Name: study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Bu çalışma The Royal Society UK (Hibe no. IEC\NSFC\201094) ve Commonwealth Ph.D. Bursu tarafından desteklenmiştir.

NOT: Protokol, ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için batı lekeleme yöntemini açıklar.
1. Hücre kültürü ve transfeksiyon
<ol><li>Hücre kültürü prosedüründen önce boncuk banyosundaki (37 ° C) tüm reaktifleri ısıtın. % 10 fetal sığır serumu,% 1 2mM L-glutamin, 100x esansiyel olmayan amino asit, 100 mM sodyum piruvat ve 100 birim / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamı olan Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM)...

KCC2 de dahil olmak üzere nöronlarda eksprese edilen CCC'lerin SLC12 aktivitelerini ölçmek için birçok yöntem kullanılmıştır. Bu tekniklerin birçoğunun, bu taşıyıcıların fonksiyonel ilgisinin analizi ve hastalıkla ilgili farklı mutasyonlardaki yapı-fonksiyon paternleri hakkında bilimsel bilgiyi arttırdığı kanıtlanmıştır. Kritik olarak, çeşitli yöntemlerin avantajları ve uyarıları vardır21. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan protokol, KCC2'nin işlevlerini ...

Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon 1,2,3,4 için gereklidir. KCC2 ile 4-6 mM'de düşük intranöronal Cl-konsantrasyonunun ([Cl-]i) korunması, beyin ve omurilikte γ-aminobütirik asit (GABA) / glisin hiperpolarizasyonunu ve sinaptik inhibisyonunu kolaylaştırır5. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık, epilepsi4 de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, azalmış KCC2 aracılı Cl− ekstrüzyon ve bozulmuş hiperpolarize edici GABAA ve / veya glisin reseptörü aracılı akımlar epilepsi, nöropatik ağrı ve spastisite 6,7 ile ilişkilendirilmiştir. Nöronal KCC2, C-terminali hücre içi etki alanındaki anahtar düzenleyici kalıntıların, lizinsiz (WNK)-STE20 / SPS1 ile ilişkili prolin / alanin bakımından zengin (SPAK) / Oksidatif strese duyarlı (OSR) kinaz sinyal kompleksi1 tarafından fosforilasyonu yoluyla negatif olarak modüle edilir ve bu da olgunlaşmamış nöronlarda depolarize GABA aktivitesinin korunmasını kolaylaştırır 2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1, treonin kalıntıları 906 ve 1007'yi (Thr906 / Thr1007) fosforile eder ve daha sonra KCC2'nin mRNA gen ekspresyonunu aşağı regüle eder ve bunun sonucunda fizyolojik fonksiyonundabozulmaya yol açar 8,10. Bununla birlikte, daha da önemlisi, WNK-SPAK / OSR1 kinaz kompleksinin KCC2 ekspresyonu 1,2,4,11,12'yi fosforile ettiği ve inhibe ettiği ve Thr906 / Thr1007'yi fosforile etmek için kinaz kompleksi sinyal yollarının inhibisyonunun KCC2 mRNA geninin artan ekspresyonu ile bağlantılı olduğu zaten bir gerçektir13,14,15 . Nöronal KCC2 ve Na+-K+-2Cl- kotransporters 1 (NKCC1) ekspresyonunun protein fosforilasyonu yoluyla düzenlenmesinin eşzamanlı ve ters paternlerde1,4,16 olarak çalıştığını belirtmek önemlidir.
Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda tutarlı ve önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada sunulan protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de kotransporterin fosforilasyonunu araştırarak nöronal K + -Cl - ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı lekeleme tekniklerinin uygulanmasını vurgulamaktadır.
Western blot, bir doku veya hücre örneğinden ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem önce proteinleri elektroforez yoluyla boyutlarına göre ayırır. Proteinler daha sonra, hedef protein spesifik bir antikor kullanılarak işaretlenmeden önce elektroforetik olarak katı bir desteğe (genellikle bir zar) aktarılır. Antikorlar, kolorimetrik, kemilüminesans veya floresan yöntemleri kullanılarak tespit edilen farklı etiketlere veya florofor konjuge antikorlara konjuge edilir. Bu, belirli bir hedef proteinin bir protein karışımından tespit edilmesini sağlar. Bu teknik, KCCs1'in fosfospesifik bölgelerini karakterize etmek için kullanılmıştır ve KCC3 Thr991 / Thr1048 fosforilasyon17'yi inhibe eden kinaz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bu protokolü izleyerek, hücre / doku lizatlarından toplam ve fosforile KCC2'yi spesifik olarak tespit edebilirsiniz. Prensip olarak, protein konjuge antikorların bu teknikle tespiti, fizyolojik düzenlemelerinde yer alan moleküler mekanizmalara ışık tutan KCC2'nin fosfo-bölgelerindeki işbirlikçi faaliyetlerin anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olduğu için oldukça etkilidir. Toplam protein ekspresyonunun kantitatif analizi, KCC2'nin işlevini ve aktivitesini temsil eder. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2917</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Per Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti pSPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S670B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S700C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pSer940</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-95678</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr1007</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S961C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KCC2 pThr906</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S959C</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>66002</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S841B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NKCC1 pThr203/207/212</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S763B</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sheep</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6900</td>
			<td>Used as secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SPAK</td>
			<td>Dundee University</td>
			<td>S669D</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamine</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>135828</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Used as component of loading buffer and lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Coomasie</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1856209</td>
			<td>Used for lysate protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting apparatus</td>
			<td>Atto&#160;</td>
			<td>WSE-1165W</td>
			<td>Used to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td>Used in lysate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MicroStar 17R</td>
			<td>Used for spinning samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried Skimmed Milk</td>
			<td>Marvel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL reagent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ORTT755/2655</td>
			<td>Used to develop image for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0700/53</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>e4378</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PowerPAC HC</td>
			<td>To supply power to run SDS-page electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Used for preparing sterilized equipments and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum -&#160; heat inactivated</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumehood</td>
			<td>Walker</td>
			<td>A7277</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Blotting - Whatman</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>10426981</td>
			<td>Used in western blotting to make transfer sandwich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15527</td>
			<td>Used to make buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., USA</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>Used for plotting graphs and analysing data for&#160; western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10647282</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Grant</td>
			<td>QBT1</td>
			<td>Used to heat WB loading samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>12022001-1VL</td>
			<td>Cell line for culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA&#160;</td>
			<td>ImageJ 1.53e</td>
			<td>Used to measure band intensities from western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Used to take western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>LEEC precision 190D</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24137</td>
			<td>Used in casting gel for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium dodecyl sulfate (LDS)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Used as loading buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acid&#160;</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>Used for preparing lysates for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iMark</td>
			<td>Used for lysate protein concentration readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Powerpoint</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>PowerPoint2016</td>
			<td>Used to edit western blotting images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Weight Marker</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610373</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23030</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45004091</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Seven compact s210</td>
			<td>Used to monitor pH of buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#948; pThr505</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>9374</td>
			<td>Used as primary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose Protein G</td>
			<td>Generon</td>
			<td>PG50-00-0002</td>
			<td>Used for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used as component of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used to prepare TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium-&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Merck UK</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>S4400-1MG</td>
			<td>Used for cell culture experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Scientifc Laboratory Supplies</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td>Used in western blotting to transfer protein on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used as component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Merck Life Sciences UK</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3179</td>
			<td>Used as make TBS-T buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Charles Austen</td>
			<td>Dymax 5</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>K-550-GE</td>
			<td>Used in sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries Ltd</td>
			<td>Vortex-Genie&#160; K-550-GE</td>
			<td>Used of mixing resolved sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td>
			<td>JBA5</td>
			<td>Used to incubate solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of the functions and activities of neuronal k-cl co-transporter kcc2 using western blotting

Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon için gereklidir. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık zararlıdır ve epilepsi de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada protokol, kinaz düzenleyici bölgelerde (Thr906 ve Thr1007) KCC2 fosforilasyonunun batı lekelenme tekniğini kullanarak nasıl araştırılacağını vurgulamaktadır. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır. Bu ek tekniklerden birkaçı bu makalede kısaca tartışılacaktır.

Burada, Şekil 1'de sunulan temsili sonuç, batı lekeleme tekniğini kullanarak KCC2b'yi (HEK rnKCC2b)18 kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293 hücre hatlarında KCC2 veNKCC1'in WNK-SPAK / OSR1 aracılı fosforilasyonu üzerine staurosporin ve NEM'in etkisini araştırmıştır. Temsili sonuçlarla ilgili kapsamlı ayrıntılar Zhang ve ark.15'te tartışılmaktadır. NEM'e benzer şekilde, staurosporin, KCC2 taşıma ...

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting at JoVE.com

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Bu protokol, kinaz moleküler boyut fosforilasyonunu doğrudan değerlendirerek KCC2 regülasyonunda yer alan mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olabilir, böylece fizyolojik fonksiyonlarına ve aktivitelerine ışık tutabilir. Bir protein ekspresyonu çok küçük olsa bile, ilgili moleküllerin karmaşık karışımlarından ilgilenen proteinler gibi molekülleri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu teknik, karmaşık sistemlerin protein analizi ve anormal doku fonksiyonunun veya hastalığının altında yatan potansiyel mekanizmaların belirlenmesi için gerekli bir araçtır.Prosedürleri gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Sunday Solomon Josiah olacak. 37 santigrat derece boncuk banyosundaki tüm reaktifleri önceden silahlandırarak ve kararlı bir şekilde transekte edilmiş sıçan KCC2b insan embriyonik böbrek 293 hücrelerini tamamen boncuk banyosunda çözerek başlayın. Daha sonra hücreleri kriyo şişe tüpünden beş mililitre taze ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri üç ila beş dakika boyunca 1.200 G'de santrifüj edin.Bir vakum pompasına sabitlenmiş bir aspiratör pipeti kullanarak süpernatantı aspire ettikten sonra, hücreleri 10 mililitre taze ortamda yeniden askıya alın. Süspansiyonu 10 santimetrelik bir çanak tabağa aktarın ve 37 santigrat derece sıcaklığa ve% 5 karbondioksite sahip bir inkübatörde 48 saat boyunca büyümesine izin verin. Hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında, eski medyayı aspire ederek ve iki mililitre PBS ile durulayarak bölün.İki mililitre tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık bir ila iki dakika inkübe edin. Tripsinizli hücreleri, tam ortamın iki mililitresini kullanarak yıkayın. Yeni yemeklere dokuz mililitre taze medya ekleyin.Sonra eski tabaktan yeni tabağa bir mililitre çözelti ekleyin. % 90'dan fazla akıcılık elde etmek için bölünmüş hücre kaplarını 48 saat boyunca inkübatöre aktarın. Lizis tamponunda hasat edilmeden önce hücreleri dimetil sülfoksit, sekiz mikromolar staurosporin veya 0.5 milimolar N-etilmaleimid ile 15 dakika boyunca tedavi edin.Transekte kültür kabından ortamı aspire edin, kültür bulaşıklarını buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve kaba 1.0 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Soğuk bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kabın dibinden kazıdıktan sonra, hücre süspansiyonunu buz üzerine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sürekli ajitasyon yapın.Hücre lizatlarını soğuk bir santrifüjde santrifüj ettikten sonra, buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı önceden soğutulmuş taze bir tüpe toplayın ve peleti atın. Pipet 300 mikrolitre Protein G Sefaroz bir mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirin.Daha sonra çözeltiyi iki dakika boyunca 500 G'de santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, 500 mikrolitre PBS ve vorteks kuyusu ekleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın ve adımı tekrarlayın.Daha sonra, PBS ile 500 mikrolitreye kadar hacmi telafi etmeden önce, bir miligram anti-KCC2 treonin 906 ve anti-KCC2 treonin 1007 antikorlarını 200 mikrolitre Protein G Sefaroz boncuklarıyla karıştırın. Titreşimli bir platformda veya dönen tekerleğin üzerinde dört santigrat derecede iki saat sallandıktan sonra, PBS ile iki yıkamayı tekrarlayın. Hücre lizatları üzerinde protein niceliği yapın ve yıkanmış boncuklara hücre lizatının bir miligramını ekleyin ve dönmeden önce uçtan uca bir rotatörde inkübe edin.Son peleti 100 mikrolitre LDS numune tamponunda yeniden askıya almadan önce 150 milimolar sodyum klorür içeren PBS ile üç yıkama, ardından 200 mikrolitre PBS ile üç yıkama yapın. Tüpleri bir rotor çalkalayıcıda oda sıcaklığında beş dakika çalkalayın. Onları bir ısıtma bloğunda inkübe edin ve jel yükleme için süpernatantı kullanmadan önce santrifüj edin.Western Blot döküm aparatını monte edin ve jeli dökmek için taze hazırlanmış% 8 ayırıcı jel dökün, döküm camının üstünden yaklaşık iki santimetre alan bırakın. Kuruluma 200 mikrolitre mutlak izopropanol ekleyin ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin. İzopropanolü bir pipet kullanarak çıkarın ve jeli yaklaşık 200 mikrolitre damıtılmış su ile dikkatlice durulayın.Döküm kurulumuna taze hazırlanmış% 6 istifleme jeli ekledikten sonra, kuyu tarağına yavaşça oturtun ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra döküm jeli elektroforez tankına sabitleyin. Çalışan tamponu tanka döktükten sonra, ilk kuyucuğa beş mikrolitre moleküler ağırlık işaretleyicisi ve SDS-PAGE jelinin her bir kuyucuğuna eşit miktarda protein yükleyin.Boş kuyucukları LDS ile doldurun ve jeli 120 voltta yaklaşık 90 ila 120 dakika çalıştırın. Nitroselüloz membranı% 20 metanol içeren transfer tamponu ile rehidre edin. Jeli ve membranı transfer tamponu ile durulayın ve bunları hazırlama yığınına yavaşça yayın.Aktarılacak sandviçi şu sırayla düzenleyin:negatif elektrot, sandviç köpüğü, filtre kağıdı durulanmış SDS-PAGE jel, durulanmış nitroselüloz membran, filtre kağıdı, sandviç köpüğü, pozitif elektrot. İşiniz bittiğinde, monte edilmiş sandviçi transfer tankına istifleyin ve 90 dakika boyunca 90 voltta veya 360 dakika boyunca 30 voltta çalıştırın. Bir blokaj tamponu kullanarak kuru membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin.Membranları, oda sıcaklığında bir saat boyunca veya gece boyunca dört santigrat derecede bloke edici tamponda uygun primer antikor ve beta-aktin seyreltimleriyle inkübe edin. Ardından, her biri beş dakika boyunca üç TBST yıkaması yapın. Yıkanmış zarı, 60 dakika boyunca bloke edici bir tamponda seyreltilmiş ikincil bir antikor ile inkübe edin ve üç TBST yıkamasını tekrarlayın.İşiniz bittiğinde, yıkanmış zarı görüntüleme panosuna yerleştirin. Sinyalleri geliştirmek için, görüntüleme kartını görüntüleme için görüntüleme sistemine aktarmadan önce, her bir gelişmiş kemilüminesans reaktifinin eşit hacimlerinde membran üzerinde karıştırılmasıyla hazırlanan çözeltiyi yayın. HEK293 hücrelerinin staurosporin ve N-etilmaleimide veya NEM ile tedavisi, SPAK hedef bölgelerinde, T-döngü kinaz alanında bulunan treonin 233'te ve endojen olarak eksprese edilen SPAK'ın S-döngü fosforilasyon bölgesi serin 373'ünde fosforilasyonun azalmasına neden olmuştur.Staurosporin, HEK294 hücrelerinde serin 940'ın fosforilasyonunu azalttı ve KCC2b'yi istikrarlı bir şekilde ifade etti, ancak NEM fosforilasyonunu önemli ölçüde arttırdı. Ayrıca, staurosporin, treonin 505 bölgesinde fosforilasyonu azaltırken, NEM aynı bölgede fosforilasyonda hafif ama önemsiz bir artışa neden olmuştur. Her iki bileşiğin treonin 505 bölgesinde protein kinaz C ve serin 940 bölgesinde KCC2b'nin fosforilasyonu üzerindeki diferansiyel etkileri iyi ilişkilidir.Temsili sonuç ayrıca, NEM'in toplam KCC2 miktarının ekspresyonunda önemli bir artışa neden olduğunu, oysa toplam NKCC1 ve SPAK'ın ekspresyonunun her iki bileşikle de tedavi edildiğinde önemli ölçüde değişmediğini göstermiştir. Ayrıca, iki bileşik treonin 233 ve serin 373 bölgelerinde SPAK'ın fosforilasyonunun azalmasına neden oldu ve bu, sırasıyla treonin 906/1007 ve treonin 203/207/212'nin kısaltılmış fosforilasyonu ile ilişkili ve endojen olarak eksprese edilen NKCC1 ile ilişkiliydi. Ek olarak, staurosporin ve NEM, sırasıyla serin 940 bölgesinde protein kinaz C'nin fosforilasyonunu azalttı ve arttırdı ve sırasıyla staurosporin ve NEM tedavisi üzerine treonin 505 bölgesinde protein kinaz C deltasının fosforilasyonundaki azalma ve artış ile ilişkili olan KCC2b'yi kararlı bir şekilde ifade etti.Uygun olmayan bir primer veya sekonder antikor kullanılırsa, görüntüleme sırasında bant görülmeyecektir. Ayrıca, çok düşük bir antikor konsantrasyonu kullanıldığında sinyal görünmeyebilir. Teknik, proteinin kantitatif analizinde ilgili bir araçtır ve etkili bir erken tanı aracı olarak da dahil olmak üzere birçok bilimsel ve kaynak amacı için kullanılmasına izin vermiştir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA CLC: Western Blot, lizozomal enzimlerin inhibisyonu ve immunositokimya ile gösterildiği gibi CNTFRα CLF-1 bağımlı baskılanması

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...