Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094), og et Commonwealth Ph.D. Scholarship.

MERK: Protokollen beskriver den vestlige blottingmetoden for å oppdage spesifikke proteiner av interesse.
1. Cellekultur og transfeksjon
<ol><li>Varm alle reagensene i perlebadet (37 °C) før cellekulturprosedyren. Forbered kulturmedium, Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% hver av 2mM L-glutamin, 100x ikke-essensiell aminosyre, 100 mM natriumpyruvat og 100 enheter / ml penicillin-streptomycin.</li>
	<li>Tin stabilt transfisert ...

Mange metoder har blitt brukt til å måle aktivitetene til SLC12 av CCC som uttrykkes i nevronene, inkludert KCC2. Mange av disse teknikkene har vist seg å øke vitenskapelig kunnskap om analysen av den funksjonelle relevansen til disse transportørene og deres strukturfunksjonsmønstre i forskjellige sykdomsrelaterte mutasjoner. Kritisk er det fordeler og forbehold ved de ulike metodene21. Protokollen forklart ovenfor skisserte imidlertid hvordan man vurderer KCC2-fosforylering på kinaseregule...

Kaliumklorid-kotransportører 2 (KCC2) er medlem av løsemiddelbærerfamilien 12 (SLC12) av kationklorid-kotransportører (CCC), som utelukkende finnes i nevronet og er avgjørende for riktig funksjon av Cl-homeostase og følgelig funksjonell GABAergisk inhibering 1,2,3,4. Opprettholdelsen av lav intranevronal Cl-konsentrasjon ([Cl-]i) ved 4-6 mM av KCC2 muliggjør γ-aminosmørsyre (GABA)/glycin hyperpolarisering og synaptisk hemming i hjernen og ryggmargen5. Svikt i riktig regulering av KCC2 har vært assosiert med forekomsten av flere nevrologiske sykdommer, inkludert epilepsi4. Videre har redusert KCC2-mediert Cl-ekstrudering og nedsatt hyperpolariserende GABAA og / eller glycinreseptormediert strøm vært involvert i epilepsi, nevropatisk smerte og spastisitet 6,7. Neuronal KCC2 er negativt modulert via fosforylering av viktige regulatoriske rester innenfor sitt C-terminale intracellulære domene av med-no-lysin (WNK)-STE20/SPS1-relatert prolin/alaninrikt (SPAK)/Oksidativt stressresponsivt (OSR) kinasesignalkompleks1, som letter opprettholdelsen av depolarisert GABA-aktivitet i umodne nevroner 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1 fosforylerer treoninrester 906 og 1007 (Thr906/Thr1007) og nedregulerer deretter mRNA-genuttrykket til KCC2, noe som fører til en påfølgende forverring av dens fysiologiske funksjon 8,10. Enda viktigere er det imidlertid allerede et faktum at WNK-SPAK/OSR1-kinasekomplekset er kjent for å fosforylere og hemme KCC2-uttrykk 1,2,4,11,12, og at inhiberingen av kinasekompleksets signalveier til fosforylat Thr906/Thr1007 har vært knyttet til det økte uttrykket av KCC2 mRNA-genet13,14,15 . Det er viktig å merke seg at reguleringen av nevronal KCC2 og Na+-K+-2Cl- kotransportører 1 (NKCC1) ekspresjon via proteinfosforylering virker samtidig og i omvendte mønstre 1,4,16.
Det har vært konsekvent og betydelig fremgang med hensyn til forståelsen av mekanismer involvert i reguleringen av KCC2, akkreditert til utvikling av teknikker som gjør det mulig for forskere å studere sine funksjoner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering av kinasereguleringssteder fosforylering) eller indirekte (observasjon og overvåking av GABA-aktivitet) undersøkelser. Protokollen som presenteres her fremhever anvendelsen av vestlige blottingteknikker for å studere funksjonene og aktivitetene til neuronal K + -Cl- co-transporter KCC2 ved å undersøke fosforyleringen av kotransportøren på kinasereguleringssteder Thr906/1007.
Western blot er en metode som brukes til å oppdage spesifikke proteiner av interesse fra en prøve av vev eller celle. Denne metoden separerer først proteinene etter størrelse gjennom elektroforese. Proteinene overføres deretter elektroforetisk til en solid støtte (vanligvis en membran) før målproteinet merkes ved hjelp av et spesifikt antistoff. Antistoffene er konjugert til forskjellige koder eller fluoroforkonjugerte antistoffer som oppdages ved hjelp av enten kolorimetriske, kjemiluminescens- eller fluorescensmetoder. Dette gjør det mulig å oppdage et bestemt målprotein fra en blanding av proteiner. Denne teknikken har blitt brukt til å karakterisere fosfospesifikke steder av KCC1 og har blitt brukt til å identifisere kinasehemmere som hemmer KCC3 Thr991 / Thr1048 fosforylering17. Ved å følge denne protokollen kan man spesifikt oppdage total og fosforylert KCC2 fra celle/vevslysater. I prinsippet er påvisning av proteinkonjugerte antistoffer ved hjelp av denne teknikken svært instrumentell, da det bidrar til å forbedre forståelsen av samarbeidsaktiviteter på fosfo-stedene til KCC2, som kaster lys over de molekylære mekanismene som er involvert i deres fysiologiske forskrifter. Den kvantitative analysen av det totale proteinuttrykket er representativt for funksjonen og aktiviteten til KCC2. Det finnes andre klassiske metoder som brukes til å måle KCC2-aktivitet direkte, for eksempel rubidiumion og thalliumionopptaksanalyse. Ytterligere teknikker som patch-klemme-elektrofysiologi brukes til å måle GABA-aktivitet; derfor indirekte reflekterer aktivert og/eller inaktivert KCC2 som informert av vurderingen av intracellulær kloridionhomeostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Kaliumklorid-kotransportører 2 (KCC2) er medlem av løsemiddelbærerfamilien 12 (SLC12) av kationklorid-kotransportører (CCC), som utelukkende finnes i nevronet og er avgjørende for riktig funksjon av Cl-homeostase og følgelig funksjonell GABAergisk inhibering. Svikt i riktig regulering av KCC2 er skadelig og har vært assosiert med forekomsten av flere nevrologiske sykdommer, inkludert epilepsi. Det har vært betydelig fremgang med hensyn til å forstå mekanismene som er involvert i reguleringen av KCC2, akkreditert til utvikling av teknikker som gjør det mulig for forskere å studere dets funksjoner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering av kinasereguleringssteder fosforylering) eller indirekte (observasjon og overvåking av GABA-aktivitet) undersøkelser. Her fremhever protokollen hvordan man undersøker KCC2-fosforylering på kinasereguleringssteder - Thr906 og Thr1007 - ved hjelp av vestlig blottingteknikk. Det finnes andre klassiske metoder som brukes til å måle KCC2-aktivitet direkte, for eksempel rubidiumion og thalliumionopptaksanalyse. Ytterligere teknikker som patch-klemme-elektrofysiologi brukes til å måle GABA-aktivitet; derfor indirekte reflekterer aktivert og/eller inaktivert KCC2 som informert av vurderingen av intracellulær kloridionhomeostase. Noen av disse tilleggsteknikkene vil bli kort omtalt i dette manuskriptet.

Her undersøkte det representative resultatet presentert i figur 1 virkningen av staurosporin og NEM på WNK-SPAK/OSR1-mediert fosforylering av KCC2 og NKCC1 i HEK293-cellelinjer som stabilt uttrykker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 ved hjelp av western blotting-teknikken. Omfattende detaljer om de representative resultatene er omtalt i Zhang et al.15. I likhet med NEM er staurosporin en bred kinasehemmer som kan øke KCC2-transportakt...

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Denne protokollen fremhever anvendelsen av vestlig blottingteknikk for å studere funksjonene og aktivitetene til neuronal K-Cl co-transporter KCC2. Protokollen beskriver undersøkelsen av KCC2 fosforylering på kinase reguleringssteder Thr906/1007 via western blotting. Også flere metoder for å bekrefte KCC2-aktivitet er kort fremhevet i denne teksten.

Studie av funksjonene og aktivitetene til Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 ved bruk av Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Denne protokollen kan bidra til å forstå mekanismene som er involvert i KCC2-regulering ved direkte å vurdere fosforylering av kinasemolekylstørrelse, og dermed kaste lys over dens fysiologiske funksjoner og aktiviteter. Det kan brukes til å identifisere og karakterisere molekyler som proteiner av interesse fra komplekse blandinger av relaterte molekyler, selv når et proteinuttrykk er svært lite. Teknikken er et viktig verktøy for proteinanalyse av komplekse systemer og identifisering av potensielle mekanismer som ligger til grunn for avvikende vevsfunksjon eller sykdom.Demonstrere prosedyrene vil være søndag Solomon Josiah, en doktorgradsstudent fra laboratoriet mitt. Begynn med å forhåndsarme alle reagensene i 37 grader Celsius perlebad og tine den stabilt transekterte rotten KCC2b menneskelige embryonale nyre 293-celler helt i perlebadet. Overfør deretter cellene fra kryohetteglassrøret til et sentrifugerør som inneholder fem milliliter ferske medier og sentrifuger cellene ved 1.200 G i tre til fem minutter.Etter å ha aspirert supernatanten ved hjelp av en aspiratorpipette festet til en vakuumpumpe, resuspenderer cellene i 10 milliliter ferske medier. Overfør suspensjonen til en 10 centimeter tallerken og la den vokse i 48 timer i en inkubator med 37 grader Celsius temperatur og 5% karbondioksid. Når cellene oppnår 90% sammenløp, splitt dem ved å aspirere det gamle mediet og skylle dem med to milliliter PBS.Tilsett to milliliter trypsin og inkuber dem i omtrent ett til to minutter ved romtemperatur. Vask de trypsiniserte cellene ved hjelp av to milliliter av hele mediet. Tilsett ni milliliter friske medier til de nye rettene.Tilsett deretter en milliliter løsning fra den gamle parabolen til den nye parabolen. Overfør splitcelle retter til inkubatoren i 48 timer for å oppnå mer enn 90% sammenheng. Behandle cellene med enten dimetylsulfoksid, åtte mikromolar staurosporin eller 0,5 millimolar N-etylmaleimid i 15 minutter før høsting i lysisbuffer.Aspirer media fra den transekterte kulturskålen, legg kulturskålene på is og vask cellene med iskald PBS. Aspirer PBS og tilsett 1,0 milliliter iskald lysisbuffer til parabolen. Etter å ha skrapt cellene fra bunnen av fatet ved hjelp av en kald plastcelleskraper, overfør cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør plassert på is, etterfulgt av konstant omrøring i 30 minutter ved fire grader Celsius.Etter sentrifugering lyserer cellen i en kald sentrifuge, legg den på is. Samle supernatanten i et forkjølt ferskt rør, og kast pelleten. Pipette 300 mikroliter protein G Sepharose inn i et mikrosentrifugerør.Sentrifuger deretter løsningen ved 500 G i to minutter. Etter å ha kastet supernatanten, tilsett 500 mikroliter PBS og virvelbrønn. Kast supernatanten etter sentrifugering og gjenta trinnet.Bland deretter en milligram anti-KCC2 threonine 906 og anti-KCC2 threonine 1007 antistoffer med 200 mikroliter Protein G Sepharose perler før du utgjør volumet til 500 mikroliter med PBS. Etter å ha ristet på en vibrerende plattform eller roterende hjul i to timer ved fire grader Celsius, gjenta to vasker med PBS. Utfør proteinkvantifisering på cellelysatene og tilsett en milligram av cellelysatet til de vaskede perlene og inkuber i en ende-til-ende-rotator før du spinner ned.Gi tre vasker med PBS som inneholder 150 millimolært natriumklorid, etterfulgt av tre vasker med 200 mikroliter PBS før du resuspenderer den endelige pelleten i 100 mikroliter LDS prøvebuffer. Rist rørene i en rotor shaker ved romtemperatur i fem minutter. Inkuber dem i en varmeblokk og sentrifuger dem før du bruker supernatanten til gelbelastning.Monter Western Blot-støpeapparatet og hell nytilberedt 8% separerende gel for å støpe gelen, slik at omtrent to centimeter plass fra toppen av støpeglasset. Tilsett 200 mikroliter absolutt isopropanol til oppsettet og la det stå ved romtemperatur i 60 minutter. Fjern isopropanol ved hjelp av en pipette og skyll gelen forsiktig med ca. 200 mikroliter destillert vann.Etter å ha tilsatt nytilberedt 6% stablegel til støpeoppsettet, pass forsiktig i brønnkammen og la den stå ved romtemperatur i 30 minutter. Fest deretter den støpte gelen i elektroforesetanken. Etter å ha hellet løpebufferen i tanken, legg fem mikroliter molekylvektmarkør inn i den første brønnen og like mye protein i hver brønn i SDS-PAGE-gelen.Fyll opp de tomme brønnene med LDS og kjør gelen i ca 90 til 120 minutter ved 120 volt. Rehydrer nitrocellulosemembranen med overføringsbuffer som inneholder 20% metanol. Skyll gelen og membranen med overføringsbufferen og spred dem forsiktig ut på forberedelsesbunken.Ordne smørbrødet som skal overføres i denne rekkefølgen: negativ elektrode, sandwichskum, filterpapir skyllet SDS-PAGE gel, skyllet nitrocellulosemembran, filterpapir, sandwichskum, positiv elektrode. Når du er ferdig, stable den monterte sandwichen i overføringstanken og kjør på 90 volt i 90 minutter eller 30 volt i 360 minutter. Blokker tørrmembranen i en time ved romtemperatur ved hjelp av en blokkeringsbuffer.Inkuber membranene med passende fortynninger av primært antistoff og beta-aktin i blokkerende buffer i en time ved romtemperatur eller over natten ved fire grader Celsius. Gi deretter tre vasker TBST i fem minutter hver. Inkuber den vaskede membranen med et sekundært antistoff fortynnet i en blokkerende buffer i 60 minutter og gjenta tre vasker TBST.Når du er ferdig, plasser den vasket membranen på bildekortet. For å utvikle signalene, spre løsningen fremstilt ved å blande like store mengder av hvert forbedret kjemiluminescensreagens på membranen før du overfører bildekortet til bildebehandlingssystemet for avbildning. Behandlingen av HEK293-celler med staurosporin og N-etylmaleimid eller NEM forårsaket redusert fosforylering på SPAK-målsteder, treonin 233 lokalisert i T-loop-kinasedomenet, og S-loop-fosforyleringsstedet serin 373 av endogent uttrykt SPAK.Staurosporin reduserte fosforyleringen av serin 940 i HEK294-celler som stabilt uttrykker KCC2b, men NEM økte fosforyleringen betydelig. Videre reduserer staurosporin fosforylering på treonin 505-stedet, mens NEM forårsaket en liten, men ubetydelig økning i fosforylering på samme sted. De differensielle effektene av begge forbindelsene på fosforylering av proteinkinase C på threonine 505-stedet og KCC2b på serine 940-stedet korrelerer godt.Det representative resultatet viste også at NEM forårsaket en signifikant økning i uttrykket av den totale KCC2-mengden, mens uttrykket av total NKCC1 og SPAK ikke ble signifikant endret ved behandling med begge forbindelser. Videre forårsaket de to forbindelsene en redusert fosforylering av SPAK på threonine 233 og serin 373 steder, og dette korrelerte med forkortet fosforylering av treonin 906/1007 og treonin 203/207/212 og endogent uttrykt NKCC1 henholdsvis. I tillegg reduserte og økte staurosporin og NEM fosforyleringen av proteinkinase C på henholdsvis serin 940-stedet og stabilt uttrykt KCC2b, som korrelerte med reduksjonen og økningen i fosforyleringen av proteinkinase C-deltaet på henholdsvis treonin 505-stedet ved staurosporin- og NEM-behandling.Hvis et feil primært eller sekundært antistoff brukes, vil båndet ikke bli sett under avbildningen. Signalet kan heller ikke være synlig hvis en for lav konsentrasjon av antistoff brukes. Teknikken er et relevant verktøy i kvantitativ analyse av protein og har tillatt bruk for mange vitenskapelige og ressursformål, blant annet som et effektivt tidlig diagnostisk verktøy.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA og CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av CNTFRα som demonstrert ved Western Blotting, Hemming av lysosomale enzymer, og Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En vestlig Blotting protokollen for lite antall blodkreft stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive β-amyloid Oligomer forberedelse og vurdering ved hjelp av Dot Blotting analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjelp av immunoreaction styrke teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Rensing av endogene Drosophila transiente reseptorpotensialkanaler

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...