Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) und einem Commonwealth Ph.D. Stipendium unterstützt.

HINWEIS: Das Protokoll beschreibt die Western-Blotting-Methode, um bestimmte Proteine von Interesse zu erkennen.
1. Zellkultur und Transfektion
<ol><li>Erwärmen Sie alle Reagenzien vor dem Zellkulturvorgang im Kugelbad (37 °C). Bereiten Sie das Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, jeweils 1% 2mM L-Glutamin, 100x nicht-essentieller Aminosäure, 100 mM Natriumpyruvat und 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin.</l...

Viele Methoden wurden verwendet, um die Aktivitäten von SLC12 von CCCs zu messen, die in den Neuronen exprimiert werden, einschließlich KCC2. Viele dieser Techniken haben sich als wissenschaftliche Erkenntnisse über die Analyse der funktionellen Relevanz dieser Transporter und ihrer Struktur-Funktionsmuster bei verschiedenen krankheitsbedingten Mutationen erwiesen. Entscheidend ist, dass die verschiedenen Methoden Vorteile und Vorbehalte haben21. Das oben erläuterte Protokoll beschreibt jedoch...

Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) ist ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung 1,2,3,4 unerlässlich sind. Die Aufrechterhaltung einer niedrigen intraneuronalen Cl-Konzentration ([Cl-]i) bei 4-6 mM durch KCC2 erleichtert die Hyperpolarisation von γ-Aminobuttersäure (GABA)/Glycin und die synaptische Hemmung im Gehirn und Rückenmark 5. Das Versagen bei der richtigen Regulation von KCC2 wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie4, in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurden verminderte KCC2-vermittelte Cl−-Extrusion und gestörte hyperpolarisierendeGABA-A- und/oder Glycinrezeptor-vermittelte Ströme mit Epilepsie, neuropathischen Schmerzen und Spastik in Verbindung gebracht 6,7. Neuronales KCC2 wird durch Phosphorylierung wichtiger regulatorischer Reste innerhalb seiner C-terminalen intrazellulären Domäne durch den mit No-Lysin (WNK)-STE20/SPS1-verwandten Prolin/Alanin-reichen (SPAK)/Oxidative Stress-responsive (OSR) Kinase-Signalkomplex1 negativ moduliert, was die Aufrechterhaltung der depolarisierten GABA-Aktivität in unreifen Neuronen erleichtert 2,8,9 . Der WNK-SPAK/OSR1 phosphoryliert die Threoninreste 906 und 1007 (Thr906/Thr1007) und reguliert anschließend die mRNA-Genexpression von KCC2 herunter, was zu einer Verschlechterung seiner physiologischen Funktion führt 8,10. Noch wichtiger ist jedoch, dass es bereits eine Tatsache ist, dass der WNK-SPAK/OSR1-Kinase-Komplex dafür bekannt ist, die KCC2-Expression 1,2,4,11,12 zu phosphorylieren und zu hemmen, und dass die Hemmung der Kinase-Komplex-Signalwege zum Phosphorylat Thr906/Thr1007 mit der erhöhten Expression des KCC2-mRNA-Gens in Verbindung gebracht wurde13,14,15 . Es ist wichtig zu beachten, dass die Regulation der neuronalen KCC2- und Na+-K+-2Cl-Cotransporter 1 (NKCC1) Expression über Proteinphosphorylierung gleichzeitig und in umgekehrten Mustern 1,4,16 funktioniert.
Es wurden beständige und beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die der Entwicklung von Techniken zugeschrieben wurden, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Das hier vorgestellte Protokoll hebt die Anwendung von Western-Blotting-Techniken hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K+-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen, indem die Phosphorylierung des Cotransporters an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 untersucht wird.
Western Blot ist eine Methode, um bestimmte Proteine von Interesse aus einer Gewebe- oder Zellprobe nachzuweisen. Diese Methode trennt die Proteine zunächst durch Elektrophorese nach Größe. Die Proteine werden dann elektrophoretisch auf einen festen Träger (meist eine Membran) übertragen, bevor das Zielprotein mit einem spezifischen Antikörper markiert wird. Die Antikörper werden an verschiedene Tags oder fluorophorkonjugierte Antikörper konjugiert, die entweder kolorimetrische, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden nachgewiesen werden. Dadurch kann ein spezifisches Zielprotein aus einer Mischung von Proteinen nachgewiesen werden. Diese Technik wurde verwendet, um phosphospezifische Stellen von KCCs1 zu charakterisieren und Kinase-Inhibitoren zu identifizieren, die die KCC3 Thr991/Thr1048-Phosphorylierunghemmen 17. Durch die Befolgung dieses Protokolls kann man spezifisch Gesamt- und phosphoryliertes KCC2 aus Zell- / Gewebelysaten nachweisen. Prinzipiell ist der Nachweis von proteinkonjugierten Antikörpern durch diese Technik sehr hilfreich, da er dazu beiträgt, das Verständnis kooperativer Aktivitäten an den Phospho-Stellen von KCC2 zu verbessern, was Aufschluss über die molekularen Mechanismen gibt, die an ihrer physiologischen Regulation beteiligt sind. Die quantitative Analyse der Gesamtproteinexpression ist repräsentativ für die Funktion und Aktivität von KCC2. Es gibt andere klassische Methoden zur direkten Messung der KCC2-Aktivität, wie Rubidiumionen- und Thalliumionenaufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) sind ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung unerlässlich sind. Das Versagen bei der richtigen Regulierung von KCC2 ist schädlich und wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie, in Verbindung gebracht. Es wurden beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die für die Entwicklung von Techniken verantwortlich sind, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Hier zeigt das Protokoll, wie die KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen - Thr906 und Thr1007 - mit der Western-Blotting-Technik untersucht werden kann. Es gibt andere klassische Methoden, die verwendet werden, um die KCC2-Aktivität direkt zu messen, wie Rubidium-Ionen- und Thallium-Ionen-Aufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert. Einige dieser zusätzlichen Techniken werden in diesem Manuskript kurz diskutiert.

Hier untersuchte das repräsentative Ergebnis in Abbildung 1 den Einfluss von Staurosporin und NEM auf die WNK-SPAK/OSR1-vermittelte Phosphorylierung von KCC2 und NKCC1 in HEK293-Zelllinien, die KCC2b (HEKrnKCC2b)18 stabil exprimieren, unter Verwendung der Western Blotting-Technik. Umfassende Details zu den repräsentativen Ergebnissen werden in Zhang et al.15 diskutiert. Ähnlich wie NEM ist Staurosporin ein breiter Kinase-...

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Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Dieses Protokoll kann helfen, die Mechanismen der KCC2-Regulation zu verstehen, indem es die Phosphorylierung seiner Kinase-Molekülgröße direkt bewertet und so Aufschluss über seine physiologischen Funktionen und Aktivitäten gibt. Es kann verwendet werden, um Moleküle wie Proteine von Interesse aus komplexen Mischungen verwandter Moleküle zu identifizieren und zu charakterisieren, selbst wenn eine Proteinexpression sehr klein ist. Die Technik ist ein wesentliches Werkzeug für die Proteinanalyse komplexer Systeme und die Identifizierung potenzieller Mechanismen, die einer aberranten Gewebefunktion oder -erkrankung zugrunde liegen.Die Verfahren wird Sunday Solomon Josiah, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbewaffnung aller Reagenzien im 37 Grad Celsius heißen Perlenbad und dem Auftauen der stabil transezierten Ratte KCC2b humane embryonale Nierenzellen vollständig im Perlenbad. Dann werden die Zellen aus dem Kryo-Fläschchenröhrchen in ein Zentrifugenröhrchen mit fünf Milliliter frischem Medium überführt und die Zellen bei 1.200 G für drei bis fünf Minuten zentrifugiert.Nach dem Absaugen des Überstands mit einer an einer Vakuumpumpe befestigten Aspiratorpipette resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter frischem Medium. Die Suspension auf eine 10 Zentimeter große Tellerplatte geben und 48 Stunden in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid wachsen lassen. Sobald die Zellen 90% Konfluenz erreicht haben, teilen Sie sie, indem Sie die alten Medien absaugen und mit zwei Milliliter PBS spülen.Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin hinzu und inkubieren Sie sie für etwa ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die trypsinisierten Zellen mit zwei Milliliter des kompletten Mediums. Fügen Sie neun Milliliter frische Medien zu den neuen Gerichten hinzu.Dann einen Milliliter Lösung aus der alten Schale in die neue Schale geben. Übertragen Sie die gespaltenen Zellschalen für 48 Stunden in den Inkubator, um eine Konfluenz von mehr als 90% zu erreichen. Behandeln Sie die Zellen entweder mit Dimethylsulfoxid, acht Mikromolaren Staurosporin oder 0,5 Millimolar N-Ethylmaleimid für 15 Minuten vor der Ernte im Lysepuffer.Saugen Sie die Medien aus der transezierten Kulturschale ab, stellen Sie das Kulturgeschirr auf Eis und waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS. Saugen Sie das PBS ab und geben Sie 1,0 Milliliter eiskalten Lysepuffer in die Schale. Nach dem Abkratzen der Zellen vom Boden der Schale mit einem kalten Kunststoffzellenschaber wird die Zellsuspension in ein auf Eis gelegtes Mikrozentrifugenröhrchen überführt, gefolgt von konstantem Rühren für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Zentrifugieren der Zelllysate in einer kalten Zentrifuge auf Eis legen. Sammeln Sie den Überstand in ein vorgekühltes frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Protein G Sepharose in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Dann zentrifugieren Sie die Lösung bei 500 G für zwei Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu und wirbeln Sie gut. Verwerfen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und wiederholen Sie den Schritt.Als nächstes mischen Sie ein Milligramm Anti-KCC2-Threonin-906- und Anti-KCC2-Threonin-1007-Antikörper mit 200 Mikrolitern Protein G Sepharose-Perlen, bevor Sie das Volumen mit PBS auf 500 Mikroliter auffüllen. Nachdem Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einer vibrierenden Plattform oder einem rotierenden Rad geschüttelt haben, wiederholen Sie zwei Wäschen mit PBS. Führen Sie eine Proteinquantifizierung an den Zelllysaten durch und fügen Sie ein Milligramm des Zelllysats zu den gewaschenen Beads hinzu und inkubieren Sie in einem End-to-End-Rotator, bevor Sie sich abdrehen.Geben Sie drei Wäschen mit PBS, das 150 Millimolar Natriumchlorid enthält, gefolgt von drei Wäschen mit 200 Mikrolitern PBS, bevor Sie das endgültige Pellet in 100 Mikroliter LDS-Probenpuffer resuspendieren. Schütteln Sie die Röhrchen in einem Rotorschüttler fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie sie in einem Heizblock und zentrifugieren Sie sie, bevor Sie den Überstand zum Beladen des Gels verwenden.Montieren Sie den Western Blot-Gießapparat und gießen Sie frisch zubereitetes 8% Trenngel, um das Gel zu gießen, so dass etwa zwei Zentimeter Platz von der Oberseite des Gießglases bleiben. Fügen Sie dem Aufbau 200 Mikroliter absolutes Isopropanol hinzu und lassen Sie es 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie das Isopropanol mit einer Pipette und spülen Sie das Gel vorsichtig mit etwa 200 Mikrolitern destilliertem Wasser ab.Nach Zugabe von frisch zubereitetem 6%-Stapelgel in den Gießaufbau vorsichtig in den Brunnenkamm passen und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Dann fixieren Sie das gegossene Gel in den Elektrophoresetank. Nachdem Sie den laufenden Puffer in den Tank gegossen haben, laden Sie fünf Mikroliter Molekulargewichtsmarker in die erste Vertiefung und eine gleiche Menge Protein in jede Vertiefung des SDS-PAGE-Gels.Füllen Sie die leeren Vertiefungen mit LDS und lassen Sie das Gel etwa 90 bis 120 Minuten bei 120 Volt laufen. Rehydrieren Sie die Nitrocellulosemembran mit einem Transferpuffer, der 20% Methanol enthält. Spülen Sie das Gel und die Membran mit dem Transferpuffer ab und verteilen Sie sie vorsichtig auf dem Vorbereitungsstapel.Ordnen Sie das zu übertragende Sandwich in dieser Reihenfolge an:negative Elektrode, Sandwichschaum, Filterpapier gespültes SDS-PAGE Gel, gespülte Nitrozellulosemembran, Filterpapier, Sandwichschaum, positive Elektrode. Sobald Sie fertig sind, stapeln Sie das zusammengebaute Sandwich in den Transfertank und laufen Sie mit 90 Volt für 90 Minuten oder 30 Volt für 360 Minuten. Blockieren Sie die trockene Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Blockierpuffer.Inkubieren Sie die Membranen mit geeigneten Verdünnungen von primärem Antikörper und Beta-Aktin im Blockpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Dann geben Sie drei Wäschen TBST für jeweils fünf Minuten. Inkubieren Sie die gewaschene Membran mit einem sekundären Antikörper, der in einem blockierenden Puffer für 60 Minuten verdünnt ist, und wiederholen Sie drei TBST-Wäschen.Wenn Sie fertig sind, legen Sie die gewaschene Membran auf die Bildtafel. Um die Signale zu entwickeln, verteilen Sie die vorbereitete Lösung, indem Sie gleiche Volumina jedes verbesserten Chemilumineszenzreagenz auf der Membran mischen, bevor Sie die Bildgebungskarte zur Bildgebung an das Bildgebungssystem übertragen. Die Behandlung von HEK293-Zellen mit Staurosporin und N-Ethylmaleimid oder NEM verursachte eine verminderte Phosphorylierung an SPAK-Zielstellen, Threonin 233 in der T-Loop-Kinase-Domäne und der S-Loop-Phosphorylierungsstelle Serin 373 von endogen exprimiertem SPAK.Staurosporin reduzierte die Phosphorylierung von Serin 940 in HEK294-Zellen, die KCC2b stabil exprimierten, aber NEM erhöhte signifikant seine Phosphorylierung. Darüber hinaus verringert Staurosporin die Phosphorylierung an der Threonin-505-Stelle, während NEM einen leichten, aber unbedeutenden Anstieg der Phosphorylierung an derselben Stelle verursacht. Die unterschiedlichen Wirkungen beider Verbindungen auf die Phosphorylierung der Proteinkinase C an der Threonin-505-Stelle und KCC2b an der Serin-940-Stelle korrelieren gut.Das repräsentative Ergebnis zeigte auch, dass NEM einen signifikanten Anstieg der Expression der Gesamtmenge KCC2 verursachte, während die Expression von Gesamt-NKCC1 und SPAK nicht signifikant verändert wurden, wenn sie mit beiden Verbindungen behandelt wurden. Darüber hinaus verursachten die beiden Verbindungen eine verminderte Phosphorylierung von SPAK an Threonin 233- und Serin-373-Stellen, und dies korrelierte mit der verkürzten Phosphorylierung von Threonin 906/1007 und Threonin 203/207/212 bzw. endogen exprimiertem NKCC1. Darüber hinaus reduzierten und erhöhten Staurosporin und NEM die Phosphorylierung der Proteinkinase C an der Serin-940-Stelle bzw. stabil exprimierten KCC2b, was mit der Reduktion und Erhöhung der Phosphorylierung der Proteinkinase C-Delta an der Threonin-505-Stelle nach Staurosporin bzw. NEM-Behandlung korrelierte.Wenn ein falscher primärer oder sekundärer Antikörper verwendet wird, wird die Bande während der Bildgebung nicht gesehen. Außerdem ist das Signal möglicherweise nicht sichtbar, wenn eine zu niedrige Antikörperkonzentration verwendet wird. Die Technik ist ein relevantes Werkzeug in der quantitativen Analyse von Proteinen und hat ihre Verwendung für viele wissenschaftliche und Ressourcenzwecke ermöglicht, einschließlich als effektives Frühdiagnoseinstrument.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA und CLC: CLF-1-abhängige Herunterregulieren von CNTFR &amp; agr; als Demonstriert durch Western Blotting, Hemmung der lysosomale Enzyme und Immunzytochemie

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...