Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
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Este trabalho foi apoiado pela Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094), e uma Commonwealth Ph.D. Scholarship.

NOTA: O protocolo descreve o método de western blotting para detectar proteínas específicas de interesse.
1. Cultura celular e transfecção
<ol><li>Aquecer todos os reagentes no banho de grânulos (37 °C) antes do procedimento de cultura celular. Preparar o meio de cultura, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% cada de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido não essencial, piruvato de sódio 100 mM e 100 unidades/mL de peni...

Muitos métodos têm sido utilizados para medir as atividades do SLC12 de CCCs que são expressos nos neurônios, incluindo o KCC2. Muitas dessas técnicas provaram aprimorar o conhecimento científico sobre a análise da relevância funcional desses transportadores e seus padrões de estrutura-função em diferentes mutações relacionadas à doença. Criticamente, há vantagens e ressalvas para os vários métodos21. No entanto, o protocolo explicado acima, delineou como avaliar a fosforilação...

Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são membros da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de cátions (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da Cl-homeostase e, consequentemente, para a inibição funcional do GABAérgico 1,2,3,4. A manutenção da baixa concentração intraneuronal de Cl- ([Cl-]i) a 4-6 mM pelo KCC2 facilita a hiperpolarização do ácido γ-aminobutírico (GABA)/glicina e a inibição sináptica no cérebro e na medula espinhal5. A falha na regulação adequada da KCC2 tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo a epilepsia4. Além disso, a diminuição da extrusão de Cl− mediada por KCC2 e as correntes hiperpolarizantes hiperpolarizantes GABAA e/ou mediadas pelo receptor de glicina têm sido implicadas na epilepsia, dor neuropática e espasticidade 6,7. O KCC2 neuronal é modulado negativamente via fosforilação de resíduos reguladores chave dentro de seu domínio intracelular C-terminal pelo complexode sinalização 1 da quinase com não-lisina (WNK)-STE20/SPS1-related proline/alanine-rich (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), o que facilita a manutenção da atividade despolarizada do GABA em neurônios imaturos 2,8,9 . O WNK-SPAK/OSR1 fosforila os resíduos de treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e, posteriormente, regula negativamente a expressão gênica de RNAm do KCC2, levando a uma consequente deterioração de sua função fisiológica 8,10. Mais importante, no entanto, já é um fato que o complexo quinase WNK-SPAK/OSR1 é conhecido por fosforilar e inibir a expressão de KCC2 1,2,4,11,12, e que a inibição das vias de sinalização do complexo quinase para o fosforilato Thr906/Thr1007 tem sido associada ao aumento da expressão do gene mRNA KCC2 13,14,15 . É importante ressaltar que a regulação da expressão neuronal de KCC2 e Na+-K+-2Cl-cotransportadores 1 (NKCC1) via fosforilação proteica funciona concomitantemente e em padrões inversos 1,4,16.
Houve avanços consistentes e consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). O protocolo aqui apresentado destaca a aplicação de técnicas de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K+-Cl- KCC2, investigando a fosforilação do cotransportador em sítios reguladores de quinase Thr906/1007.
Western blot é um método usado para detectar proteínas específicas de interesse de uma amostra de tecido ou célula. Este método primeiro separa as proteínas por tamanho através de eletroforese. As proteínas são então transferidas eletroforeticamente para um suporte sólido (geralmente uma membrana) antes que a proteína-alvo seja marcada usando um anticorpo específico. Os anticorpos são conjugados a diferentes tags ou anticorpos conjugados com fluoróforos que são detectados usando métodos colorimétricos, quimioluminescência ou fluorescência. Isso permite que uma proteína-alvo específica seja detectada a partir de uma mistura de proteínas. Essa técnica tem sido utilizada para caracterizar sítios fosfoespecíficos de KCCs1 e tem sido utilizada para identificar inibidores de quinase que inibem a fosforilação de KCC3 Thr991/Thr104817. Seguindo este protocolo, pode-se detectar especificamente KCC2 total e fosforilado a partir de lisatos celulares / teciduais. Em princípio, a detecção de anticorpos conjugados com proteínas por esta técnica é altamente instrumental, pois ajuda a melhorar a compreensão das atividades cooperativas nos fosfo-locais do KCC2, o que lança luz sobre os mecanismos moleculares envolvidos em suas regulações fisiológicas. A análise quantitativa da expressão proteica total é representativa da função e atividade do KCC2. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são um membro da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de catião (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da Cl-homeostase e, consequentemente, da inibição funcional do GABAérgico. A falha na regulação adequada da KCC2 é deletéria e tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo epilepsia. Houve avanços consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). Aqui, o protocolo destaca como investigar a fosforilação de KCC2 em locais reguladores de quinase - Thr906 e Thr1007 - usando a técnica de western blotting. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto. Algumas dessas técnicas adicionais serão brevemente discutidas neste manuscrito.

Aqui, o resultado representativo apresentado na Figura 1 investigou o impacto da estaurosporina e do NEM na fosforilação mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 e NKCC1 em linhagens celulares de HEK293 expressando de forma estável KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizando a técnica de western blotting. Detalhes abrangentes sobre os resultados representativos são discutidos em Zhang et al.15. Semelhante ao NEM, a estaurosporina é um in...

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Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

O presente protocolo destaca a aplicação da técnica de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2. O protocolo descreve a investigação da fosforilação de KCC2 em sítios reguladores de quinase Thr906/1007 via western blotting. Além disso, métodos adicionais para confirmar a atividade do KCC2 são brevemente destacados neste texto.

Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Este protocolo pode ajudar a compreender os mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, avaliando diretamente a sua fosforilação do tamanho molecular da quinase, lançando assim luz sobre as suas funções e atividades fisiológicas. Pode ser usado para identificar e caracterizar moléculas como proteínas de interesse a partir de misturas complexas de moléculas relacionadas, mesmo quando uma expressão de proteína é muito pequena. A técnica é uma ferramenta essencial para a análise de proteínas de sistemas complexos e a identificação de potenciais mecanismos subjacentes à função ou doença aberrante do tecido.Demonstrando os procedimentos será domingo Salomão Josias, um estudante de doutorado do meu laboratório. Comece por pré-armar todos os reagentes no banho de contas de 37 graus Celsius e descongelar as células do rim embrionário humano KCC2b de rato KCC2b de forma estável completamente no banho de contas. Em seguida, transfira as células do tubo do frasco para injetáveis criogênico para um tubo de centrífuga contendo cinco mililitros de meio fresco e centrifugar as células a 1.200 G por três a cinco minutos.Depois de aspirar o sobrenadante usando uma pipeta aspiradora fixada a uma bomba de vácuo, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio fresco. Transfira a suspensão para uma placa de prato de 10 centímetros e deixe-a crescer por 48 horas em uma incubadora com temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Uma vez que as células atinjam 90% de confluência, divida-as aspirando o meio antigo e enxaguando-as com dois mililitros de PBS.Adicione dois mililitros de tripsina e incube-os por cerca de um a dois minutos à temperatura ambiente. Lave as células tripsinizadas usando dois mililitros do meio completo. Adicione nove mililitros de mídia fresca aos novos pratos.Em seguida, adicione um mililitro de solução do prato velho ao prato novo. Transfira os pratos de células divididas para a incubadora por 48 horas para atingir mais de 90% de confluência. Trate as células com sulfóxido de dimetilo, oito estaurosporinas micromolares ou N-etilmaleimida 0,5 milimolar por 15 minutos antes de colher em tampão de lise.Aspirar o meio do prato de cultura transectado, colocar os pratos de cultura no gelo e lavar as células com PBS gelado. Aspirar o PBS e adicionar 1,0 mililitros de tampão de lise gelada ao prato. Depois de raspar as células do fundo do prato usando um raspador de células de plástico frio, transfira a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga colocado no gelo, seguido de agitação constante por 30 minutos a quatro graus Celsius.Depois de centrifugar os lisados celulares em uma centrífuga fria, coloque-a no gelo. Colete o sobrenadante em um tubo fresco pré-resfriado e descarte o pellet. Pipeta 300 microlitros de Proteína G Sefarose em um tubo de microcentrífuga.Em seguida, centrifugar a solução a 500 G durante dois minutos. Depois de descartar o sobrenadante, adicione 500 microlitros de PBS e o vórtice bem. Descarte o sobrenadante após centrifugação e repita a etapa.Em seguida, misture um miligrama de anticorpos anti-KCC2 treonina 906 e anti-KCC2 treonina 1007 com 200 microlitros de contas de proteína G Sepharose antes de completar o volume para 500 microlitros com PBS. Depois de agitar em uma plataforma vibratória ou roda giratória por duas horas a quatro graus Celsius, repita duas lavagens com PBS. Realizar a quantificação de proteínas nos lisados celulares e adicionar um miligrama do lisado celular às contas lavadas e incubar em um rotador de ponta a ponta antes de girar.Dê três lavagens com PBS contendo 150 milimolares de cloreto de sódio, seguidas de três lavagens com 200 microlitros de PBS antes de ressuspender o pellet final em 100 microlitros de tampão de amostra SUD. Agite os tubos num agitador de rotor à temperatura ambiente durante cinco minutos. Incube-os em um bloco de aquecimento e centrifuga-os antes de usar o sobrenadante para o carregamento do gel.Monte o aparelho de fundição Western Blot e despeje o gel de separação a 8% recém-preparado para moldar o gel, permitindo cerca de dois centímetros de espaço a partir do topo do vidro de fundição. Adicione 200 microlitros de isopropanol absoluto à configuração e deixe-o repousar à temperatura ambiente durante 60 minutos. Retire o isopropanol usando uma pipeta e lave cuidadosamente o gel com cerca de 200 microlitros de água destilada.Depois de adicionar o gel de empilhamento a 6% recém-preparado à configuração de fundição, encaixe suavemente no pente do poço e deixe repousar à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, fixe o gel fundido no tanque de eletroforese. Depois de despejar o tampão de corrida no tanque, carregue cinco microlitros de marcador de peso molecular no primeiro poço e uma quantidade igual de proteína em cada poço do gel SDS-PAGE.Encha os poços vazios com LDS e passe o gel por cerca de 90 a 120 minutos a 120 volts. Reidratar a membrana de nitrocelulose com tampão de transferência contendo 20% de metanol. Lave o gel e a membrana com o tampão de transferência e espalhe-os suavemente na pilha de preparação.Organize o sanduíche a ser transferido nesta ordem: eletrodo negativo, espuma de sanduíche, papel de filtro enxaguado gel SDS-PAGE, membrana de nitrocelulose enxaguada, papel de filtro, espuma de sanduíche, eletrodo positivo. Uma vez feito, empilhe o sanduíche montado no tanque de transferência e corra a 90 volts por 90 minutos ou 30 volts por 360 minutos. Bloqueie a membrana seca por uma hora à temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio.Incubar as membranas com diluições apropriadas de anticorpo primário e beta-actina em tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, dê três lavagens de TBST por cinco minutos cada. Incubar a membrana lavada com um anticorpo secundário diluído em um tampão de bloqueio por 60 minutos e repetir três lavagens de TBST.Uma vez feito, coloque a membrana lavada na placa de imagem. Para desenvolver os sinais, espalhe a solução preparada misturando volumes iguais de cada reagente de quimioluminescência aprimorado na membrana antes de transferir a placa de imagem para o sistema de imagem para geração de imagens. O tratamento de células HEK293 com estaurosporina e N-etilmaleimida ou NEM causou diminuição da fosforilação nos locais-alvo do SPAK, treonina 233 situada no domínio da quinase T-loop e no sítio de fosforilação S-loop serina 373 do SPAK endogenamente expresso.A estaurosporina reduziu a fosforilação da serina 940 em células HEK294 expressando KCC2b de forma estável, mas o NEM aumentou significativamente sua fosforilação. Além disso, a estaurosporina diminui a fosforilação no sítio da treonina 505, enquanto o NEM causou um ligeiro, mas insignificante, aumento da fosforilação no mesmo local. Os efeitos diferenciais de ambos os compostos na fosforilação da proteína quinase C no sítio da treonina 505 e do KCC2b no sítio da serina 940 correlacionam-se bem.O resultado representativo também mostrou que o NEM causou um aumento significativo na expressão da quantidade total de KCC2, enquanto a expressão do NKCC1 total e do SPAK não foram significativamente alterados quando tratados com ambos os compostos. Além disso, os dois compostos causaram uma diminuição da fosforilação do SPAK nos sítios treonina 233 e serina 373, e isso se correlacionou com a fosforilação abreviada de treonina 906/1007 e treonina 203/207/212 e NKCC1 expressa endogenamente, respectivamente. Além disso, a estaurosporina e o NEM reduziram e aumentaram a fosforilação da proteína quinase C no sítio da serina 940 e KCC2b expressos de forma estável, respectivamente, o que se correlacionou com a redução e o incremento na fosforilação da proteína quinase C delta no local da treonina 505 após o tratamento com estaurosporina e NEM, respectivamente.Se um anticorpo primário ou secundário inadequado for usado, a banda não será vista durante a imagem. Além disso, o sinal pode não ser visível se uma concentração muito baixa de anticorpos for usada. A técnica é uma ferramenta relevante na análise quantitativa de proteínas e tem permitido seu uso para diversos fins científicos e de recursos, inclusive como uma ferramenta eficaz de diagnóstico precoce.

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SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA e CLC: Downregulation CLF-1 dependente de CNTFRa como demonstrado por Western Blotting, inibição da Lisossomal Enzimas e Imunocitoquï¿½ica

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...