Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Эта работа была поддержана Королевским обществом Великобритании (грант No IEC\NSFC\201094) и стипендией Содружества Ph.D. Scholarship.

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описывает метод вестерн-блоттинга для обнаружения специфических белков, представляющих интерес.
1. Клеточная культура и трансфекция
<ol><li>Разогрейте все реагенты в бисерной ванне (37 °C) перед процедурой культивирования клеток. Приготовьте к...

Многие методы были использованы для измерения активности SLC12 CCC, которые экспрессируются в нейронах, включая KCC2. Многие из этих методов доказали, что расширяют научные знания по анализу функциональной значимости этих транспортеров и их структурно-функциональных паттернов в различных ?...

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования 1,2,3,4. Поддержание низкой внутринейрональной концентрации Cl- ([Cl-]i) при 4-6 мМ KCC2 способствует гиперполяризации γ-аминомасляной кислоты (ГАМК)/глицина и синаптическому ингибированию в головном и спинном мозге5. Сбой в правильной регуляции KCC2 был связан с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию4. Кроме того, снижение KCC2-опосредованной Cl−экструзии и нарушение гиперполяризующих токов ГАМКА и/или глициновых рецепторов были вовлечены в эпилепсию, невропатическую боль и спастичность 6,7. Нейрональный KCC2 отрицательно модулируется путем фосфорилирования ключевых регуляторных остатков в его С-концевом внутриклеточном домене с помощью сигнального комплекса1, связанного с пролином/богатым аланином (SPAK)/окислительным стрессом (OSR), который облегчает поддержание деполяризованной активности ГАМК в незрелых нейронах 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирует остатки треонина 906 и 1007 (Thr906/Thr1007) и впоследствии понижает экспрессию гена мРНК KCC2, что приводит к последующему ухудшению его физиологической функции 8,10. Что еще более важно, однако, уже фактом является то, что киназный комплекс WNK-SPAK/OSR1, как известно, фосфорилирует и ингибирует экспрессию KCC2 1,2,4,11,12, и что ингибирование сигнальных путей комплекса киназы к фосфорилату Thr906/Thr1007 было связано с повышенной экспрессией гена мРНК KCC2 13,14,15 . Важно отметить, что регуляция экспрессии нейронных KCC2 и Na+-K+-2Cl-котранспортеров 1 (NKCC1) посредством фосфорилирования белка работает одновременно и в обратных паттернах 1,4,16.
Был достигнут последовательный и значительный прогресс в отношении понимания механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Протокол, представленный здесь, подчеркивает применение методов западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K+-Cl-ко-транспортера KCC2 путем исследования фосфорилирования котранспортера в регуляторных участках киназы Thr906/1007.
Вестерн-блот — это метод, используемый для обнаружения специфических белков, представляющих интерес, из образца ткани или клетки. Этот метод сначала разделяет белки по размеру с помощью электрофореза. Затем белки электрофоретически переносятся на твердую опору (обычно мембрану), прежде чем целевой белок будет помечен с использованием специфического антитела. Антитела конъюгируются с различными метками или флуорофорно-конъюгированными антителами, которые обнаруживаются с использованием колориметрического, хемилюминесцентного или флуоресцентного методов. Это позволяет обнаружить конкретный белок-мишень из смеси белков. Этот метод был использован для характеристики фосфосфоспецифических участков KCCs1 и был использован для идентификации ингибиторов киназы, которые ингибируют фосфорилирование KCC3 Thr991/Thr104817. Следуя этому протоколу, можно специфически обнаружить тотальный и фосфорилированный KCC2 из лизатов клеток / тканей. В принципе, обнаружение белково-конъюгированных антител с помощью этого метода является очень полезным, поскольку оно помогает улучшить понимание совместной деятельности на фосфо-сайтах KCC2, что проливает свет на молекулярные механизмы, участвующие в их физиологических нормах. Количественный анализ экспрессии общего белка репрезентативен для функции и активности KCC2. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования. Неспособность в надлежащей регуляции KCC2 вредна и связана с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию. Был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Здесь протокол подчеркивает, как исследовать фосфорилирование KCC2 в регуляторных участках киназы - Thr906 и Thr1007 - с использованием метода западного блоттинга. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза. Некоторые из этих дополнительных методов будут кратко рассмотрены в этой рукописи.

Здесь репрезентативный результат, представленный на рисунке 1, исследовал влияние ставроспорина и NEM на опосредованное WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирование KCC2 и NKCC1 в клеточных линиях HEK293, стабильно экспрессирующих KCC2b (HEKrnKCC2b)18 с использованием метода западн...

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

В настоящем протоколе подчеркивается применение метода западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K-Cl сотранспортера KCC2. Протокол описывает исследование фосфорилирования KCC2 на регуляторных участках киназы Thr906/1007 посредством западного блоттинга. Кроме того, в этом тексте кратко освещаются дополнительные методы подтверждения активности KCC2.

Исследование функций и активности нейронального K-Cl котранспортера KCC2 с использованием вестерн-блоттинга

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Этот протокол может помочь понять механизмы, участвующие в регуляции KCC2, путем непосредственной оценки фосфорилирования молекулярного размера киназы, тем самым проливая свет на его физиологические функции и активность. Он может быть использован для идентификации и характеристики молекул, таких как белки, представляющие интерес из сложных смесей родственных молекул, даже если экспрессия белка очень незначительна. Этот метод является важным инструментом для анализа белка сложных систем и выявления потенциальных механизмов, лежащих в основе аберрантной функции тканей или заболевания.Демонстрировать процедуры будет Сандей Соломон Джозайя, аспирант из моей лаборатории. Начните с предварительного вооружения всех реагентов в бисерной ванне 37 градусов по Цельсию и размораживания стабильно трансекированной крысы KCC2b эмбриональной почки человека 293 клетки полностью в бисерной ванне. Затем переместите клетки из криобазонной трубки в центрифужную трубку, содержащую пять миллилитров свежей среды, и центрифугируйте клетки при 1 200 г в течение трех-пяти минут.После аспирации супернатанта с помощью аспираторной пипетки, закрепленной на вакуумном насосе, повторно суспендируют ячейки в 10 миллилитрах свежей среды. Переложите суспензию на 10-сантиметровую тарелку и дайте ей расти в течение 48 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом. Как только клетки достигнут 90%-ной конфлюентности, разделите их, аспирируя старые носители и промывая их двумя миллилитрами PBS.Добавьте два миллилитра трипсина и высиживайте их около одной-двух минут при комнатной температуре. Промыть трипсинизированные клетки, используя два миллилитра полной среды. Добавьте девять миллилитров свежей среды в новые блюда.Затем добавьте один миллилитр раствора из старого блюда в новое блюдо. Переложите расщепленные ячейки чашки в инкубатор на 48 часов, чтобы достичь более 90% слияния. Обработайте клетки либо диметилсульфоксидом, либо восьмимиполярным ставроспорином, либо 0,5 миллимолярным N-этилмалеймидом в течение 15 минут перед сбором в буфере лизиса.Аспирируйте среду из трансективной чашки, поместите посуду культуры на лед и вымойте клетки ледяным PBS. Аспирируйте PBS и добавьте в блюдо 1,0 миллилитра ледяного буфера лизиса. После соскабливания ячеек со дна тарелки с помощью холодного пластикового скребка переложите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку, помещенную на лед, с последующим постоянным перемешиванием в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.После центрифугирования клетки лизаты в холодной центрифуге поместите ее на лед. Соберите супернатант в предварительно охлажденную свежую трубку и выбросьте гранулу. Пипетка 300 микролитров белка G Сефароза в микроцентрифужную трубку.Затем центрифугируют раствор при 500 Г в течение двух минут. После выброса супернатанта добавьте 500 микролитров PBS и хорошо вихрь. Выбросьте супернатант после центрифугирования и повторите шаг.Затем смешайте один миллиграмм анти-KCC2 треонина 906 и анти-KCC2 треонина 1007 антител с 200 микролитрами бусин белка G Sepharose, прежде чем восполнить объем до 500 микролитров с PBS. После встряхивания на вибрирующей платформе или вращающемся колесе в течение двух часов при четырех градусах Цельсия повторите две промывки с PBS. Проводят количественную оценку белка на клеточных лизатах и добавляют один миллиграмм клеточного лизата в промытые шарики и инкубируют в сквозном ротаторе перед вращением вниз.Дайте три промывки с PBS, содержащим 150 миллимоляров хлорида натрия, затем три промывки с 200 микролитрами PBS перед повторным использованием конечной гранулы в 100 микролитрах буфера образца LDS. Встряхните трубки в роторном шейкере при комнатной температуре в течение пяти минут. Инкубируйте их в нагревательном блоке и центрифугируйте их перед использованием супернатанта для загрузки геля.Соберите литейный аппарат Western Blot и залейте свежеприготовленный 8%-ный разделительный гель для отливки геля, оставляя около двух сантиметров пространства от верхней части литейного стекла. Добавьте в установку 200 микролитров абсолютного изопропанола и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 60 минут. Удалите изопропанол с помощью пипетки и тщательно промойте гель примерно 200 микролитрами дистиллированной воды.После добавления свежеприготовленного 6% укладочного геля в кастинг-установку аккуратно влейте в заготовку и дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем закрепите отлитый гель в резервуаре для электрофореза. После наливания бегущего буфера в резервуар загрузите пять микролитров маркера молекулярной массы в первую лунку и равное количество белка в каждую лунку геля SDS-PAGE.Заполните пустые колодцы СПД и запускайте гель в течение примерно 90-120 минут при 120 вольтах. Регидратировать нитроцеллюлозную мембрану с буфером переноса, содержащим 20% метанола. Промойте гель и мембрану с помощью переносного буфера и аккуратно распределите их по подготовительному стеку.Расположите бутерброд для переноса в таком порядке: отрицательный электрод, сэндвич-пена, промытый фильтровальной бумагой гель SDS-PAGE, промытая нитроцеллюлозная мембрана, фильтровальная бумага, сэндвич-пена, положительный электрод. После этого сложите собранный сэндвич в резервуар для переноски и работайте при 90 вольтах в течение 90 минут или 30 вольт в течение 360 минут. Блокируйте сухую мембрану в течение одного часа при комнатной температуре с помощью блокирующего буфера.Инкубируют мембраны с соответствующими разведениями первичных антител и бета-актина в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Затем дайте три промывки TBST в течение пяти минут каждая. Инкубировать промытую мембрану вторичным антителом, разведенным в блокирующем буфере в течение 60 минут и повторить три промывки TBST.После этого поместите промытую мембрану на плату для визуализации. Для выработки сигналов распределите раствор, приготовленный путем смешивания равных объемов каждого усиленного хемилюминесцентного реагента на мембране перед переносом платы визуализации в систему визуализации для визуализации. Лечение клеток HEK293 ставроспорином и N-этилмалеймидом или NEM вызывало снижение фосфорилирования на целевых участках SPAK, треонин 233, расположенный в домене киназы Т-петли, и сайт фосфорилирования S-петли серин 373 эндогенно экспрессированного SPAK.Ставроспорин уменьшал фосфорилирование серина 940 в клетках HEK294, стабильно экспрессирующих KCC2b, но NEM значительно увеличивал его фосфорилирование. Кроме того, ставроспорин уменьшает фосфорилирование на участке треонина 505, тогда как NEM вызывает незначительное, но незначительное увеличение фосфорилирования на том же участке. Дифференциальное влияние обоих соединений на фосфорилирование протеинкиназы С на участке треонина 505 и KCC2b на участке серина 940 хорошо коррелируют.Репрезентативный результат также показал, что NEM вызвал значительное увеличение экспрессии общего количества KCC2, тогда как экспрессия общего количества NKCC1 и SPAK не была существенно изменена при лечении обоими соединениями. Кроме того, эти два соединения вызывали снижение фосфорилирования SPAK на участках треонина 233 и серина 373, и это коррелировало с сокращенным фосфорилированием треонина 906/1007 и треонина 203/207/212 и эндогенно экспрессированного NKCC1 соответственно. Кроме того, ставроспорин и NEM уменьшали и увеличивали фосфорилирование протеинкиназы C на участке серина 940 и стабильно экспрессируемого KCC2b соответственно, что коррелировало с уменьшением и увеличением фосфорилирования дельты протеинкиназы C на участке треонина 505 при лечении ставроспорином и NEM соответственно.Если используется неправильное первичное или вторичное антитело, полоса не будет видна во время визуализации. Также сигнал может быть не виден, если используется слишком низкая концентрация антител. Методика является актуальным инструментом количественного анализа белка и позволила использовать ее для многих научных и ресурсных целей, в том числе в качестве эффективного инструмента ранней диагностики.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA и CLC: КТМ-1-зависимый Подавление CNTFRα в продемонстрированной Вестерн-блоттинга, ингибирование лизосомальных ферментов и иммуноцитохимию

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Западных Blotting протокол для небольшого числа гемопоэтических стволовых клеток

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-позитивных β-амилоида олигомера подготовки и оценки, с помощью Dot промокательной анализ

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Очистка эндогенных каналов транзиторных рецепторов дрозофилы

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...