leidt tot een daaruit voortvloeiende verslechtering van de fysiologische functie 8,10. Belangrijker is echter dat het al een feit is dat van het WNK-SPAK/OSR1-kinasecomplex bekend is dat het KCC2-expressie 1,2,4,11,12 fosforylaat en remt, en dat de remming van de kinasecomplexsignaleringsroutes naar fosforylaat Thr906/Thr1007 in verband is gebracht met de verhoogde expressie van het KCC2 mRNA-gen 13,14,15 . Het is belangrijk op te merken dat de regulatie van neuronale KCC2 en Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) expressie via eiwitfosforylering gelijktijdig en in omgekeerde patronen werkt 1,4,16.
Er is consistente en aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrip van mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Het hier gepresenteerde protocol benadrukt de toepassing van western blotting-technieken om de functies en activiteiten van neuronale K +-Cl- co-transporter KCC2 te bestuderen door de fosforylering van de cotransporter op kinase-regelgevende locaties Thr906/1007 te onderzoeken.
Western blot is een methode die wordt gebruikt om specifieke eiwitten van belang te detecteren uit een monster van weefsel of cel. Deze methode scheidt de eiwitten eerst op grootte door middel van elektroforese. De eiwitten worden vervolgens elektroforetisch overgebracht naar een vaste ondersteuning (meestal een membraan) voordat het doeleiwit wordt gemarkeerd met behulp van een specifiek antilichaam. De antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende tags of fluorofoor-geconjugeerde antilichamen die worden gedetecteerd met behulp van colorimetrische, chemiluminescentie of fluorescentiemethoden. Hierdoor kan een specifiek doeleiwit worden gedetecteerd uit een mengsel van eiwitten. Deze techniek is gebruikt om fosfospecifieke locaties van KCCCs1 te karakteriseren en is gebruikt om kinaseremmers te identificeren die KCC3 Thr991/Thr1048 fosforyleringremmen 17. Door dit protocol te volgen, kan men specifiek totaal en gefosforyleerd KCC2 detecteren uit cel/weefsellysaten. In principe is de detectie van eiwit-geconjugeerde antilichamen door deze techniek zeer instrumenteel omdat het helpt om het begrip van samenwerkingsactiviteiten op de fosfo-locaties van KCC2 te verbeteren, wat licht werpt op de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij hun fysiologische regulaties. De kwantitatieve analyse van de totale eiwitexpressie is representatief voor de functie en activiteit van KCC2. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kation-chloride-cotransporters (CCC's), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is schadelijk en is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrijpen van de mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Hier benadrukt het protocol hoe KCC2-fosforylering op kinase-regulerende locaties - Thr906 en Thr1007 - kan worden onderzocht met behulp van western blotting-techniek. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase. Een paar van deze aanvullende technieken zullen in dit manuscript kort worden besproken.

Hier onderzocht het representatieve resultaat in figuur 1 de impact van staurosporine en NEM op WNK-SPAK/OSR1 gemedieerde fosforylering van KCC2 en NKCC1 in HEK293-cellijnen die KCC2b (HEKrnKCC2b)18 stabiel tot expressie brengen met behulp van de western blotting-techniek. Uitgebreide details over de representatieve resultaten worden besproken in Zhang et al.15. Net als NEM is staurosporine een brede kinaseremmer die de KCC2...

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.

Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Dit protocol kan helpen om de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij KCC2-regulatie door de fosforylering van kinasemoleculaire grootte direct te beoordelen, waardoor licht wordt geworpen op de fysiologische functies en activiteiten. Het kan worden gebruikt om moleculen zoals interessante eiwitten uit complexe mengsels van verwante moleculen te identificeren en te karakteriseren, zelfs als een eiwitexpressie erg klein is. De techniek is een essentieel hulpmiddel voor eiwitanalyse van complexe systemen en het identificeren van potentiële mechanismen die ten grondslag liggen aan een afwijkende weefselfunctie of ziekte.De procedures worden gedemonstreerd door Sunday Solomon Josiah, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het voorbewapenen van alle reagentia in het kraalbad van 37 graden Celsius en het volledig ontdooien van de stabiel getranseceerde rat KCC2b menselijke embryonale nier 293-cellen volledig in het kralenbad. Breng vervolgens de cellen van de cryoflaconbuis over in een centrifugebuis met vijf milliliter verse media en centrifugeer de cellen gedurende drie tot vijf minuten bij 1.200 g.Na het aanzuigen van het supernatant met behulp van een aspiratorpipet die aan een vacuümpomp is bevestigd, resuspenseert u de cellen in 10 milliliter verse media. Breng de suspensie over op een schotelplaat van 10 centimeter en laat deze 48 uur groeien in een incubator met een temperatuur van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Zodra de cellen 90% confluency bereiken, splits ze door de oude media aan te zuigen en ze te spoelen met twee milliliter PBS.Voeg twee milliliter trypsine toe en incubeer ze ongeveer één tot twee minuten bij kamertemperatuur. Was de trypsinized cellen met twee milliliter van de volledige media. Voeg negen milliliter verse media toe aan de nieuwe gerechten.Voeg vervolgens een milliliter oplossing van het oude gerecht toe aan het nieuwe gerecht. Breng de gesplitste celschalen gedurende 48 uur over naar de incubator om meer dan 90% samenvloeiing te bereiken. Behandel de cellen met dimethylsulfoxide, acht micromolaire staurosporine of 0,5 millimolair N-ethylmaleimide gedurende 15 minuten voordat u in lysisbuffer oogst.Haal de media uit de getranseceerde kweekschaal, plaats de kweekschalen op ijs en was de cellen met ijskoude PBS. Adem de PBS aan en voeg 1,0 milliliter ijskoude lysisbuffer toe aan het gerecht. Nadat u de cellen van de bodem van de schaal hebt geschraapt met behulp van een koude plastic celschraper, brengt u de celsuspensie over in een microcentrifugebuis die op ijs is geplaatst, gevolgd door constante agitatie gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Na het centrifugeren van de cellysaten in een koude centrifuge, plaatst u deze op ijs. Verzamel het supernatant in een voorgekoelde verse buis en gooi de pellet weg. Pipetteer 300 microliter Protein G Sepharose in een microcentrifugebuis.Centrifugeer vervolgens de oplossing op 500 G gedurende twee minuten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, voegt u 500 microliter PBS en vortex goed toe. Gooi het supernatant na centrifugatie weg en herhaal de stap.Meng vervolgens een milligram anti-KCC2 threonine 906 en anti-KCC2 threonine 1007 antilichamen met 200 microliter Protein G Sepharose kralen voordat u het volume tot 500 microliter met PBS maakt. Na twee uur schudden op een trillend platform of draaiend wiel bij vier graden Celsius, herhaal je twee wasbeurten met PBS. Voer eiwitkwantificering uit op de cellysaten en voeg één milligram van het cellysaat toe aan de gewassen kralen en incubeer in een end-to-end rotator voordat je naar beneden draait.Geef drie wasbeurten met PBS die 150 millimol natriumchloride bevatten, gevolgd door drie wasbeurten met 200 microliter PBS voordat de uiteindelijke pellet in 100 microliter LDS-monsterbuffer wordt geresuspendeerd. Schud de buizen in een rotorschudder bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Incubeer ze in een verwarmingsblok en centrifugeer ze voordat je het supernatant gebruikt voor het laden van gel.Monteer het Western Blot-gietapparaat en giet vers bereide 8% scheidingsgel om de gel te gieten, waardoor ongeveer twee centimeter ruimte vanaf de bovenkant van het gietglas ontstaat. Voeg 200 microliter absolute isopropanol toe aan de opstelling en laat het 60 minuten op kamertemperatuur staan. Verwijder de isopropanol met een pipet en spoel de gel voorzichtig af met ongeveer 200 microliter gedestilleerd water.Na het toevoegen van vers bereide 6% stapelgel aan de gietopstelling, plaats je voorzichtig in de putkam en laat je 30 minuten op kamertemperatuur staan. Bevestig vervolgens de gegoten gel in de elektroforesetank. Nadat u de lopende buffer in de tank hebt gegoten, laadt u vijf microliter moleculaire gewichtsmarker in de eerste put en een gelijke hoeveelheid eiwit in elke put van de SDS-PAGE-gel.Vul de lege putjes met LDS en laat de gel ongeveer 90 tot 120 minuten op 120 volt draaien. Hydrateer het nitrocellulosemembraan met transferbuffer die 20% methanol bevat. Spoel de gel en het membraan af met de transferbuffer en spreid ze voorzichtig uit op de bereidingsstapel.Rangschik de over te brengen sandwich in deze volgorde: negatieve elektrode, sandwichschuim, filterpapier gespoelde SDS-PAGE-gel, gespoeld nitrocellulosemembraan, filterpapier, sandwichschuim, positieve elektrode. Als u klaar bent, stapelt u de gemonteerde sandwich in de overdrachtstank en draait u gedurende 90 minuten op 90 volt of 30 volt gedurende 360 minuten. Blokkeer het droge membraan gedurende een uur bij kamertemperatuur met behulp van een blokkerende buffer.Incubeer de membranen met geschikte verdunningen van primair antilichaam en bèta-actine in blokkerende buffer gedurende één uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius. Geef vervolgens drie wasbeurten tbst gedurende elk vijf minuten. Incubeer het gewassen membraan met een secundair antilichaam verdund in een blokkerende buffer gedurende 60 minuten en herhaal drie wasbeurten van TBST.Als u klaar bent, plaatst u het gewassen membraan op het beeldplaatje. Om de signalen te ontwikkelen, verspreidt u de oplossing bereid door gelijke volumes van elk verbeterd chemiluminescentieregenns op het membraan te mengen voordat u de beeldvormingskaart naar het beeldvormingssysteem overbrengt voor beeldvorming. De behandeling van HEK293-cellen met staurosporine en N-ethylmaleimide of NEM veroorzaakte verminderde fosforylering op SPAK-doellocaties, threonine 233 gelegen in het T-luskinasedomein en de S-lus fosforyleringsplaats serine 373 van endogene tot expressie gebracht SPAK.Staurosporine verminderde de fosforylering van serine 940 in HEK294-cellen die KCC2b stabiel tot expressie brachten, maar NEM verhoogde de fosforylering aanzienlijk. Bovendien vermindert staurosporine de fosforylering op de threonine 505-site, terwijl NEM een lichte maar onbeduidende toename van fosforylering op dezelfde locatie veroorzaakte. De differentiële effecten van beide verbindingen op de fosforylering van eiwitkinase C op de threonine 505-site en KCC2b op de serine 940-site correleren goed.Het representatieve resultaat toonde ook aan dat NEM een significante toename van de expressie van de totale KCC2-hoeveelheid veroorzaakte, terwijl de uitdrukking van de totale NKCC1 en SPAK niet significant veranderde wanneer ze met beide verbindingen werden behandeld. Bovendien veroorzaakten de twee verbindingen een verminderde fosforylering van SPAK op threonine 233 en serine 373 locaties, en dit correleerde met de verkorte fosforylering van respectievelijk threonine 906/1007 en threonine 203/207/212 en endogene uitgedrukte NKCC1. Bovendien verminderden en verhoogden staurosporine en NEM de fosforylering van eiwitkinase C op respectievelijk de serine 940-site en stabiel tot expressie gebracht KCC2b, wat correleerde met de vermindering en toename van de fosforylering van eiwitkinase C-delta op de threonine 505-site bij respectievelijk staurosporine- en NEM-behandeling.Als een onjuist primair of secundair antilichaam wordt gebruikt, wordt de band niet gezien tijdens de beeldvorming. Ook is het signaal mogelijk niet zichtbaar als een te lage concentratie antilichaam wordt gebruikt. De techniek is een relevant hulpmiddel bij de kwantitatieve analyse van eiwitten en heeft het gebruik ervan voor vele wetenschappelijke en hulpbronnendoeleinden mogelijk gemaakt, waaronder als een effectief vroeg diagnostisch hulpmiddel.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA en CLC: CLF-1-afhankelijke negatieve regulatie van CNTFRa zoals aangetoond door Western blotting, Remming van lysosomale enzymen en immunocytochemie

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot met behulp van Immunoreaction Enhancing Technology

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...