Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Detta arbete stöddes av The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) och ett Commonwealth Ph.D. Scholarship.

OBS: Protokollet beskriver den västra blottningsmetoden för att detektera specifika proteiner av intresse.
1. Cellodling och transfektion
<ol><li>Värm alla reagenser i pärlbadet (37 °C) före cellodlingsproceduren. Förbered odlingsmedium, Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM), kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1% vardera av 2mM L-glutamin, 100x icke-essentiell aminosyra, 100 mM natriumpyruvat och 100 enheter / ml penicillin-streptomycin.</li>
	<li>Tina stab...

Många metoder har använts för att mäta aktiviteterna hos SLC12 av CCC som uttrycks i neuronerna, inklusive KCC2. Många av dessa tekniker har visat sig öka den vetenskapliga kunskapen om analysen av dessa transportörers funktionella relevans och deras struktur-funktionsmönster i olika sjukdomsrelaterade mutationer. Kritiskt finns det fördelar och förbehåll för de olika metoderna21. Protokollet som förklaras ovan beskrev dock hur man bedömer KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställ...

Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning 1,2,3,4. Upprätthållandet av låg intraneuronal Cl- koncentration ([Cl-]i) vid 4-6 mM av KCC2 underlättar γ-aminosmörsyra (GABA)/glycinhyperpolarisering och synaptisk hämning i hjärnan och ryggmärgen5. Misslyckande i korrekt reglering av KCC2 har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi4. Dessutom har minskad KCC2-medierad Cl−-extrudering och nedsatt hyperpolariserande GABAA- och/eller glycinreceptormedierade strömmar varit inblandade i epilepsi, neuropatisk smärta och spasticitet 6,7. Neuronal KCC2 moduleras negativt via fosforylering av viktiga regulatoriska rester inom dess C-terminala intracellulära domän av med-ingen-lysin (WNK) -STE20 / SPS1-relaterad prolin / alaninrik (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinassignalkomplex1, vilket underlättar upprätthållandet av depolariserad GABA-aktivitet i omogna neuroner 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1-fosforylerar treoninrester 906 och 1007 (Thr906/Thr1007) och nedreglerar därefter mRNA-genuttrycket av KCC2, vilket leder till en därav följande försämring av dess fysiologiska funktion 8,10. Ännu viktigare är dock att det redan är ett faktum att WNK-SPAK / OSR1-kinaskomplexet är känt för att fosforylera och hämma KCC2-uttryck 1,2,4,11,12, och att hämningen av kinaskomplexets signalvägar till fosforylat Thr906 / Thr1007 har kopplats till det ökade uttrycket av KCC2 mRNA-genen13,14,15 . Det är viktigt att notera att regleringen av neuronala KCC2- och Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) uttryck via proteinfosforylering fungerar samtidigt och i omvända mönster 1,4,16.
Det har gjorts konsekventa och betydande framsteg när det gäller förståelsen av mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Protokollet som presenteras här belyser tillämpningen av västerländska blottningstekniker för att studera funktionerna och aktiviteterna hos neuronal K +-Cl- co-transporter KCC2 genom att undersöka fosforyleringen av cotransporter vid kinasregleringsställen Thr906/1007.
Western blot är en metod som används för att detektera specifika proteiner av intresse från ett prov av vävnad eller cell. Denna metod separerar först proteinerna efter storlek genom elektrofores. Proteinerna överförs sedan elektroforetiskt till ett fast stöd (vanligtvis ett membran) innan målproteinet markeras med hjälp av en specifik antikropp. Antikropparna konjugeras till olika taggar eller fluoroforkonjugerade antikroppar som detekteras med antingen kolorimetriska, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Detta gör det möjligt att detektera ett specifikt målprotein från en blandning av proteiner. Denna teknik har använts för att karakterisera fosfospecifika ställen för KCCs1 och har använts för att identifiera kinashämmare som hämmar KCC3 Thr991/Thr1048 fosforylering17. Genom att följa detta protokoll kan man specifikt detektera total och fosforylerad KCC2 från cell/ vävnadslysater. I princip är detektionen av proteinkonjugerade antikroppar med denna teknik mycket instrumentell eftersom den bidrar till att förbättra förståelsen för samarbetsaktiviteter vid fosfo-platserna i KCC2, vilket belyser de molekylära mekanismerna som är involverade i deras fysiologiska regler. Den kvantitativa analysen av det totala proteinuttrycket är representativ för KCC2: s funktion och aktivitet. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning. Misslyckande med korrekt reglering av KCC2 är skadligt och har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi. Det har gjorts betydande framsteg när det gäller att förstå de mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Här belyser protokollet hur man undersöker KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen - Thr906 och Thr1007 - med hjälp av western blotting-teknik. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas. Några av dessa ytterligare tekniker kommer att diskuteras kort i detta manuskript.

Här undersökte det representativa resultatet som presenteras i figur 1 effekten av staurosporin och NEM på WNK-SPAK / OSR1-medierad fosforylering av KCC2 och NKCC1 i HEK293-cellinjer som stabilt uttrycker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 med hjälp av western blotting-tekniken. Omfattande detaljer om de representativa resultaten diskuteras i Zhang et al.15. I likhet med NEM är staurosporin en bred kinashämmare som kan förbättra K...

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Detta protokoll belyser tillämpningen av western blotting-teknik för att studera funktioner och aktiviteter hos neuronal K-Cl-co-transporter KCC2. Protokollet beskriver undersökningen av KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen Thr906/1007 via western blotting. Dessutom markeras ytterligare metoder för att bekräfta KCC2-aktivitet kort i den här texten.

Studie av funktioner och aktiviteter av neuronala K-Cl Co-Transporter KCC2 med hjälp av Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Detta protokoll kan hjälpa till att förstå mekanismerna som är involverade i KCC2-reglering genom att direkt bedöma dess fosforylering av kinasmolekylstorlek och därmed belysa dess fysiologiska funktioner och aktiviteter. Det kan användas för att identifiera och karakterisera molekyler som proteiner av intresse från komplexa blandningar av relaterade molekyler även när ett proteinuttryck är mycket litet. Tekniken är ett viktigt verktyg för proteinanalys av komplexa system och för att identifiera potentiella mekanismer som ligger till grund för avvikande vävnadsfunktion eller sjukdom.Demonstrerar procedurerna kommer att vara Sunday Solomon Josiah, doktorand från mitt laboratorium. Börja med att förarma alla reagenser i 37 grader Celsius pärlbad och tina den stabilt transekterade råttan KCC2b human embryonal njure 293 celler helt i pärlbadet. Överför sedan cellerna från kryoflaskans rör till ett centrifugrör innehållande fem milliliter färskt medium och centrifugera cellerna vid 1 200 G i tre till fem minuter.Efter aspirering av supernatanten med hjälp av en aspiratorpipett fixerad till en vakuumpump, återsuspendera cellerna i 10 ml färskt media. Överför suspensionen till en 10 centimeter diskplatta och låt den växa i 48 timmar i en inkubator med 37 grader Celsius temperatur och 5% koldioxid. När cellerna uppnår 90% sammanflöde, dela dem genom att aspirera det gamla mediet och skölja dem med två milliliter PBS.Tillsätt två milliliter trypsin och inkubera dem i cirka en till två minuter vid rumstemperatur. Tvätta de trypsiniserade cellerna med två milliliter av hela mediet. Lägg till nio milliliter färskt media till de nya rätterna.Tillsätt sedan en milliliter lösning från den gamla skålen till den nya skålen. Överför de delade celldiskarna till inkubatorn i 48 timmar för att uppnå mer än 90% sammanflöde. Behandla cellerna med antingen dimetylsulfoxid, åtta mikromolära staurosporin eller 0,5 millimolar N-etylmaleimid i 15 minuter innan de skördas i lysbuffert.Aspirera media från den transekterade odlingsskålen, placera kulturrätterna på is och tvätta cellerna med iskall PBS. Aspirera PBS och tillsätt 1,0 ml iskall lysbuffert till skålen. Efter att ha skrapat cellerna från botten av skålen med en kall plastcellskrapa, överför cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör placerat på is, följt av konstant omrörning i 30 minuter vid fyra grader Celsius.Efter centrifugering av celllysaterna i en kall centrifug, placera den på is. Samla supernatanten i ett förkylt färskt rör och kassera pelleten. Pipettera 300 mikroliter protein G Sepharose i ett mikrocentrifugrör.Centrifugera sedan lösningen vid 500 G i två minuter. Efter att ha kastat supernatanten, tillsätt 500 mikroliter PBS och virvelbrunn. Kassera supernatanten efter centrifugering och upprepa steget.Blanda sedan ett milligram anti-KCC2 treonin 906 och anti-KCC2 treonin 1007 antikroppar med 200 mikroliter protein G Sepharose pärlor innan du gör upp volymen till 500 mikroliter med PBS. Efter skakning på en vibrerande plattform eller roterande hjul i två timmar vid fyra grader Celsius, upprepa två tvättar med PBS. Utför proteinkvantifiering på celllysaterna och tillsätt ett milligram av celllysatet till de tvättade pärlorna och inkubera i en end-to-end-rotator innan den snurrar ner.Ge tre tvättar med PBS som innehåller 150 millimolar natriumklorid, följt av tre tvättar med 200 mikroliter PBS innan du återsuspenderar slutpelleten i 100 mikroliter LDS-provbuffert. Skaka rören i en rotorskakare vid rumstemperatur i fem minuter. Inkubera dem i ett värmeblock och centrifugera dem innan du använder supernatanten för gelbelastning.Montera Western Blot-gjutapparaten och häll nyberedd 8% separeringsgel för att gjuta gelén, vilket ger cirka två centimeter utrymme från toppen av gjutglaset. Tillsätt 200 mikroliter absolut isopropanol till installationen och låt den stå vid rumstemperatur i 60 minuter. Ta bort isopropanolen med en pipett och skölj försiktigt gelén med cirka 200 mikroliter destillerat vatten.Efter tillsats av nyberedd 6% staplingsgel till gjutningsinställningen, passa försiktigt i brunnskammen och låt stå vid rumstemperatur i 30 minuter. Fixera sedan den gjutna gelén i elektroforestanken. Efter att ha hällt den löpande bufferten i tanken, ladda fem mikroliter molekylviktmarkör i den första brunnen och en lika stor mängd protein i varje brunn i SDS-PAGE-gelén.Fyll de tomma brunnarna med LDS och kör gelén i cirka 90 till 120 minuter vid 120 volt. Rehydrera nitrocellulosamembranet med överföringsbuffert innehållande 20% metanol. Skölj gelén och membranet med överföringsbufferten och sprid dem försiktigt ut på beredningsstapeln.Ordna smörgåsen som ska överföras i denna ordning: negativ elektrod, smörgåsskum, filterpapper sköljd SDS-PAGE-gel, sköljt nitrocellulosamembran, filterpapper, sandwichskum, positiv elektrod. När du är klar staplar du den monterade smörgåsen i överföringstanken och kör med 90 volt i 90 minuter eller 30 volt i 360 minuter. Blockera det torra membranet i en timme vid rumstemperatur med hjälp av en blockerande buffert.Inkubera membranen med lämpliga utspädningar av primär antikropp och beta-aktin i blockerande buffert i en timme vid rumstemperatur eller över natten vid fyra grader Celsius. Ge sedan tre tvättar av TBST i fem minuter vardera. Inkubera det tvättade membranet med en sekundär antikropp utspädd i en blockerande buffert i 60 minuter och upprepa tre tvättar av TBST.När du är klar placerar du det tvättade membranet på bildkortet. För att utveckla signalerna, sprida lösningen framställd genom att blanda lika stora volymer av varje förstärkt kemiluminescensreagens på membranet innan avbildningskortet överförs till bildsystemet för avbildning. Behandlingen av HEK293-celler med staurosporin och N-etylmaleimid eller NEM orsakade minskad fosforylering vid PAK-målplatser, treonin 233 belägen i T-loopkinasdomänen och S-loop-fosforyleringsstället serin 373 av endogent uttryckt SPAK.Staurosporin minskade fosforyleringen av serin 940 i HEK294-celler som stabilt uttrycker KCC2b, men NEM ökade signifikant dess fosforylering. Dessutom minskar staurosporin fosforyleringen vid treonin 505-stället, medan NEM orsakade en liten men obetydlig ökning av fosforylering på samma plats. De differentiella effekterna av båda föreningarna på fosforyleringen av proteinkinas C vid treonin 505-platsen och KCC2b vid serin 940-platsen korrelerar väl.Det representativa resultatet visade också att NEM orsakade en signifikant ökning av uttrycket av den totala KCC2-mängden, medan uttrycket av den totala NKCC1 och SPAK inte förändrades signifikant när de behandlades med båda föreningarna. Vidare orsakade de två föreningarna en minskad fosforylering av SPAK vid treonin 233 och serin 373 platser, och detta korrelerade med den förkortade fosforyleringen av treonin 906/1007 och treonin 203/207/212 respektive endogent uttryckt NKCC1. Dessutom reducerade och ökade staurosporin och NEM fosforyleringen av proteinkinas C vid serin 940-stället respektive stabilt uttryckt KCC2b, vilket korrelerade med reduktionen och ökningen av fosforyleringen av proteinkinas C-delta vid treonin 505-platsen vid staurosporin respektive NEM-behandling.Om en felaktig primär eller sekundär antikropp används kommer bandet inte att ses under avbildningen. Signalen kanske inte heller är synlig om en för låg koncentration av antikroppar används. Tekniken är ett relevant verktyg i kvantitativ analys av protein och har gjort det möjligt att använda det för många vetenskapliga och resursändamål, inklusive som ett effektivt tidigt diagnostiskt verktyg.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA och CLC: CLF-1-beroende nedreglering av CNTFRa som framgår av Western blotting, Hämning av lysosomala enzymer och Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positiv β-amyloid oligomerer beredning och bedömning med hjälp av Dot Blotting analys

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultrahög hastighet Western Blot med hjälp av immunoreaction förbättra teknik

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Rening av endogena Drosophila transienta receptorpotentialkanaler

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...