Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Royal Society UK (subvention no. IEC\NSFC\201094) et une bourse de doctorat du Commonwealth.

REMARQUE : Le protocole décrit la méthode de transfert Western pour détecter des protéines d’intérêt spécifiques.
1. Culture cellulaire et transfection
<ol><li>Réchauffer tous les réactifs dans le bain de billes (37 °C) avant la procédure de culture cellulaire. Préparer le milieu de culture, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de L-glutamine de 2 mM, 100 fois plus d’acides aminés non essentiels, 100 mM...

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour mesurer les activités de SLC12 des CCC qui sont exprimées dans les neurones, y compris KCC2. Bon nombre de ces techniques se sont avérées améliorer les connaissances scientifiques sur l’analyse de la pertinence fonctionnelle de ces transporteurs et de leurs schémas structure-fonction dans différentes mutations liées à la maladie. De manière critique, il y a des avantages et des mises en garde aux différentes méthodes21. Cependant, le ...

Le cotransporteur de chlorure de potassium 2 (KCC2) est un membre de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure de cations (CCC), présents exclusivement dans le neurone et est essentiel au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl- et par conséquent à l’inhibition GABAergique fonctionnelle 1,2,3,4. Le maintien d’une faible concentration intraneuronale de Cl- ([Cl-]i) à 4-6 mM par KCC2 facilite l’hyperpolarisation de l’acide γ-aminobutyrique (GABA)/glycine et l’inhibition synaptique dans le cerveau et la moelle épinière5. L’échec de la régulation correcte de KCC2 a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie4. De plus, une diminution de l’extrusion Cl− médiée par KCC2 et une altération des courants hyperpolarisants médiés par le GABAA et/ou les récepteurs de glycine ont été impliqués dans l’épilepsie, la douleur neuropathique et la spasticité 6,7. Le KCC2 neuronal est modulé négativement par phosphorylation de résidus régulateurs clés dans son domaine intracellulaire C-terminal par le complexe de signalisation kinase proline/alanine-rich (SPAK)/sensible au stress oxydatif (OSR)lié à la proline/SPS1 sans lysine (WNK)-STE20/SPS1, qui facilite le maintien de l’activité dépolarisée du GABA dans les neurones immatures 2,8,9 . Le WNK-SPAK/OSR1 phosphoryle les résidus de thréonine 906 et 1007 (Thr906/Thr1007) et régule par la suite à la baisse l’expression du gène de l’ARNm de KCC2, entraînant une détérioration conséquente de sa fonction physiologique 8,10. Plus important encore, cependant, il est déjà un fait que le complexe kinase WNK-SPAK/OSR1 est connu pour phosphoryler et inhiber l’expression de KCC2 1,2,4,11,12, et que l’inhibition des voies de signalisation du complexe kinase pour phosphoryler Thr906/Thr1007 a été liée à l’expression accrue du gène de l’ARNm KCC2 13,14,15 . Il est important de noter que la régulation de l’expression neuronale KCC2 et Na+-K+-2Cl- cotransporteurs 1 (NKCC1) via la phosphorylation des protéines fonctionne de manière concomitante et inverse 1,4,16.
Des progrès constants et considérables ont été accomplis en ce qui concerne la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédités pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Le protocole présenté ici met en évidence l’application des techniques de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du co-transporteur neuronal K+-Cl- KCC2 en étudiant la phosphorylation du cotransporteur sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007.
Le transfert Western est une méthode utilisée pour détecter des protéines spécifiques d’intérêt à partir d’un échantillon de tissu ou de cellule. Cette méthode sépare d’abord les protéines par taille par électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées électrophoristiquement sur un support solide (généralement une membrane) avant que la protéine cible ne soit marquée à l’aide d’un anticorps spécifique. Les anticorps sont conjugués à différents marqueurs ou anticorps conjugués au fluorophore qui sont détectés à l’aide de méthodes colorimétriques, de chimiluminescence ou de fluorescence. Cela permet de détecter une protéine cible spécifique à partir d’un mélange de protéines. Cette technique a été utilisée pour caractériser les sites phosphospécifiques des KCC1 et a été utilisée pour identifier les inhibiteurs de kinases qui inhibent la phosphorylation KCC3 Thr991/Thr104817. En suivant ce protocole, on peut détecter spécifiquement KCC2 total et phosphorylé à partir de lysats cellulaires / tissulaires. En principe, la détection d’anticorps conjugués aux protéines par cette technique est très instrumentale car elle permet d’améliorer la compréhension des activités coopératives sur les sites phosphographiques de KCC2, ce qui met en lumière les mécanismes moléculaires impliqués dans leurs régulations physiologiques. L’analyse quantitative de l’expression totale des protéines est représentative de la fonction et de l’activité de KCC2. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Les cotransporteurs de chlorure de potassium 2 (KCC2) font partie de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure cationique (CCC), présents exclusivement dans le neurone et sont essentiels au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl- et par conséquent à l’inhibition fonctionnelle du GABAergique. L’échec de la régulation correcte de KCC2 est délétère et a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie. Des progrès considérables ont été accomplis dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédité pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Ici, le protocole souligne comment étudier la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases - Thr906 et Thr1007 - en utilisant la technique de transfert western. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire. Quelques-unes de ces techniques supplémentaires seront brièvement discutées dans ce manuscrit.

Ici, le résultat représentatif présenté à la figure 1 a étudié l’impact de la staurosporine et de la NEM sur la phosphorylation médiée par WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 et NKCC1 dans les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable KCC2b (HEKrnKCC2b)18 en utilisant la technique de transfert Western. Des détails complets sur les résultats représentatifs sont discutés dans Zhang et al.15. Semblable à NEM, l...

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Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Le présent protocole met en évidence l’application de la technique de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du cotransporteur neuronal K-Cl KCC2. Le protocole décrit l’étude de la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007 par transfert Western. En outre, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’activité de KCC2 sont brièvement mises en évidence dans ce texte.

Etude des fonctions et activités du co-transporteur neuronal K-CL KCC2 par transfert Western

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Ce protocole peut aider à comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de KCC2 en évaluant directement sa phosphorylation de taille moléculaire kinase, mettant ainsi en lumière ses fonctions et activités physiologiques. Il peut être utilisé pour identifier et caractériser des molécules comme des protéines d’intérêt à partir de mélanges complexes de molécules apparentées, même lorsqu’une expression protéique est très infime. La technique est un outil essentiel pour l’analyse des protéines de systèmes complexes et l’identification des mécanismes potentiels sous-jacents à la fonction tissulaire aberrante ou à la maladie.La démonstration des procédures sera Sunday Solomon Josiah, un doctorant de mon laboratoire. Commencez par préarmer tous les réactifs dans le bain de perles de 37 degrés Celsius et décongelez complètement les cellules embryonnaires de rein humain KCC2b du rat KCC2b dans le bain de perles. Ensuite, transférez les cellules du tube cryo dans un tube centrifuge contenant cinq millilitres de milieu frais et centrifugez les cellules à 1 200 G pendant trois à cinq minutes.Après avoir aspiré le surnageant à l’aide d’une pipette d’aspiration fixée à une pompe à vide, remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres de fluide frais. Transférez la suspension dans une assiette à plat de 10 centimètres et laissez-la pousser pendant 48 heures dans un incubateur ayant une température de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Une fois que les cellules atteignent 90% de confluence, divisez-les en aspirant les anciens milieux et en les rinçant avec deux millilitres de PBS.Ajouter deux millilitres de trypsine et les incuber pendant environ une à deux minutes à température ambiante. Lavez les cellules trypsinisées en utilisant deux millilitres du média complet. Ajoutez neuf millilitres de produits frais aux nouveaux plats.Ajoutez ensuite un millilitre de solution de l’ancien plat au nouveau. Transférer les antennes paraboliques fractionnées dans l’incubateur pendant 48 heures pour atteindre plus de 90% de confluence. Traiter les cellules avec du diméthylsulfoxyde, huit micromolaires staurosporine ou 0,5 millimolaire de N-éthylmaléimide pendant 15 minutes avant de récolter dans un tampon de lyse.Aspirez les médias de la boîte de culture transectée, placez les plats de culture sur de la glace et lavez les cellules avec du PBS glacé. Aspirez le PBS et ajoutez 1,0 millilitre de tampon de lyse glacée au plat. Après avoir gratté les cellules du fond de la boîte à l’aide d’un grattoir de cellules en plastique froid, transférer la suspension de cellules dans un tube microcentrifuge placé sur de la glace, suivi d’une agitation constante pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir centrifugé les lysats cellulaires dans une centrifugeuse froide, placez-les sur de la glace. Recueillir le surnageant dans un tube frais pré-refroidi et jeter le granulé. Pipeter 300 microlitres de sépharose de protéine G dans un tube microcentrifugeux.Centrifuger ensuite la solution à 500 G pendant deux minutes. Après avoir jeté le surnageant, ajoutez bien 500 microlitres de PBS et de vortex. Jeter le surnageant après centrifugation et répéter l’étape.Ensuite, mélangez un milligramme d’anticorps anti-KCC2 thréonine 906 et anti-KCC2 thréonine 1007 avec 200 microlitres de billes de sépharose de protéine G avant de porter le volume à 500 microlitres avec du PBS. Après avoir secoué sur une plate-forme vibrante ou une roue tournante pendant deux heures à quatre degrés Celsius, répétez deux lavages avec du PBS. Effectuer la quantification des protéines sur les lysats cellulaires et ajouter un milligramme du lysat cellulaire aux billes lavées et incuber dans un rotateur de bout en bout avant de tourner.Donner trois lavages avec du PBS contenant 150 millimolaires de chlorure de sodium, suivis de trois lavages avec 200 microlitres de PBS avant de remettre en suspension la pastille finale dans 100 microlitres de tampon d’échantillon LDS. Agiter les tubes dans un agitateur à rotor à température ambiante pendant cinq minutes. Incuber dans un bloc chauffant et les centrifuger avant d’utiliser le surnageant pour la charge de gel.Assemblez l’appareil de coulée Western Blot et versez du gel de séparation à 8% fraîchement préparé pour couler le gel, en laissant environ deux centimètres d’espace par rapport au haut du verre coulé. Ajoutez 200 microlitres d’isopropanol absolu à l’installation et laissez-la reposer à température ambiante pendant 60 minutes. Retirez l’isopropanol à l’aide d’une pipette et rincez soigneusement le gel avec environ 200 microlitres d’eau distillée.Après avoir ajouté du gel empilable à 6% fraîchement préparé à la configuration de coulée, ajuster délicatement dans le peigne du puits et laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, fixez le gel moulé dans le réservoir d’électrophorèse. Après avoir versé le tampon courant dans le réservoir, chargez cinq microlitres de marqueur de poids moléculaire dans le premier puits et une quantité égale de protéines dans chaque puits du gel SDS-PAGE.Remplissez les puits vides avec LDS et faites fonctionner le gel pendant environ 90 à 120 minutes à 120 volts. Réhydrater la membrane de nitrocellulose avec un tampon de transfert contenant 20% de méthanol. Rincez le gel et la membrane avec le tampon de transfert et étalez-les délicatement sur la pile de préparation.Disposez le sandwich à transférer dans cet ordre: électrode négative, mousse sandwich, papier filtre gel SDS-PAGE rincé, membrane de nitrocellulose rincée, papier filtre, mousse sandwich, électrode positive. Une fois cela fait, empilez le sandwich assemblé dans le réservoir de transfert et faites fonctionner à 90 volts pendant 90 minutes ou 30 volts pendant 360 minutes. Bloquer la membrane sèche pendant une heure à température ambiante à l’aide d’un tampon de blocage.Incuber les membranes avec des dilutions appropriées d’anticorps primaires et de bêta-actine dans un tampon de blocage pendant une heure à température ambiante ou pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, donnez trois lavages de TBST pendant cinq minutes chacun. Incuber la membrane lavée avec un anticorps secondaire dilué dans un tampon bloquant pendant 60 minutes et répéter trois lavages de TBST.Une fois cela fait, placez la membrane lavée sur la carte d’imagerie. Pour développer les signaux, étaler la solution préparée en mélangeant des volumes égaux de chaque réactif de chimiluminescence améliorée sur la membrane avant de transférer la carte d’imagerie dans le système d’imagerie pour l’imagerie. Le traitement des cellules HEK293 avec de la staurosporine et du N-éthylmaléimide ou NEM a entraîné une diminution de la phosphorylation sur les sites cibles SPAK, la thréonine 233 située dans le domaine de la kinase de la boucle T et la sérine 373 du site de phosphorylation de la boucle S de SPAK exprimée de manière endogène.La staurosporine a réduit la phosphorylation de la sérine 940 dans les cellules HEK294 exprimant de manière stable KCC2b, mais NEM a significativement augmenté sa phosphorylation. De plus, la staurosporine diminue la phosphorylation au site de la thréonine 505, alors que la NEM a provoqué une augmentation légère mais insignifiante de la phosphorylation sur le même site. Les effets différentiels des deux composés sur la phosphorylation de la protéine kinase C au site thréonine 505 et de KCC2b au site sérine 940 sont bien corrélés.Le résultat représentatif a également montré que NEM entraînait une augmentation significative de l’expression de la quantité totale de KCC2, alors que l’expression du NKCC1 total et du SPAK n’était pas significativement modifiée lorsqu’ils étaient traités avec les deux composés. De plus, les deux composés ont provoqué une diminution de la phosphorylation de SPAK aux sites de thréonine 233 et de sérine 373, ce qui était corrélé avec la phosphorylation abrégée de la thréonine 906/1007 et de la thréonine 203/207/212 et de NKCC1 exprimée de manière endogène respectivement. De plus, la staurosporine et le NEM ont réduit et augmenté la phosphorylation de la protéine kinase C au site de la sérine 940 et exprimé de manière stable KCC2b respectivement, ce qui était corrélé avec la réduction et l’augmentation de la phosphorylation de la protéine kinase C delta au site de la thréonine 505 après le traitement par staurosporine et NEM respectivement.Si un anticorps primaire ou secondaire inapproprié est utilisé, la bande ne sera pas visible pendant l’imagerie. En outre, le signal peut ne pas être visible si une concentration trop faible d’anticorps est utilisée. La technique est un outil pertinent dans l’analyse quantitative des protéines et a permis son utilisation à de nombreuses fins scientifiques et de ressources, y compris comme un outil de diagnostic précoce efficace.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Recherche

Biochimie

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SORLA et CLC: CLF-1 La régulation négative dépendant de CNTFRα tel que démontré par Western blot, Inhibition de lysosomale Enzymes et Immunocytochimie

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de Dot Blot Analysis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Petits dosages colorimétriques de Lactate intracellulaire et Pyruvate chez le nématode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Tache occidentale à très grande vitesse utilisant la technologie d’amélioration de l’immunoréaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...