Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

تم دعم هذا البحث في المقام الأول بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (UG3 / UH3TR002136 ، UG3 / UH3TR003090). بالإضافة إلى ذلك ، نشكر الدكتور بول مانر (جامعة واشنطن) على توفير عينات الأنسجة البشرية والدكتور جيان تان لمساعدتهم في عزل MSCs وإنشاء تجمع الخلايا.

يتبع البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية الأخلاقية لجامعة بيتسبرغ ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة بيتسبرغ. يتم سرد المعلومات حول المواد المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.
1. تصنيع المفاعلات الحيوية المطبوعة 3D
<ol><li>استخدم برنامج كمبيوتر لتصم?...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا لإنشاء نظام مفصل الركبة على رقاقة ، حيث يتم تشكيل العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية والأنسجة الشبيهة بالغشاء الزليلي من MSCs ويتم استزراعها بشكل مشترك داخل مفاعل حيوي مخصص. يمثل هذا النظام متعدد المكونات المشتق من الخلايا البشرية مع ميزات التوصيل والتشغيل أ...

أمراض المفاصل مثل هشاشة العظام (OA) منتشرة للغاية وموهنة وتمثل سببا رئيسيا للإعاقة في جميع أنحاء العالم1. تشير التقديرات إلى أنه في الولايات المتحدة وحدها ، يؤثر OA على 27 مليون مريض ويحدث في 12.1٪ من البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 60 وما فوق2. لسوء الحظ ، فإن معظم الأدوية المستخدمة حاليا لإدارة أمراض المفاصل ملطفة ، ولا تتوفر أدوية OA فعالة لتعديل المرض (DMOADs)3. تنبع هذه الحاجة الطبية غير الملباة في المقام الأول من عدم وجود نموذج فعال لدراسة آليات المرض وتطوير DMOADs المحتملة. لا تعكس زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) الطبيعة ثلاثية الأبعاد لأنسجة المفاصل ، وغالبا ما يتم إعاقة زراعة الأنسجة من خلال موت الخلايا الكبير وعادة ما تفشل في تكرار الترابط الديناميكي للأنسجة4. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل الاختلافات الجينية والتشريحية بشكل كبير من الأهمية الفسيولوجية للنماذج الحيوانية4.
تعد الأجهزة على الرقائق (OoCs) ، أو الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة ، مجالا بحثيا واعدا في واجهة الهندسة والبيولوجيا والطب. هذه المنصات في المختبر هي الحد الأدنى من الوحدات الوظيفية التي تكرر السمات الصحية أو المرضية المحددة لنظيراتها في الجسم الحي 5. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الأنظمة المصغرة استضافة خلايا ومصفوفات متنوعة ومحاكاة التفاعلات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية بين الأنسجة المختلفة. لذلك ، فإن النظام الفسيولوجي الدقيق الذي يمكنه تلخيص المفصل الزليلي الأصلي بأمانة يعد بتقديم منصة فعالة لنمذجة أمراض المفاصل وتطوير DMOADs المحتملة.
يمكن عزل الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSCs) من العديد من الأنسجة في جميع أنحاء الجسم وتمييزها إلى سلالات عظمية المنشأ ، غضروفية ، وأديبوجينية6. تم استخدام MSCs بنجاح لهندسة الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية6 ، مما يعني أنها تمثل مصدرا واعدا للخلايا لهندسة مكونات الأنسجة في مفصل الركبة. لقد طورنا مؤخرا نظاما مصغرا يحاكي المفاصل ، يسمى miniJoint ، والذي يشتمل على أنسجة العظام والغضاريف والأنسجة الليفية والدهنية المشتقة من MSC7. على وجه الخصوص ، يتيح التصميم الجديد الحديث المتبادل للأنسجة عن طريق تدفق الموائع الدقيقة أو التغلغل (الشكل 1). هنا ، نقدم بروتوكولات تصنيع مكونات الرقاقة ، وهندسة مكونات الأنسجة ، وزراعة الأنسجة المهندسة في الرقاقة ، وجمع الأنسجة للتحليلات النهائية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لشريحة miniJoint يوضح ترتيب مكونات الأنسجة المختلفة والتدفقات المتوسطة. OC = الأنسجة العظمية الغضروفية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

يشكل ارتفاع معدل انتشار أمراض المفاصل المنهكة مثل هشاشة العظام (OA) عبئا اجتماعيا واقتصاديا كبيرا. حاليا ، الأدوية المتاحة التي تستهدف اضطرابات المفاصل هي في الغالب ملطفة. إن الحاجة غير الملباة إلى أدوية OA الفعالة المعدلة للمرض (DMOADs) ناتجة في المقام الأول عن عدم وجود نماذج مناسبة لدراسة آليات المرض واختبار DMOADs المحتملة. هنا ، نصف إنشاء نظام فسيولوجي دقيق يحاكي المفصل الزليلي المصغر (miniJoint) يتألف من مكونات الأنسجة الدهنية والليفية والعظمية الغضروفية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSCs). للحصول على الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) ، تم تغليف MSCs في الجيلاتين الميثكريليت القابل للربط الضوئي قبل أو بعد التمايز. ثم تم دمج تركيبات الأنسجة المحملة بالخلايا في مفاعل حيوي مطبوع 3D ، لتشكيل miniJoint. تم إدخال تدفقات منفصلة من الوسائط العظمية والليفية المنشأ والشحمية للحفاظ على الأنماط الظاهرية للأنسجة المعنية. تم اختراق تيار مشترك بشكل شائع من خلال الغضروف والأنسجة الزليلية والدهنية لتمكين تداخل الأنسجة. يسمح نمط التدفق هذا بتحريض الاضطرابات في واحد أو أكثر من مكونات الأنسجة للدراسات الآلية. علاوة على ذلك ، يمكن اختبار DMOADs المحتملة إما عن طريق "الإدارة الجهازية" من خلال جميع التيارات المتوسطة أو "الإدارة داخل المفصل" عن طريق إضافة الأدوية إلى تدفق محاكاة "السائل الزليلي" المشترك فقط. وبالتالي ، يمكن أن يكون miniJoint بمثابة منصة متعددة الاستخدامات في المختبر لدراسة آليات المرض بكفاءة واختبار الأدوية في الطب الشخصي.

تم جمع جميع أنسجة المفصل الصغير لتحليل أنماطها الظاهرية بعد 28 يوما من الثقافة في المفصل الصغير (الشكل 4 أ). تم تفصيل ذلك في منشورنا السابق7.
من خلال استخدام RT-qPCR ، والتلوين المناعي ، والتلوين النسيجي ، تم التأكيد على أن الأنماط الظاهرية الخاصة بال?...

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

نحن نقدم طرقا مفصلة لتوليد أربعة أنواع من الأنسجة من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية ، والتي تستخدم لتلخيص الغضروف والعظام ووسادة الدهون والغشاء الزليلي في مفصل الركبة البشري. يتم دمج هذه الأنسجة الأربعة في مفاعل حيوي مخصص وتوصيلها من خلال الموائع الدقيقة ، وبالتالي توليد مفصل الركبة على رقاقة.

إنشاء مفصل الركبة على رقاقة لنمذجة أمراض المفاصل واختبار الأدوية

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

إن قدرتنا على التنبؤ بدقة بكيفية استجابة البشر للأدوية أثناء التجارب السريرية محدودة بسبب عدم وجود نماذج قبل سريرية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. يمكن لهذا النظام الفيزيولوجي الدقيق معالجة هذا التفاوت. يحاكي هذا النظام المشتق من الخلايا البشرية بدقة طبيعة مرض المفاصل الكاملة لالتهاب المفاصل في الركبة البشرية ، مما يسمح باختبار أدوية هشاشة العظام المعدلة للمرض قبل التجارب السريرية ، مما قد يوفر ملايين الدولارات.ابدأ في تحضير الجيلاتين الميثاتكريليت ، أو GelMA ، بإضافة 17 جراما من الجيلاتين من النوع B إلى 500 مل من الماء المقطر. امزجه لمدة 30 دقيقة على شاكر عند 37 درجة مئوية وأضف 13 ملليلترا من أنهيدريد الميثاكريليك قبل الخلط طوال الليل على شاكر. في اليوم التالي ، قم بإعداد حوالي 60 ملليلتر من حصص GelMA في أكياس غسيل الكلى.ضع جميع أكياس غسيل الكلى في ماء مقطر بقضيب تقليب لمدة سبعة أيام. قم بتغيير الماء عدة مرات في اليوم واترك الأكياس عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم السابع ، صب GelMA في طبق وقم بتجميده عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل التجفيد.بعد ذلك ، قم بتجفيف GelMA بالتجميد عن طريق وضعه في غرفة التفريغ في مجفف التجميد. تأكد من التجفيف الكامل قبل الإزالة من مجفف التجميد. بعد ذلك ، قم بإذابة GelMA المجفف بالتجميد في محلول ملح Hanks المتوازن بتركيز 15٪ واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام كمية صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم.بناء على الحجم المكتسب ، استكمل المحلول بمضادات حيوية و 0.15٪ فوسفات فينيل فينيل الليثيوم ، أو LAP. احم محلول GelMA من الضوء وقم بتخزينه في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. الأوتوكلاف 3D طبع غرف المفاعل الحيوي ثنائي التدفق ، والأغطية ، وإدراج في أكياس الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع البخار.وبعد ذلك ، لمدة 20 دقيقة مع الحرارة الجافة. بعد التعقيم ، انقع غرف المفاعل الحيوي والأغطية والإدخالات في 15 ملليلترا من برنامج تلفزيوني معقم طوال الليل داخل خزانة السلامة الحيوية ، متبوعا بالتجفيف الكامل. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق 20 مرة 10 إلى الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم البشري السادس ، أو MSCs ، لكل خلية ملليلتر في محلول GelMA بنسبة 15٪.ثم اضغط على قالب سيليكون معقم وجاف على طبق بتري ، باستخدام قفازات معقمة. ضع ملحقا واحدا في كل فتحة من قالب السيليكون باستخدام ملقط بحيث يكون جانب فتحة الملحق متجها لأسفل. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف حوالي 50 ميكرولترا من تعليق الخلية لكل ملحق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.قم بربط الجل داخل الملحق عن طريق تعريض الجزء العلوي لمصباح يدوي للأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 395 نانومتر لمدة 1.5 دقيقة ، ثم إضاءة الجانب الآخر لمدة 30 ثانية. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل الإدخالات على الفور إلى ثمانية ملليلتر من وسط النمو في ستة ألواح بئر غير منسجية والسماح للخلايا بالتعافي بين عشية وضحاها. لبدء تمايز الأنسجة الدهنية ، انقل الحشوات إلى ثمانية ملليلتر من الوسط الدهني واستزرعها لمدة 28 يوما مع تغيير متوسط يومي.لهندسة وحدات العظم الغضروفي ، ضع الإدخالات في غرف مفاعل حيوي مزدوج التدفق ، وقم بتغطية الآبار ، وغرس التيارين بشكل منفصل بمعدل تدفق يبلغ خمسة ميكرولتر في الدقيقة مع 35 ملليلتر من الوسط العظمي و 35 ملليلتر من الوسط الغضروفي المنشأ. الحفاظ على الخلايا للتمايز لمدة 28 يوما عن طريق إجراء تغييرات حقنة كل أسبوعين مع الأنواع المتوسطة المعنية. لاشتقاق الخلايا الليفية ، قم بتمييز MSCs في ثقافة 2D في قارورة زراعة خلايا الأنسجة T 150 سم مربع تحتوي على 20 ملليلتر من الوسط الليفي لمدة 21 يوما.الحفاظ على التغيير الأسبوعي للوسيط. بعد 21 يوما ، استخدم أربعة ملليلتر من التربسين لفصل الخلايا. تغليف المواد الهلامية 3D داخل إدراج.للحصول على نسيج ليفي يشبه الزليلي ، أو SFT ، اتبع بروتوكولا مشابها. قم بتوصيل أنبوب السيليكون ، الذي يبلغ قطره الداخلي 0.062 بوصة وقطره الخارجي 0.125 بوصة ، بقضيب المفاعل الحيوي الصغير في أحد طرفيه وموصلات قفل الإغراء F 1/16 في الطرف الآخر. ثم ، الأوتوكلاف المفاعلات الحيوية الصغيرة 3D جنبا إلى جنب مع أنابيب السيليكون والأغطية.تحضير وتحميل 35 ملليلتر من الوسط لاستخدامها في الاستزراع المشترك الصغير في الخزانات المتوسطة. استخدم ملقط مستقيم لنقل وحدات العظم الغضروفي من المفاعل الحيوي ثنائي التدفق إلى البئر الأيمن للمفاعل الحيوي الصغير. نقل إدراج الأنسجة الدهنية وإدخال الأنسجة الليفية في الآبار اليسرى والوسطى ، على التوالي ، قبل تغطية جميع الآبار بأغطية معقمة.قم بتوصيل مداخل المشبك الصغيرة بالخزانات المتوسطة والمنافذ بالمحاقن. ثم قم بتركيب المحاقن على مضخة حقنة. نقل المضخة والرقائق إلى حاضنة.ضع الخزانات المتوسطة على الجليد خارج الحاضنة. قم بتشغيل المضخة في وضع السحب ، وسحب الوسط من الخزان المتوسط إلى غرفة المفاعل الحيوي الصغير. استمر في عملية الاستزراع المشتركة المصغرة هذه لمدة 28 يوما.لنمذجة التهاب المفاصل وتنكس الغضروف ، أضف إنترلوكين بيتا واحد إلى السلالة المتوسطة الليفية عند 10 نانوجرام لكل ملليلتر لمدة سبعة أيام. تأكد من استبدال المحقنة في اليوم الثالث قبل تقديم إنترلوكين واحد بيتا طازج إلى الوسط الليفي. لاختبار الدواء ، بعد ثلاثة أيام من العلاج بيتا واحد من إنترلوكين ، يتم إعطاء الدواء إما في الوسط المشترك ، أو محاكاة الإدارة داخل المفصل ، أو في جميع الأنواع المتوسطة ، ومحاكاة الإدارة الجهازية.بعد سبعة أيام من علاج إنترلوكين بيتا واحد ، اجمع الأنسجة الفردية للتحليل. بعد إزالة الحشوات باستخدام ملقط معقم ، ادفع لكمة خزعة عبر مركز الملحق لإزالة الجل ووضع الجل في برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، قم بقطع المواد الهلامية العظمية الغضروفية إلى النصف أثناء تقييم التعبير الجيني.جمع وطرد مركزي حوالي 1.5 ملليلتر من الوسائط من كل مصدر وسيط في 14،000 غرام لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من الرواسب ، قم بتجميد الوسائط المكيفة في النيتروجين السائل. بالنسبة للتلطيخ النسيجي والتلوين المناعي ، أولا ، قم بإصلاح الأنسجة الليفية العظمية الغضروفية والشبيهة بالزليلي ، أو عينات SFT ، في 10٪ من الفورمالين المخزن وتجفيفها في الإيثانول بتركيزات تصاعدية.امسح العينة في الزيلين ، وقم بتضمينها في البارافين ، وأخيرا ، قسم العينات إلى سمك ستة ميكرومتر. في حالة الأنسجة الدهنية ، قم بتلطيخ العينات الرسمية والثابتة المخزنة بنسبة 10٪ مباشرة ، بمحلول O الأحمر الزيتي أو BODIPY. تم الحفاظ على الأنماط الظاهرية الخاصة بالأنسجة بشكل جيد للأنسجة الدقيقة الفردية.تم جمع جميع أنسجة المفصل الصغير لتحليل أنماطها الظاهرية بعد 28 يوما من الثقافة. أعرب المكون العظمي للأنسجة الدقيقة لوحدات العظم الغضروفي عن مستويات عالية من أوستيوكالسين. في الجزء الغضروفي من العظم الغضروفي ، أعربت الأنسجة عن مستويات عالية بشكل ملحوظ من الكولاجين من النوع الثاني و aggrecan.كانت مستويات التعبير عن الجينات الدهنية التمثيلية ، الأديبونيكتين ، واللبتين أعلى في الأنسجة الدهنية. شوهد ترسب معادن الكالسيوم والفوسفاتيز القلوي وبروتين أوستيوكالسين في المقام الأول في حجم العظام للأنسجة الدقيقة العظمية الغضروفية. أظهر جانب الغضروف من الأنسجة العظمية الغضروفية الجليكوزامينوجليكان والكولاجين من النوع الثاني المحتفظ به جيدا.تم تنظيم التعبير عن العلامات المرتبطة بتضخم الخلايا الغضروفية ، الكولاجين من النوع 10 والقنفذ الهندي ، بشكل كبير بعد 28 يوما من الثقافة. تم العثور على ترسب قطرات الدهون وفيرة في الأنسجة الدهنية. أظهر التلوين المناعي تعبيرا قويا عن مادة التشحيم والكاديرين 11 بواسطة SFT بعد أربعة أسابيع من الثقافة.في نموذج المرض ، أدى علاج IL one beta إلى موت الخلايا المبرمج وارتفاع مستويات MMP-13 في SFT. تم علاج تدهور الغضروف بواسطة IL one beta ، مما يشير إلى حدوث تداخل بين الأنسجة العظمية الغضروفية و SFT. أظهرت الفعالية العلاجية للنابروكسين من خلال الإدارة الجهازية انخفاض تدهور الغضروف في IL واحد بيتا ميني joint.أشار تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي إلى أن الأدوية الأربعة المحتملة لتعديل هشاشة العظام عكست جزئيا فقدان الغضروف. تتضمن أهم خطوات هذا الإجراء الربط المتقاطع للمواد الهلامية في الإدخالات ووضع الإدخال في المفاعل الحيوي. تسمح الرقاقة بالتحقيق في مساهمة عوامل الخطر الأخرى المقدمة في هشاشة العظام ، مثل السمنة والإصابات الميكانيكية.ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة أمراض المفاصل الأخرى.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized على microfluidics لدراسة التفاعلات الاوعية الدموية الدقيقة في الأمراض الدموية

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

اختبار Microtensile التي تسيطر عليها بيئيا للميكانيكيا على التكيف nanocomposites والبوليمرات لل<em&gt; خارج الحي</em&gt; توصيف

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

المريض محددة النمذجة من القلب: تقدير توجهات الألياف البطيني

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

اختبار قابلية المضادات الحيوية الناجم عن الإجهاد على رقاقة

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

إنشاء نموذج يسببها جراحيا في الفئران المعنية بالتحقيق في دور وقائي من Progranulin في هشاشة العظام

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

تصنيع ميكروفلويديك من الألياف البوليمرية والحيوية مع الحجم والشكل المصمم مسبقا

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Oscillation and Reaction Board Techniques for Estimating Inertial Properties of a Below-knee Prosthesis

التذبذب والتفاعل المجلس تقنيات لتقدير خصائص بالقصور الذاتي من تعويضات تحت الركبة

The purpose of this study was two-fold: 1) demonstrate a technique that can be used to directly estimate the inertial properties of a below-knee ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

إنشاء نماذج القلب السيليكون المريض محددة مع تطبيقات في خطط ما قبل الجراحة والتدريب العملي على

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...