Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Denne forskning blev primært støttet af finansiering fra National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Derudover takker vi Dr. Paul Manner (University of Washington) for at levere de humane vævsprøver og Dr. Jian Tan for deres hjælp med at isolere MSC'erne og skabe cellepuljen.

Følgende protokol følger de etiske retningslinjer fra University of Pittsburgh og den menneskelige forskningsetiske komité ved University of Pittsburgh. Oplysninger om de materialer, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i materialetabellen.
1. Fremstilling af 3D-printede bioreaktorer
<ol><li>Brug en computersoftware til at designe osteochondral (figur 2A) og miniJoint bioreaktorer (figur 2B</str...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

I denne artikel præsenterer vi en protokol til oprettelse af et knæled-på-en-chip-system, hvor knogler, brusk, fedtvæv og synoviumlignende væv dannes fra MSC'er og dyrkes sammen i en tilpasset bioreaktor. Dette multikomponent, humane celleafledte system med plug-and-play-funktioner repræsenterer et nyt værktøj til at studere patogenesen af ledsygdomme og udvikle lægemidler. 
I betragtning af at forskellige væv favoriserer specifikke kulturmedier, er det afgørende at tilvejebringe de...

Fælles sygdomme som slidgigt (OA) er meget udbredt og invaliderende og repræsenterer en førende årsag til handicap på verdensplan1. Det anslås, at OA alene i USA påvirker 27 millioner patienter og forekommer hos 12,1% af voksne i alderen 60 år og derover2. Desværre er de fleste lægemidler, der i øjeblikket bruges til at håndtere ledsygdomme, palliative, og der findes ingen effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD'er)3. Dette uopfyldte medicinske behov skyldes primært, at der ikke findes en effektiv model til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og udvikling af potentielle DMOAD'er. Den konventionelle todimensionelle (2D) cellekultur afspejler ikke ledvævets 3D-natur, og kulturen af vævseksplanter hindres ofte af betydelig celledød og replikerer normalt ikke de dynamiske vævsforbindelser4. Derudover reducerer genetiske og anatomiske forskelle signifikant den fysiologiske relevans af dyremodeller4.
Organ-on-chips (OoC'er) eller mikrofysiologiske systemer er et lovende forskningsfelt i grænsefladen mellem teknik, biologi og medicin. Disse in vitro-platforme er minimale funktionelle enheder, der replikerer definerede sunde eller patologiske træk ved deres in vivo-modstykker 5. Desuden kan disse miniaturiserede systemer være vært for forskellige celler og matricer og simulere de biofysiske og biokemiske interaktioner mellem forskellige væv. Derfor lover et mikrofysiologisk system, der trofast kan rekapitulere det oprindelige synoviale led, at tilbyde en effektiv platform til modellering af ledsygdomme og udvikling af potentielle DMOAD'er.
Humane mesenkymale stamceller (MSC'er) kan isoleres fra mange væv i hele kroppen og differentieres til osteogene, kondrogene og adipogene slægter6. MSC'er er med succes blevet brugt til at konstruere forskellige væv, herunder knogle-, brusk- og fedtvæv6, hvilket betyder, at de repræsenterer en lovende cellekilde til konstruktion af knæleddets vævskomponenter. Vi har for nylig udviklet et mikrofysiologisk miniaturesystem, der efterligner leddene, kaldet miniJoint, der omfatter MSC-afledt knogle-, brusk-, fibrøst- og fedtvæv7. Især muliggør det nye design vævskrydstale ved mikrofluidisk strømning eller gennemtrængning (figur 1). Heri præsenterer vi protokollerne for fremstilling af chipkomponenterne, konstruktion af vævskomponenterne, kulturen af det manipulerede væv i chippen og indsamling af væv til downstream-analyser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over miniJoint-chippen, der viser arrangementet af de forskellige vævskomponenter og mediestrømme. OC = osteokondralt væv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

Den høje forekomst af invaliderende ledsygdomme som slidgigt (OA) udgør en høj socioøkonomisk byrde. I øjeblikket er de tilgængelige lægemidler, der er målrettet mod ledlidelser, for det meste palliative. Det uopfyldte behov for effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD'er) skyldes primært manglen på passende modeller til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og testning af potentielle DMOAD'er. Heri beskriver vi etableringen af et miniature synovialt led-efterlignende mikrofysiologisk system (miniJoint) bestående af fedt-, fibrøse og osteokondrale vævskomponenter afledt af humane mesenkymale stamceller (MSC'er). For at opnå de tredimensionelle (3D) mikrovæv blev MSC'er indkapslet i fototværbindende methacryleret gelatine før eller efter differentiering. De cellebelastede vævskonstruktioner blev derefter integreret i en 3D-printet bioreaktor, der dannede miniJoint. Separate strømme af osteogene, fibrogene og adipogene medier blev introduceret for at opretholde de respektive vævsfænotyper. En almindeligt delt strøm blev perfuseret gennem brusk, synoviale og fedtvæv for at muliggøre vævskrydstale. Dette strømningsmønster tillader induktion af forstyrrelser i en eller flere af vævskomponenterne til mekanistiske undersøgelser. Desuden kan potentielle DMOAD'er testes via enten "systemisk administration" gennem alle mediestrømme eller "intraartikulær administration" ved kun at tilføje lægemidlerne til det delte "synovialvæske"-simulerende flow. Således kan miniJoint fungere som en alsidig in vitro-platform til effektivt at studere sygdomsmekanismer og teste lægemidler i personlig medicin.

Alle væv i miniJoint blev indsamlet for at analysere deres fænotyper efter 28 dages kultur i miniJoint (figur 4A). Dette er blevet beskrevet i vores tidligere publikation7.
Gennem brug af RT-qPCR, immunfarvning og histologisk farvning blev det bekræftet, at de vævsspecifikke fænotyper var godt vedligeholdt for de enkelte mikrovæv (figur 4). For eksempel udtrykte den osseøse komponent i OC-mikrovævene (O...

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Vi leverer detaljerede metoder til generering af fire typer væv fra humane mesenkymale stamceller, som bruges til at rekapitulere brusk, knogle, fedtpude og synovium i det menneskelige knæled. Disse fire væv er integreret i en tilpasset bioreaktor og forbundet via mikrofluidik, hvilket genererer et knæled-på-en-chip.

Oprettelse af et knæled-på-en-chip til modellering af ledsygdomme og test af lægemidler

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

Vores evne til præcist at forudsige, hvordan mennesker reagerer på lægemidler under kliniske forsøg, er begrænset på grund af manglen på fysiologisk relevante prækliniske modeller. Dette mikrofysiologiske system kan afhjælpe denne forskel. Dette humane celleafledte system efterligner nøjagtigt hele ledsygdomskarakteren af slidgigt i det menneskelige knæ, hvilket gør det muligt at teste sygdomsmodificerende slidgigtmedicin forud for kliniske forsøg, hvilket potentielt sparer millioner af dollars.Begynd at forberede methacryleret gelatine eller GelMA ved at tilsætte 17 gram gelatine type B til 500 ml destilleret vand. Bland det i 30 minutter på en ryster ved 37 grader Celsius og tilsæt 13 ml methacrylsyreanhydrid, før det blandes natten over på en ryster. Den næste dag skal du forberede omkring 60 ml alikvoter af GelMA i dialyseposer.Læg alle dialyseposerne i destilleret vand med en omrøringsstang i syv dage. Skift vandet flere gange om dagen, og lad poserne stå ved fire grader Celsius natten over. På dag syv hældes GelMA i en skål og fryses ved minus 80 grader Celsius før frysetørringen.Derefter frysefryse GelMA ved at placere det i vakuumkammeret i en lyofilisator. Sørg for fuldstændig tørring inden fjernelse fra lyofilizeren. Derefter opløses den frysetørrede GelMA i Hanks' afbalancerede saltopløsning ved 15%koncentration og pH justeres til 7,4 ved hjælp af en lille mængde natriumhydroxid.Baseret på det erhvervede volumen suppleres opløsningen med antibiotikum antimykotisk og 0,15% lithiumphenylphosphinat eller LAP. Beskyt GelMA-opløsningen mod lys og opbevar den ved minus 20 grader Celsius indtil yderligere brug. Autoklave 3D-printede dobbeltstrøms bioreaktorkamre, låg og indsatser i autoklaveposer ved 121 grader Celsius i 20 minutter med damp.Og derefter i 20 minutter med tør varme. Efter sterilisering blødlægges bioreaktorkamrene, lågene og indsatserne i 15 ml steril PBS natten over inde i biosikkerhedsskabet efterfulgt af fuldstændig tørring. Brug en pipette på 1000 mikroliter til at resuspendere 20 gange 10 til de sjette humane knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller eller MSC'er pr. milliliter celler i en 15% GelMA-opløsning.Tryk derefter en steril, tør silikoneform mod en petriskål ved hjælp af sterile handsker. Sæt en indsats i hvert hul i silikoneformen med tang med hulsiden af indsatsen nedad. Når det er gjort, tilsættes ca. 50 mikroliter cellesuspension pr. indsats ved hjælp af en 200 mikroliter pipette.Krydsbind gelen inde i indsatsen ved at udsætte toppen for en 395 nanometer bølgelængde UV-lommelygte i 1,5 minutter og derefter belyse den anden side i 30 sekunder. Med sterile tang overføres straks indsatserne til otte ml vækstmedium i en ikke-vævskultur seks brøndplade og lad cellerne komme sig natten over. For at starte differentieringen af fedtvæv skal du overføre indsatserne til otte ml adipogent medium og dyrke dem i 28 dage med daglig mediumændring.For at konstruere osteokondrale enheder skal du placere indsatserne i dobbeltstrøms bioreaktorkamre, dække brøndene og infundere de to strømme separat med en strømningshastighed på fem mikroliter pr. Minut med 35 ml osteogent medium og 35 ml kondrogent medium. Oprethold cellerne til differentiering i 28 dage ved at udføre sprøjteskift hver anden uge med de respektive medietyper. For at udlede fibroblasterne differentieres MSC'erne i 2D-kultur i en T-150 kvadratcentimeter vævscellekulturkolbe indeholdende 20 ml fibrogent medium i 21 dage.Oprethold den ugentlige ændring af mediet. Efter 21 dage skal du bruge fire milliliter trypsin til at løsne cellerne. Indkapsling af 3D-gelerne i indsatserne.For at opnå synoviallignende fibrøst væv eller SFT skal du følge en lignende protokol. Tilslut silikoneslangen, der har en indvendig diameter på 0,062 tommer og en ydre diameter på 0,125 tommer, til minijoint bioreaktorstangen i den ene ende og F 1/16th lokkelåsestik i den anden ende. Autoklave derefter 3D minijoint bioreaktorerne sammen med silikoneslangen og lågene.Forbered og læg 35 ml medium, der skal bruges til minijointkulturen, i mediumreservoirerne. Brug lige tang til at overføre osteokondrale enheder fra dobbeltstrømsbioreaktoren til den højre brønd i minijoint bioreaktoren. Overfør fedtvævsindsatsen og fibrøst vævsindsats i henholdsvis venstre og midterste brønde, inden du dækker alle brønde med steriliserede låg.Tilslut minijoint-klipindløbene til mediereservoirerne og udløbene til sprøjter. Monter derefter sprøjterne på en sprøjtepumpe. Overfør pumpen og chipsene til en inkubator.Placer mediumreservoirerne på is uden for inkubatoren. Betjen pumpen i tilbagetrækningstilstand, og træk mediet fra mediumbeholderen ind i minijoint bioreaktorkammeret. Fortsæt denne minijoint kulturproces i 28 dage.For at modellere ledbetændelse og bruskdegeneration tilsættes interleukin en beta til den fibrogene mediumstamme ved 10 nanogram pr. milliliter i syv dage. Sørg for at udskifte sprøjten på den tredje dag, før du giver frisk interleukin en beta til det fibrogene medium. Til lægemiddeltestning, efter tre dages interleukin en betabehandling, administrere lægemidlet enten i det delte medium, simulere en intraartikulær administration eller i alle medietyper, der simulerer en systemisk administration.Efter syv dages interleukin en beta-behandling skal du indsamle individuelle væv til analysen. Når du har fjernet indsatserne ved hjælp af sterile pincet, skal du skubbe en biopsistans gennem midten af indsatsen for at fjerne gelen og placere gelen i PBS. Skær derefter osteochondralgelerne i halvdelen, mens du vurderer genekspressionen.Opsaml og centrifuger omkring 1,5 ml medier fra hver mediumkilde ved 14.000 G i 10 minutter. Efter kassering af sedimentet lynfryses det konditionerede medie i flydende nitrogen. Til histologisk farvning og immunfarvning skal du først fastgøre det osteochondrale og synoviallignende fibrøse væv eller SFT-prøver i 10% bufret formalin og dehydrere dem i ethanol med stigende koncentrationer.Ryd prøven i xylen, indlejr dem i paraffin, og til sidst sektioneres prøverne i seks mikrometer tykkelse. I tilfælde af fedtvæv farves de 10% bufferede formelle og faste prøver direkte med olierød O-opløsning eller BODIPY. De vævsspecifikke fænotyper var godt vedligeholdt for de enkelte mikrovæv.Alle væv i minijoint blev indsamlet for at analysere deres fænotyper efter 28 dages kultur. Den osseøse komponent i osteokondrale enheders mikrovæv udtrykte høje niveauer af osteocalcin. I bruskdelen af osteochondral udtrykte væv signifikant høje niveauer af kollagen type to og aggrecan.Ekspressionsniveauerne af repræsentative adipogene gener, adiponectin og leptin var højere i fedtvævet. Aflejringen af calciummineraler, alkalisk fosfatase og osteocalcinprotein sås primært i knoglestørrelsen i osteokondrale mikrovæv. Brusksiden af osteochondral væv viste godt bevaret glycosaminoglycan og kollagen type to.Ekspressionen af chondrocythypertrofiassocierede markører, kollagen type 10 og indisk pindsvin, blev signifikant nedreguleret efter 28 dages dyrkning. Rigelig lipiddråbeaflejring blev fundet i fedtvævet. Den immunfluorescerende farvning viste robust lubricin og cadherin 11 ekspression af SFT efter fire ugers dyrkning.I en sygdomsmodel resulterede IL en beta-behandling i celleapoptose og forhøjede MMP-13-niveauer i SFT. Brusknedbrydningen blev behandlet med IL one beta, hvilket tyder på forekomsten af krydstale mellem osteokondrale væv og SFT. Den terapeutiske effekt af naproxen gennem systemisk administration viste reduceret brusknedbrydning i IL et beta-miniled.PCR i realtid indikerede, at de fire potentielle sygdomsmodificerende slidgigtlægemidler delvist vendte brusktabet. De vigtigste trin i denne procedure omfatter tværbinding af gelerne i indsatserne og insertets placering i bioreaktoren. Chippen tillader undersøgelse af bidraget fra andre risikofaktorer, der tilbydes i slidgigt, såsom fedme og mekanisk skade.Det kan også bruges til at studere andre ledsygdomme.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Miljømæssigt-kontrolleret Microtensile Afprøvning af Mekanisk adaptive Polymer Nanokompositter for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karakterisering

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specifikke Modeling of the Heart: Estimering af Ventrikulære fiberorienteringer

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bestemmelse af transport Rate af Xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjælp af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelige placentaperfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Stress-induceret antibiotika modtagelighed Test på en chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Etablering af et kirurgisk induceret model i mus for at undersøge den beskyttende rolle i Progranulin i Slidgigt

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fremstilling af polymere og biohybridfibre med foruddefineret størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Oscillation and Reaction Board Techniques for Estimating Inertial Properties of a Below-knee Prosthesis

Svingning og Reaktion Board Teknikker til vurdering Inertisystemer Egenskaber af en under knæet protese

The purpose of this study was two-fold: 1) demonstrate a technique that can be used to directly estimate the inertial properties of a below-knee ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Oprettelse af patientspecifikke silikone hjertemodeller med applikationer i præ-kirurgiske planer og hands-on træning

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...