Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094), y una beca de doctorado de la Commonwealth.

NOTA: El protocolo describe el método Western blotting para detectar proteínas específicas de interés.
1. Cultivo celular y transfección
<ol><li>Calentar todos los reactivos en el baño de perlas (37 °C) antes del procedimiento de cultivo celular. Prepare el medio de cultivo, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1% de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido no esencial, 100 mM de piruvato de sodio y 100 unidades/ml de penici...

Se han utilizado muchos métodos para medir las actividades de SLC12 de CCC que se expresan en las neuronas, incluido KCC2. Muchas de estas técnicas han demostrado mejorar el conocimiento científico sobre el análisis de la relevancia funcional de estos transportadores y sus patrones estructura-función en diferentes mutaciones relacionadas con la enfermedad. Críticamente, hay ventajas y advertencias para los diversos métodos21. Sin embargo, el protocolo explicado anteriormente, describió có...

El cotransportador de cloruro de potasio 2 (KCC2) es un miembro de la familia de portadores de solutos 12 (SLC12) de los cotransportadores catión-cloruro (CCC), que se encuentra exclusivamente en la neurona y es esencial para el buen funcionamiento de la homeostasis del Cl- y, en consecuencia, de la inhibición GABAérgica funcional 1,2,3,4. El mantenimiento de una baja concentración intraneuronal de Cl- ([Cl-]i) a 4-6 mM por KCC2 facilita la hiperpolarización del ácido γ-aminobutírico (GABA)/glicina y la inhibición sináptica en el cerebro y la médula espinal5. El fracaso en la regulación adecuada de KCC2 se ha asociado con la prevalencia de varias enfermedades neurológicas, incluyendo la epilepsia4. Además, la disminución de la extrusión de Cl− mediada por KCC2 y la alteración de las corrientes hiperpolarizantes mediadas por GABAA y/o receptores de glicina han sido implicadas en la epilepsia, el dolor neuropático y la espasticidad 6,7. El KCC2 neuronal se modula negativamente a través de la fosforilación de residuos reguladores clave dentro de su dominio intracelular C-terminal porel complejo de señalización de quinasa 1 con no-lisina (WNK)-STE20/SPS1 relacionado con prolina/alanina (SPAK)/oxidativo sensible al estrés (OSR), que facilita el mantenimiento de la actividad GABA despolarizada en neuronas inmaduras 2,8,9 . El WNK-SPAK/OSR1 fosforila los residuos de treonina 906 y 1007 (Thr906/Thr1007) y posteriormente regula a la baja la expresión génica del ARNm de KCC2, lo que lleva a un consiguiente deterioro de su función fisiológica 8,10. Más importante aún, sin embargo, ya es un hecho que se sabe que el complejo quinasa WNK-SPAK / OSR1 fosforila e inhibe la expresión de KCC2 1,2,4,11,12, y que la inhibición de las vías de señalización del complejo quinasa para fosforilar Thr906 / Thr1007 se ha relacionado con el aumento de la expresión del gen ARNm KCC2 13,14,15 . Es importante señalar que la regulación de la expresión neuronal de los cotransportadores KCC2 y Na+-K+-2Cl- 1 (NKCC1) a través de la fosforilación de proteínas funciona concomitantemente y en patrones inversos 1,4,16.
Ha habido avances consistentes y considerables en cuanto a la comprensión de los mecanismos involucrados en la regulación de KCC2, acreditados para el desarrollo de técnicas que permitan a los investigadores estudiar sus funciones y actividades; ya sea a través de investigaciones directas (evaluación de la fosforilación de sitios reguladores de quinasas) o indirectas (observación y monitoreo de la actividad GABA). El protocolo presentado aquí destaca la aplicación de técnicas de western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K+-Cl- KCC2 mediante la investigación de la fosforilación del cotransportador en los sitios reguladores de quinasas Thr906/1007.
Western blot es un método utilizado para detectar proteínas específicas de interés de una muestra de tejido o célula. Este método primero separa las proteínas por tamaño a través de la electroforesis. Luego, las proteínas se transfieren electroforéticamente a un soporte sólido (generalmente una membrana) antes de que la proteína objetivo se marque con un anticuerpo específico. Los anticuerpos se conjugan a diferentes etiquetas o anticuerpos conjugados con fluoróforos que se detectan mediante métodos colorimétricos, quimioluminiscencia o fluorescencia. Esto permite detectar una proteína diana específica a partir de una mezcla de proteínas. Esta técnica se ha utilizado para caracterizar sitios fosfoespecíficos de KCCs1 y se ha utilizado para identificar inhibidores de quinasa que inhiben la fosforilación de KCC3 Thr991/Thr104817. Al seguir este protocolo, se puede detectar específicamente KCC2 total y fosforilado a partir de lisados celulares/tisulares. En principio, la detección de anticuerpos conjugados con proteínas mediante esta técnica es muy instrumental, ya que ayuda a mejorar la comprensión de las actividades cooperativas en los fosfositios de KCC2, lo que arroja luz sobre los mecanismos moleculares implicados en sus regulaciones fisiológicas. El análisis cuantitativo de la expresión total de proteínas es representativo de la función y actividad de KCC2. Existen otros métodos clásicos utilizados para medir directamente la actividad de KCC2, como el ion rubidio y el ensayo de captación de iones talio. Otras técnicas como la electrofisiología de parche-pinza se utilizan para medir la actividad de GABA; por lo tanto, refleja indirectamente KCC2 activado y/o inactivado según lo informado por la evaluación de la homeostasis del ion cloruro intracelular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

El cotransportador de cloruro de potasio 2 (KCC2) es un miembro de la familia de portadores de solutos 12 (SLC12) de los cotransportadores de cloruro catiónico (CCC), que se encuentra exclusivamente en la neurona y es esencial para el buen funcionamiento de la homeostasis de Cl- y, en consecuencia, la inhibición GABAérgica funcional. La falla en la regulación adecuada de KCC2 es perjudicial y se ha asociado con la prevalencia de varias enfermedades neurológicas, incluida la epilepsia. Se ha avanzado considerablemente en la comprensión de los mecanismos implicados en la regulación del KCC2, acreditados para el desarrollo de técnicas que permitan a los investigadores estudiar sus funciones y actividades; ya sea a través de investigaciones directas (evaluación de la fosforilación de sitios reguladores de quinasas) o indirectas (observación y monitoreo de la actividad GABA). Aquí, el protocolo destaca cómo investigar la fosforilación de KCC2 en sitios reguladores de quinasa - Thr906 y Thr1007 - utilizando la técnica de Western Blotting. Existen otros métodos clásicos utilizados para medir directamente la actividad de KCC2, como el ion rubidio y el ensayo de captación de iones talio. Otras técnicas como la electrofisiología de parche-pinza se utilizan para medir la actividad de GABA; por lo tanto, refleja indirectamente KCC2 activado y/o inactivado según lo informado por la evaluación de la homeostasis del ion cloruro intracelular. Algunas de estas técnicas adicionales se discutirán brevemente en este manuscrito.

Aquí, el resultado representativo presentado en la Figura 1 investigó el impacto de la estaurosporina y NEM en la fosforilación mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 y NKCC1 en líneas celulares HEK293 que expresan de manera estable KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizando la técnica de western blotting. Los detalles completos sobre los resultados representativos se discuten en Zhang et al.15. Similar a NEM, la estaurosporina es un i...

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Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

El presente protocolo destaca la aplicación de la técnica Western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2. El protocolo describe la investigación de la fosforilación de KCC2 en los sitios reguladores de quinasa Thr906/1007 a través de Western blotting. Además, los métodos adicionales para confirmar la actividad de KCC2 se destacan brevemente en este texto.

Estudio de las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Este protocolo puede ayudar a comprender los mecanismos involucrados en la regulación de KCC2 al evaluar directamente su fosforilación del tamaño molecular de la quinasa, arrojando así luz sobre sus funciones y actividades fisiológicas. Se puede utilizar para identificar y caracterizar moléculas como proteínas de interés a partir de mezclas complejas de moléculas relacionadas, incluso cuando una expresión de proteína es muy diminuta. La técnica es una herramienta esencial para el análisis de proteínas de sistemas complejos y la identificación de posibles mecanismos subyacentes a la función o enfermedad aberrante del tejido.Demostrando los procedimientos estará Sunday Solomon Josiah, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Comience por prearmar todos los reactivos en el baño de cuentas de 37 grados centígrados y descongelar las células embrionarias humanas 293 de rata KCC2b transectadas de manera estable completamente en el baño de cuentas. Luego transfiera las células del tubo del vial criogénico a un tubo de centrífuga que contenga cinco mililitros de medios frescos y centrifugue las células a 1, 200 G durante tres a cinco minutos.Después de aspirar el sobrenadante con una pipeta aspiradora fijada a una bomba de vacío, resuspenda las células en 10 mililitros de medios frescos. Transfiera la suspensión a una placa de plato de 10 centímetros y deje que crezca durante 48 horas en una incubadora con una temperatura de 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono. Una vez que las células alcancen el 90% de confluencia, divídalas aspirando los medios viejos y enjuagándolos con dos mililitros de PBS.Agregue dos mililitros de tripsina e incube durante aproximadamente uno o dos minutos a temperatura ambiente. Lave las células tripsinizadas con dos mililitros del medio completo. Agregue nueve mililitros de medios frescos a los nuevos platos.Luego agregue un mililitro de solución del plato viejo al plato nuevo. Transfiera los platos de células divididas a la incubadora durante 48 horas para lograr más del 90% de confluencia. Trate las células con dimetilsulfóxido, estaurosporina de ocho micromolares o N-etilmaleimida de 0,5 milimolares durante 15 minutos antes de cosechar en tampón de lisis.Aspire los medios de la placa de cultivo transectada, coloque las placas de cultivo en hielo y lave las células con PBS helado. Aspire el PBS y agregue 1.0 mililitros de tampón de lisis helada al plato. Después de raspar las células del fondo del plato con un raspador de células de plástico frío, transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga colocado en hielo, seguido de agitación constante durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.Después de centrifugar los lisados celulares en una centrífuga fría, colóquela en hielo. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco preenfriado y deseche el pellet. Pipetear 300 microlitros de proteína G Sepharose en un tubo de microcentrífuga.Luego centrifugar la solución a 500 G durante dos minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue 500 microlitros de PBS y vórtice bien. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y repita el paso.A continuación, mezcle un miligramo de anticuerpos anti-KCC2 treonina 906 y anti-KCC2 treonina 1007 con 200 microlitros de perlas de proteína G Sepharose antes de compensar el volumen a 500 microlitros con PBS. Después de agitar en una plataforma vibratoria o rueda giratoria durante dos horas a cuatro grados centígrados, repita dos lavados con PBS. Llevar a cabo la cuantificación de proteínas en los lisados celulares y agregar un miligramo del lisado celular a las perlas lavadas e incubar en un rotador de extremo a extremo antes de girar.Dé tres lavados con PBS que contenga 150 milimolares de cloruro de sodio, seguidos de tres lavados con 200 microlitros de PBS antes de resuspender el pellet final en 100 microlitros de tampón de muestra LDS. Agite los tubos en un agitador de rotor a temperatura ambiente durante cinco minutos. Incubarlos en un bloque de calentamiento y centrifugarlos antes de usar el sobrenadante para la carga de gel.Ensamble el aparato de fundición Western Blot y vierta gel separador al 8% recién preparado para fundir el gel, dejando unos dos centímetros de espacio desde la parte superior del vidrio de fundición. Agregue 200 microlitros de isopropanol absoluto a la configuración y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos. Retire el isopropanol con una pipeta y enjuague cuidadosamente el gel con aproximadamente 200 microlitros de agua destilada.Después de agregar gel de apilamiento al 6% recién preparado a la configuración de fundición, encaje suavemente en el peine del pozo y deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego fije el gel fundido en el tanque de electroforesis. Después de verter el tampón de funcionamiento en el tanque, cargue cinco microlitros de marcador de peso molecular en el primer pocillo y una cantidad igual de proteína en cada pocillo del gel SDS-PAGE.Llene los pozos vacíos con LDS y haga correr el gel durante unos 90 a 120 minutos a 120 voltios. Rehidratar la membrana de nitrocelulosa con tampón de transferencia que contenga 20% de metanol. Enjuague el gel y la membrana con el tampón de transferencia y extiéndalos suavemente sobre la pila de preparación.Organice el sándwich a transferir en este orden: electrodo negativo, espuma sándwich, papel de filtro enjuagado gel SDS-PAGE, membrana de nitrocelulosa enjuagada, papel de filtro, espuma sándwich, electrodo positivo. Una vez hecho esto, apile el sándwich ensamblado en el tanque de transferencia y funcione a 90 voltios durante 90 minutos o 30 voltios durante 360 minutos. Bloquee la membrana seca durante una hora a temperatura ambiente utilizando un tampón de bloqueo.Incubar las membranas con diluciones apropiadas de anticuerpos primarios y beta-actina en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego dé tres lavados de TBST durante cinco minutos cada uno. Incubar la membrana lavada con un anticuerpo secundario diluido en un tampón de bloqueo durante 60 minutos y repetir tres lavados de TBST.Una vez hecho esto, coloque la membrana lavada en el tablero de imágenes. Para desarrollar las señales, extienda la solución preparada mezclando volúmenes iguales de cada reactivo de quimioluminiscencia mejorada en la membrana antes de transferir la placa de imágenes al sistema de imágenes para obtener imágenes. El tratamiento de las células HEK293 con estaurosporina y N-etilmaleimida o NEM causó una disminución de la fosforilación en los sitios objetivo SPAK, treonina 233 situada en el dominio de la quinasa del asa T, y el sitio de fosforilación del bucle S serina 373 de la SPAK expresada endógenamente.La estaurosporina redujo la fosforilación de la serina 940 en células HEK294 que expresan KCC2b de manera estable, pero NEM aumentó significativamente su fosforilación. Además, la estaurosporina disminuye la fosforilación en el sitio de treonina 505, mientras que NEM causó un aumento leve pero insignificante en la fosforilación en el mismo sitio. Los efectos diferenciales de ambos compuestos sobre la fosforilación de la proteína quinasa C en el sitio treonina 505 y KCC2b en el sitio de serina 940 se correlacionan bien.El resultado representativo también mostró que NEM causó un aumento significativo en la expresión de la cantidad total de KCC2, mientras que la expresión del NKCC1 total y SPAK no cambió significativamente cuando se trató con ambos compuestos. Además, los dos compuestos causaron una disminución de la fosforilación de SPAK en los sitios treonina 233 y serina 373, y esto se correlacionó con la fosforilación abreviada de treonina 906/1007 y treonina 203/207/212 y NKCC1 endógenamente expresada respectivamente. Además, la estaurosporina y NEM redujeron y aumentaron la fosforilación de la proteína quinasa C en el sitio de serina 940 y expresaron de manera estable KCC2b respectivamente, lo que se correlacionó con la reducción y el incremento en la fosforilación de la proteína quinasa C delta en el sitio de treonina 505 tras el tratamiento con estaurosporina y NEM, respectivamente.Si se usa un anticuerpo primario o secundario inadecuado, la banda no se verá durante la toma de imágenes. Además, la señal puede no ser visible si se utiliza una concentración demasiado baja de anticuerpos. La técnica es una herramienta relevante en el análisis cuantitativo de proteínas y ha permitido su uso para muchos propósitos científicos y de recursos, incluso como una herramienta efectiva de diagnóstico temprano.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA y CLC: regulación a la baja de CLF-1 dependiente de CNTFRα como se ha demostrado a través de Western Blot, la inhibición de enzimas lisosomales, y inmunocitoquímica

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medidas solo de liposomas para el estudio de enzimas de membrana bombas de protones usando electroquímica y microscopia fluorescente

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...